20世纪90年代，荷兰的Mulder等在处理工业废水的反硝化流化床中发现了一种新型细菌——厌氧氨氧化细菌(anaerobicammoniaoxidationbacteria，AnAOB).该类细菌可以在缺氧条件下以亚硝酸盐为电子受体将氨氮转化为氮气.1999年，Strous等采用密度梯度离心法成功分离了AnAOB菌株，并通过16SrRNA基因测序，确认了AnAOB是浮霉状菌的成员.
与传统的硝化反硝化工艺相比，厌氧氨氧化(anaerobicammoniaoxidation，ANAMMOX)工艺具有无需外加碳源和供氧动力消耗，反应过程中CO2排放量少和剩余污泥产量少等优点.目前该工艺已经用于高氨氮工业废水的处理中，如污泥消化液、垃圾渗滤液和养猪场废水等.
AnAOB至今仍未获得人工的纯培养，而高通量测序技术的发展为鉴定环境中的微生物群落的多样性提供了有力的工具.本研究采用IlluminaHisepPE250测序平台对UBF厌氧氨氧化反应器内的微生物进行高通量测序，分析了ANAMMOX反应器内微生物的分布情况，以期为ANAMMOX反应器内微生物群落相对丰度及群落结构变化提供理论依据.
1材料与方法1.1实验装置
图1实验装置示意
1.2接种污泥和实验用水
反应器接种污泥来自广州市沥滘污水处理厂缺氧池，接种量为800mL.
实验采用模拟废水，主要成分为NH4Cl和NaNO2，其浓度按实验需要添加.其它成分为：NaHCO31000mg·L-1，MgSO4·7H2O473mg·L-1，CaCl2·2H2O180mg·L-1，KH2PO427mg·L-1，微量元素Ⅰ1mg·L-1和微量元素Ⅱ1mg·L-1.其中微量元素Ⅰ为：EDTA5000mg·L-1和FeSO4·7H2O5000mg·L-1.微量元素Ⅱ为：ZnSO4·7H2O430mg·L-1，GuSO5·5H2O240mg·L-1，MnCl2·4H2O990mg·L-1，NiCl2·6H2O190mg·L-1，CoCl2·6H2O24mg·L-1.进水pH值用盐酸调节为7.1~7.8.
1.3水样检测方法
氨氮：纳氏试剂分光光度法;亚硝氮：N-(1-萘基)-乙二胺光度法;硝氮：紫外分光光度法;总氮为氨氮、亚硝氮和硝氮之和;pH值采用pH计测定.
1.4微生物群落多样性检测方法1.4.1DNA提取
反应器运行至第54d时取下层污泥20mL(标记为CYR110，文中表示富集阶段)，此时污泥高度为19.6cm.第83d时分别取上层污泥(标记为CYR111)和下层污泥(标记为CYR112，文中表示稳定运行阶段)各20mL，此时污泥高度为24.4cm.下层污泥的取样口距离底部4.4cm，上层污泥的取样口距离底部20.7cm.采用Powersoil土壤DNA提取试剂盒提取基因组DNA.提取的DNA使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，使用Nanodrop检测DNA浓度.
1.4.2PCR扩增
采用16SrRNAV4区通用引物，引物序列为515F5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′和806R5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，扩增片段大小为300bp左右.采用PCR仪对细菌16SrRNA基因进行PCR扩增，扩增反应体系(60μL)为10xExTaqBuffer6μL，dNTP6μL，BSA0.6μL，ExTaq0.3μL，PrimerF1.2μL，PrimerR1.2μL，DNA1μL，ddH2O43.7μL.按照PCR反应条件(94℃5min，94℃30s，52℃30s，72℃45s，72℃10min)进行，31CyclesPCR完成后利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物.
1.4.3Illumina高通量测序
采用IlluminaHisepPE250测序平台对采集的样品进行高通量测序.
1.4.4数据处理分析方法
采用Origin7.5和AutoCAD2007软件绘制图，并采用SPSS19.0(IBMInc，USA)软件对数据进行分析.
2结果与讨论2.1反应器的脱氮性能
图2ANAMMOX反应器的脱氮性能
2.2ANAMMOX反应器微生物群落多样性研究2.2.1Alpha多样性指数分析
表1生物多样性分析
2.2.2门水平物种相对丰度分析
由图3可知，所测得的相对丰度大于等于1%的门隶属于14个门.其中，富集阶段反应器中的微生物主要以变形菌门Proteobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、绿弯菌门Chloroflexi、泉古菌门Crenarchaeota和广古菌门Euryarchaeota为主，稳定运行阶段反应器中的微生物主要以变形菌门Proteobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、绿弯菌门Chloroflexi和浮霉菌门Planctomycetes为主，反应器中的浮霉菌门和变形菌门有了明显的增加，分别由1.1%、27.9%增加到了26.4%、39.9%.而拟杆菌门、绿弯菌门、泉古菌门和广古菌门都明显减少.反应器上下层物种相对丰度有明显的差异.底部的浮霉菌门明显比上层多，而上层的拟杆菌门要比底部多.
图3门水平物种相对丰度分布
2.2.3科水平物种相对丰度分析
图4科水平物种相对丰度分布
2.2.4物种相对丰度热图分析
由图5可知，稳定运行阶段的下层污泥中的Brocadiaceae、噬纤维菌科Cytophagaceae、丛毛单胞菌科Comamonadaceae、SB1、黄单胞菌科Xanthomonadaceae、慢生根瘤菌科Bradyrhizobiaceae、A4b、Haliangiaceae、Cryomorphaceae、生丝微菌科Hyphomicrobiaceae群落相对丰度要比上层高，其中，上层污泥中的Brocadiaceae、噬纤维菌科Cytophagaceae、丛毛单胞菌科Comamonadaceae、SB1群落相对丰度要比富集阶段高.相反，富集阶段反应器中的热袍菌科Thermotogaceae、互营杆菌科Syntrophobacteraceae、Syntrophorhabdaceae、互营菌科Syntrophaceae、腐螺旋菌科Saprospiraceae、WSA2、甲烷丝状菌科Methanosaetaceae、甲烷杆菌科Methanobacteriaceae、厌氧蝇菌科Anaerolinaceae、暖蝇菌科Caldilineaceae、肉杆菌科Carnobacteriaceae群落相对丰度要比稳定运行阶段高.总体来看，富集阶段反应器内的微生物群落结构与稳定运行阶段相比相差很大，而稳定运行阶段反应器上下层的微生物群落结构也有较大的差异.Chen等研究表明ABR厌氧氨氧化反应器各隔室的微生物群落结构存在较大的差异,与本研究结果相符.
图5物种相对丰度聚类(科水平)
2.2.5脱氮细菌多样性分析
通过高通量的扩增子测序，共鉴定出门的细菌40种.其中，涉及到脱氮细菌的有变形菌门、浮霉菌门和硝化螺旋菌门3种，变形菌门丰度最高，与多数厌氧氨氧化反应器微生物群落分布情况相一致.
图63种氮素的比值变化
硝化螺旋菌门是测序得到的三大脱氮细菌门中所占比例最小的，在0.035%~0.188%之间，富集阶段的含量最高(0.188%).推测富集阶段的AOB将部分氨转化为亚硝酸盐，导致剩余亚硝酸盐的积累，而硝化螺旋菌门是亚硝化反应的主要微生物，因此含量高于稳定运行阶段.在硝化螺旋菌门中，共鉴定出2种属的细菌，分别为GOUTA19和Nitrospira，其中，Nitrospira为亚硝盐氧化细菌(NOB)，所占比例在0.023%~0.174%之间，富集阶段的含量最高(0.174%).推测富集阶段的AOB将部分氨转化为亚硝酸盐，导致剩余亚硝酸盐的积累，而NOB可将亚硝酸盐氧化为硝酸盐，因此含量高于稳定运行阶段.
3结论
(1)采用提高进水NH4+-N和NO2--N浓度的方式将ANAMMOX反应器的容积负荷由0.52kg·(m3·d)-1增大至2.75kg·(m3·d)-1，NH4+-N、NO2--N和TN的去除率分别从76.18%、53.47%、55.66%增大至94.04%、86.97%、82.96%，AnAOB成功富集.
(2)由Alpha多样性指数分析可知，反应器富集阶段的微生物群落相对丰度和群落多样性要高于稳定运行阶段，而在稳定运行阶段，反应器内的上层微生物群落相对丰度和群落多样性要高于下层.
(3)由门水平物种相对丰度分析可知，反应器中的浮霉菌门和变形菌门有明显的增加，其中，浮霉菌门的丰度增大最为显著.反应器底部的浮霉菌门明显比上层多，而上层的拟杆菌门要比底部多.由科水平物种相对丰度分析可知，反应器富集阶段以厌氧蝇菌科的相对丰度最高，为9.47%.稳定运行阶段Brocadiaceae的相对丰度最高，达到了24.57%，成为优势菌群.
(4)由物种相对丰度热图分析可知，富集阶段的微生物群落结构与稳定运行阶段相比相差很大，而稳定运行阶段反应器上下层微生物群落结构也有较大的差异.
(5)由测序结果可知，稳定运行阶段UBF厌氧氨氧化反应器中的脱氮细菌较为丰富，其中变形菌门、浮霉菌门和硝化螺旋菌门分别占39.9%、26.4%和0.188%.变形菌门中占据比例较高的是Dok59属、Thauera属、Thibacillus属和Thermomonas属.浮霉菌门主要包含Candidatusbrocadia.