"黄连-木香-肉豆蔻"(Huanglian-Muxiang-Roudoukou,HMR)组方出自《小儿药证直诀》,能改善溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,UC)临床症状,采用网络药理学等方法研究其具体的生物学作用机制有助于更好地挖掘中医药资源,促进中药防治UC的现代化开发与应用.
通过基因表达综合数据库(geneexpressionomnibus,GEO)中的基因芯片分析结合网络药理学及分子对接方法探究HMR治疗UC的潜在分子机制.
采用GEO数据库获取UC芯片数据,运用R语言综合分析筛选出疾病差异表达基因,获得UC的疾病靶标数据库;利用中药系统药理学数据库与分析平台(traditionalChinesemedicinesystemspharmacologydatabaseandanalysisplatform,TCMSP)分别检索HMR的活性成分及其作用靶点;取疾病差异表达基因与药物作用靶点间的交集基因,通过Cytoscape3.9.1软件构建"中药-活性成分-疾病-靶点"网络和蛋白互作(protein-proteininteraction,PPI)网络并进行拓扑分析,以此筛选出主要活性成分及核心靶点;同时利用Metascapes数据库进行基因本体(geneontology,GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书通路(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes,KEGG)富集分析;最后使用AutoDockvina软件对主要活性成分和核心靶点进行分子对接.
共筛选得到UC差异表达基因967个,HMR活性成分29种,对应的靶点163个."中药-活性成分-疾病-靶点"网络中有活性成分24个,主要活性成分涉及槲皮素、豆甾醇、小檗碱、β-谷甾醇、巴马汀等;PPI网络中有蛋白26个,核心靶点涉及白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(interleukin-6,IL-6)、CC趋化因子配体2[chemokine(C-Cmotif)ligand2,CCL2]、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)、基质金属蛋白酶9(matrixmetallopeptidase9,MMP9)等;GO富集分析主要涉及脂多糖刺激变化等生物过程,质膜外侧面等细胞成分,细胞因子活性等分子功能;KEGG通路分析主要涉及TNF信号通路、核转录因子κB(nuclearfactorkappa-B,NF-κB)通路、Toll样受体(toll-likereceptor,TLR)信号通路等;运用分子对接模拟证实排名前5的主要活性成分与核心靶点之间均具有较强的结合活性.
HMR可能是通过槲皮素、豆甾醇及小檗碱等多成分,作用于IL-1β、IL-6、CCL2等多靶点,调节TNF信号通路、NF-κB信号通路、TLR信号通路等多条信号通路,从抗炎和调节肠道免疫等方面发挥对UC的治疗作用.
核心提要:本研究基于生物信息学与网络药理学方法研究中医经典组方"黄连-木香-肉豆蔻"治疗溃疡性结肠炎的分子机制,结果显示该组方治疗溃疡性结肠炎的作用机制可能与抑制炎症反应和调节肠道免疫功能有关.
Huanglian-Muxiang-Roudoukou(HMR)formulawasrecordedinthebookof"PediatricMedicinePrescription".Itcanimprovetheclinicalsymptomsofulcerativecolitis(UC).UsingnetworkpharmacologyandothermethodstostudyitsbiologicalmechanismishelpfultobetterexploretheresourcesoftraditionalChinesemedicineandpromotethemoderndevelopmentandapplicationoftraditionalChinesemedicineinthepreventionandtreatmentofUC.
ToexplorethepotentialmolecularmechanismofHMRinthetreatmentofUCbasedongeneexpressionomnibus(GEO)chipdatamining,networkpharmacology,andmoleculardockingtechnology.
TheGEOdatabasewasusedtoobtainUCgeneexpressiondata.Then,differentiallyexpressedgeneswereidentifiedusingRsoftware.TheactivecomponentsofMyristicaeSemen(Roudoukou),AucklandiaeRadix(Muxiang),andCoptidisRhizoma(Huanglian)weresearchedbyusingthetraditionalChinesemedicinesystemspharmacologydatabaseandanalysisplatform(TCMSP)database,andthecorrespondingtargetswereidentified.TheintersectionsofHMRandulcerativecolitisdiseasetargetswereobtained.The"drug-activeingredients-disease-target"networkandprotein-proteininteraction(PPI)networkwereconstructedtoscreenoutthecorecomponentsandtargetsusingCytoscape3.9.1software.Geneontology(GO)andKyotoencyclopediaofgenesandgenomes(KEGG)enrichmentanalyseswereperformedfortheintersectiontargetsbyMetascapesdatabase.MoleculardockingbetweenmainactivecomponentsandcoretargetswasperformedusingAutoDockvinasoftware.
Atotalof967differentialgeneswereidentified,andtherewere29activecomponentsand163activetargetsinUC.Therewere24activecomponentsinthe"drug-activeingredients-disease-target"network,includingquercetin,stigmasterol,berberine,beta-sitosterol,palmatine,andsoon.Therewere26proteinsinthePPInetwork,includinginterleukin-1β(IL-1β),interleukin-6(IL-6),C-Cmotifchemokine2(CCL2),tumornecrosisfactor(TNF),matrixmetallopeptidase9(MMP9),andsoon.GOenrichmentanalysisdemonstratedthattheintersectiontargetsweremainlyconcentratedinbiologicalprocessessuchaslipopolysaccharideresponse,incellularcomponentssuchasexternalsideofplasmamembrane,andinmolecularfunctionssuchascytokineactivity.KEGGanalysisdemonstratedthattheintersectiontargetsmainlyinvolvedtheTNFsignalpathway,nuclearfactorkappa-B(NF-κB)pathway,Toll-likereceptor(TLR)signalpathway,andsoon.TheresultsofmoleculardockingshowedthatthetopfivemainactivecomponentshadstrongbindingabilitywiththecoretargetsIL-1β,IL-6,CCL2,TNF,andMMP9.
HMRmayactontheexpressionofIL-1β,IL-6,CCL2,andotherproteinsthroughquercetin,stigmasterol,berberine,andotheractivecomponents,regulatetheTNFsignalingpathway,andplayaroleinthetreatmentofUCviamanymechanismssuchasanti-inflammatoryandintestinalimmunityregulation.
1.2.2"中药-活性成分-疾病-靶点"网络的建立:将筛选得到的药物靶点基因与疾病差异基因相互映射,得到交集基因,并查找与之相对应的有效成分,将搜集到的中药、活性成分、疾病、靶标蛋白中的基因依次输入,利用Cytoscape3.9.1软件进行可视化处理,构建"药物-活性成分-靶点"网络.
统计学处理采用R4.1.2软件进行数据统计分析,采用单因素方差分析组间差异,组间两两比较用最小显著性差异法,P<0.05为差异有统计学意义.
对接结果显示,槲皮素、豆甾醇、小檗碱、β-谷甾醇、巴马汀与关键靶点IL6、CCL2、TNF、IL-1β、MMP9的结合能均小于-5.0kcal·mol-1,说明活性成分与靶点之间具有较好结合活性,槲皮素与MMP9,β-谷甾醇与TNF的结合能小于9.0kcal·mol-1,说明两者之间具有强烈的结合活性.分子对接可视化分析研究发现,槲皮素通过氨基酸残基Q227、A242、R249与MMP9形成3条氢键,β-谷甾醇通过氨基酸残基TYR-119与TNF形成1条氢键,β-谷甾醇通过氨基酸残基GLY-44、PHE-96、PHE-98、TRP-47与MMP9形成4条氢键,并且上述配体化合物均能良好地包埋在受体靶蛋白的活性口袋中.
综上所述,HMR可能是通过槲皮素、豆甾醇及小檗碱等多成分,作用于IL-1β、IL-6、CCL2等多靶点,调节TNF信号通路、NF-κB信号通路、TLR信号通路等多种信号通路,从抗炎和调节肠道免疫等方面发挥对UC的治疗作用.本次分析结果表明HMR治疗UC的多成分、多靶点、多通路的作用机制,为今后临床应用和基础研究提供了一定的思路和参考.
溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,UC)是一种慢性非特异性炎症性肠病,常反复发作,缠绵难愈,多数需要终身用药维持.长期使用抗UC药物可引发药物不良反应.随着中医治疗的发展,越来越多的中药方剂在治疗UC上展现出了较好的疗效."黄连-木香-肉豆蔻"(Huanglian-Muxiang-Roudoukou,HMR)是众多名老中医治疗UC的常用组方,研究其抗UC机制有助于药物开发和推广.
探索HMR治疗UC的作用机制,以期为该组方的进一步研究与临床应用提供参考.
采用GEO数据库获取UC芯片数据,运用R语言综合分析筛选出疾病差异表达基因,获得UC的疾病靶标数据库;利用中药系统药理学数据库与分析平台(traditionalChinesemedicinesystemspharmacologydatabaseandanalysisplatform,TCMSP)分别检索HMR的活性成分及其作用靶点;取疾病差异表达基因与药物作用靶点间的交集基因,通过Cytoscape软件构建"中药-活性成分-疾病-靶点"网络和蛋白互作(protein-proteininteraction,PPI)网络并进行拓扑分析,以此筛选出主要活性成分及核心靶点;同时利用Metascapes数据库进行进行基因本体(geneontology,GO)功能分析及京都基因与基因组百科全书(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes,KEGG)通路;最后使用AutoDockvina软件对主要活性成分和核心靶点进行分子对接.
共筛选得到UC差异表达基因967个,HMR活性成分29种,对应的靶点163个."中药-活性成分-疾病-靶点"网络中有活性成分24个,主要活性成分涉及槲皮素、豆甾醇、小檗碱、β-谷甾醇、巴马汀等;蛋白互作网络中有蛋白26个,核心靶点涉及白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(interleukin-6,IL-6)、CC趋化因子配体2[chemokine(C-Cmotif)ligand2,CCL2]、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)、基质金属蛋白酶9(matrixmetallopeptidase9,MMP9)等;GO富集分析主要涉及脂多糖刺激变化等生物过程,质膜外侧面等细胞成分,细胞因子活性等分子功能;KEGG通路分析主要涉及TNF信号通路、核转录因子κB(nuclearfactorkappa-B,NF-κB)通路、Toll样受体(toll-likereceptor,TLR)信号通路等;运用分子对接模拟证实排名前5的主要活性成分与核心靶点之间均具有较强的结合活性.
通过生物信息学方法筛选及预测,HMR可能是通过槲皮素、豆甾醇及小檗碱等多成分,作用于IL-1β、IL-6、CCL2等多靶点,调节TNF信号通路、NF-κB信号通路、TLRs信号通路等多种信号通路,进而影响UC涉及的炎症、肠道免疫等多种方式,来发挥改善UC的作用.