王琪琪1，田界先2，潘宗东3，杜静1，辛健康1，张传博1*
1(贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳，550025)2(贵州千里苗疆农业开发有限公司，贵州凯里，556000)3(黔东南州农业科学院，贵州凯里，556000)
关键词IlluminaMiSeq；白酸汤；红酸汤；厌氧发酵；菌群差异性
酸汤是贵州黔东南苗族、侗族人民嗜食的传统发酵食品，包括白酸汤和红酸汤两种，成品红酸汤由辣椒红酸汤、番茄红酸汤分别发酵、混合而成。白酸汤的主要原材料有大米、糯米、玉米等，做法是将清米汤直接放置在密闭容器内，接种老酸汤，自然发酵。白酸汤具有开胃健脾、增进食欲、生津止渴、清热解暑、助消化等保健功效。白酸汤中添加蔬菜，煮制菜汤，是当地人的日常饮食习惯，当地有“三天不吃酸，走路打串串”之说。此外，白酸汤可加工成火锅底料、调味品、饮料等[1]。
红酸汤的主要原材料为番茄、辣椒。制作工艺可分为两个发酵阶段：一是番茄和辣椒分别发酵为半成品；二是将两者按一定的比例混合进行第2次发酵。第1个阶段决定了红酸汤的酸度，是红酸汤风味形成的关键阶段[2]。红酸汤、白酸汤可以作为底料配以蔬菜，牛肉、鲜鱼、排骨等制成酸汤火锅。酸汤中富含多种益生菌群和有机酸、矿物质等，有调节人体肠道微生态平衡、帮助消化、防止便秘、防止细胞老化、降低胆固醇以及调剂人体生理机能等保健作用[3]。
苗家酸汤含有一定量的酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和少量的丁二酸。富含丰富的矿物质，如钙、磷、铁等对保持神经、肌肉的兴奋性以及维持肌体的酸碱平衡具有重要的作用[4]。酸汤发酵中主要有乳酸杆菌、醋酸杆菌、双歧杆菌和酵母菌等多种微生物，发酵阶段的微生物是酸汤品质风味形成的重要因素。自然发酵的酸汤品质极不稳定[5]。
目前，对于酸汤的报道大多为单个白酸汤、辣椒红酸汤、番茄红酸汤的研究。如红酸汤的发酵工艺；主要营养成分和功能成分的分析研究[6]；苗族发酵型白酸汤的生产工艺研究；凯里白酸汤的工艺优化；苗族白酸汤饮料的开发；贵州红酸汤火锅调料的研究进展及工业化进程等。
白酸汤、辣椒红酸汤和番茄红酸汤，采自贵州千里苗疆农业开发有限公司的9个不同车间，采集样品后将其装入密封器皿中，低温运输至实验室，放于4℃短期存放，提取样品总DNA。
1.2.1试剂盒提取样品DNA
量取100mL白酸汤，100mL辣椒红酸汤和100mL番茄红酸汤，4000r/min离心5min后弃上清取沉淀，采用E.Z.N.A.?SoilDNAKit试剂盒，按照试剂盒操作说明书进行微生物总DNA提取。
1.2.2预洗处理的聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)法
称取2.0g已处理样品于10mL离心管内，按照PVP法提取样品总DNA[7]。
将2种方法提取的基因组DNA按比例混合，送至上海美吉生物医药科技有限公司测序，并根据测序得到的数据使用分析软件进行各项指标分析。
16SrRNA基因V3～V4区扩展引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′)[8-9]；ITS区引物为ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)[10]。PCR正式试验采用TransStartFastPfuDNAPolymerase，20μL反应体系为：5×FastPfuBuffer4μL，dNTPs(2.5mmol/L)2μL，正、反向引物(5μmol/L)各0.8μL，FastPfuPolymerase(2.5U/μL)0.4μL，BSA(0.8μg/μL)0.2μL，DNA10ng，ddH2O补至20μL。PCR反应程序：95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共32个循环；72℃延伸10min。PCR产物使用2%琼脂糖凝胶电泳检测，根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后，再用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收。
PCR产物使用2%琼脂糖凝胶电泳检测，根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后，再用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收。
参照电泳结果，将PCR产物用QuantiFLuorTM-ST蓝色荧光定量系统(PRomega公司)进行检测定量。参照沈馨等[11]方法,将同一样本的PCR产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrepDNAGelExtractionKit(AxygenBiosciences,UnionCity,CA,USA)进行回收产物纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用QuantusTMFluorometer(Promega,USA)对回收产物进行检测定量。使用NEXTFLEXRapidDNA-SeqKit进行建库，文库合格后，进行上机测序。
测序得到的原始数据(rawdata)存在一定比例的干扰，为了得到更加准确、可靠的信息分析结果，对原始数据进行拼接、过滤处理得到有效数据(cleandata)。基于有效数据采用Usearch软件进行OTUs(operationaltaxonomicunits)聚类和物种分析。根据OTUs聚类分析及各个分类水平下的物种比对结果，利用QIIME软件对每个OTU的代表序列进行多种多样性指数分析，基于分类学信息，在各个分类水平上进行群落结构的统计分析[12]。采用Sliva细菌数据库比对细菌得到的OTU代表序列,采用Unite真菌数据库比对真菌得到的OTU代表序列。进行物种注释分析，获得对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况。
同时，对OTUs进行Alpha多样性指数统计、Beta多样性、群落结构、群落热图等分析。从而得到样品内物种丰富度和均匀度等信息、不同样品或分组间的共有和特有OTUs信息以及Beta多样性指数组间差异分析等。
用Ace和Chao指数来评估菌群丰富度，Ace指数显示的细菌物种丰度为番茄红酸汤>辣椒红酸汤>白酸汤，真菌物种丰富度为辣椒红酸汤>白酸汤>番茄红酸汤；Chao指数显示的细菌物种丰富度为番茄红酸汤>辣椒红酸汤>白酸汤，真菌物种丰富度为辣椒红酸汤>白酸汤>番茄红酸汤(表1)。Shannon和Simpson指数评估群落多样性，Shannon指数指示的细菌群落多样性为番茄红酸汤>白酸汤>辣椒红酸汤，真菌群落多样性为辣椒红酸汤>番茄红酸汤>白酸汤；Simpson指数指示的细菌群落多样性表现为番茄红酸汤>白酸汤>辣椒红酸汤，真菌群落多样性表现为辣椒红酸汤>番茄红酸汤>白酸汤(表1)。上述8组数据显示,红酸汤的细菌群落多样性>白酸汤，红酸汤的真菌群落多样性>白酸汤。
表1OTU聚类与多样性分析Table1clusteranddiversityanalysisofOTU
样品OTU数目Ace指数Chao指数Shannon指数Simpson指数白酸汤2930.63±16.9822.00±10.431.30±0.330.34±0.188965.87±30.1054.39±25.400.46±0.360.83±0.38辣椒红酸汤120119.02±13.94105.51±15.151.07±0.130.59±0.0612790.64±40.6599.37±47.931.34±0.580.37±0.17番茄红酸汤136123.58±54.67118.49±52.541.82±0.790.24±0.114536.09±16.5736.25±16.530.73±0.320.61±0.26
为了评价微生物β多样性，对传统厌氧发酵的白酸汤、辣椒红酸汤、番茄红酸汤进行种水平上的样本层级聚类分析，主要反映了发酵过程中细菌和真菌群落结构的总体差异。两样品越接近，它们之间的种就越相似，根据距离远近进行分析，白酸汤、辣椒红酸汤、番茄红酸汤细菌菌群明显的分为3个簇，呈鲜明的差异性(图1-a)，白酸汤、辣椒红酸汤和番茄红酸汤真菌菌群具有明显的差异性，但是辣椒红酸汤和番茄红酸汤没有明显的差异性(图1-b)。
a-细菌层级聚类;b-真菌层级聚类图1样本种水平上的层级聚类Fig.1Hierarchicalclusteringanalysisatthespecieslevelofsample注：BST为白酸汤；HSTC为辣椒红酸汤；HSTL为番茄红酸汤(下同)
白酸汤、辣椒红酸汤和番茄红酸汤通过测序共获得173个细菌OTUs(图2-a)。其中白酸汤特有细菌菌种1个；辣椒红酸汤特有菌种32个；番茄红酸汤特有菌种49个。白酸汤，辣椒红酸汤和番茄红酸汤共有菌种21个；白酸汤和辣椒红酸汤共有菌种3个；白酸汤和番茄红酸汤共有菌种2个；辣椒红酸汤和番茄红酸汤共有菌种50个。
白酸汤、辣椒红酸汤和番茄红酸汤通过测序共获得99个真菌OTUs(图2-b)。白酸汤特有菌种13个；辣椒红酸汤特有菌种41个；番茄红酸汤特有菌种有2个。白酸汤，辣椒红酸汤和番茄红酸汤共有菌种13个；白酸汤和辣椒红酸汤共有菌种21个;白酸汤和番茄红酸汤共有菌种2个；辣椒红酸汤和番茄红酸汤共有菌种7个。
a-细菌Venn图;b-真菌Venn图图2样品种水平Venn图Fig.2VENNanalyiesatthespecieslevelofsample
2.4.1门和属水平上群落结构组分分析
经统计分析表明，白酸汤细菌检测到4个门(Phylum)，分别为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)。分别为微小杆菌属(Exiguobacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、葡萄醋酸杆菌属(Gluconacetobacter)等19个属(Genus)，30个OTUs；真菌有4个门(Phylum)、分别为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)等。39个属(Genus)，分别为青霉属(Penicillium)、篮状菌属(Talaromyces)、Nigrospora、Meyerozyma、链格孢属(Alternaria)等89个OTUs。
辣椒红酸汤细菌检测到9个细菌门(Phylum)，分别为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)等。71个属，分别为普雷沃氏菌属(Prevotella)、布氏杆菌属(Bryobacter)、葡萄糖醋酸杆菌(Gluconacetobacter)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、酸丙酸杆菌(Acidipropionibacterium)等，120个OTUs；真菌有4个门(Phylum)，分别为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)等。60个属，分别为篮状菌属(Talaromyces)、酵母属(Saccharomyces)、Cyberlindnera、Meyerozyma、Cystofilobasidium、链格孢属(Alternaria)等，127个OTUs。
番茄红酸汤检测到8个细菌门(Phylum)，分别为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)等。88个属，分别为Sinomicrobium、拟杆菌属(Bacteroides)、嗜热菌属(Anoxybacillus)、Rosenbergiella、海细菌属(Marinobacterium)、Dysgonomonas、海杆菌属(Marinobacter)等，136个OTUs；真菌有4个门(Phylum)分别为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、丝孢菌门(Mortierellomycota)等。26个属，分别为Hanseniaspora、Saitozyma、毕赤酵母属(Pichia)、哈萨克斯坦酵母属(Kazachstania)、双足囊菌属(Dipodascus)，Plectosphaerella，假丝酵母(Candida)等，45个OTUs。
2.4.2种水平上群落结构组分分析
白酸汤在种水平的优势真菌分别为88.31%膜璞毕赤酵母(Pichiamembranifaciens)、6.39%博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、2.86%未分类的子囊菌门(unclassified_p_Ascomycota)、0.95%地丝双足囊菌(Dipodascusgeotrichum)；辣椒红酸汤在种水平上的优势真菌为74.36%Kazachstaniahumilis、19.02%酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、2.13%地丝双足囊菌(D.geotrichum)、0.96%unclassified_p_Ascomycota、0.84%膜璞毕赤酵母(P.membranifaciens)；番茄红酸汤在种水平上的优势真菌为99.17%K.humilis、0.32%膜璞毕赤酵母(P.membranifaciens)(图3-b)。
a-细菌的组成情况;b-真菌的组成情况图3样品种水平上的组成情况Fig.3Compositionatthespecieslevelofsample
通过对白酸汤、辣椒红酸汤和番茄红酸汤丰度排名前35的物种进行热图分析，反映白酸汤、辣椒红酸汤和番茄红酸汤在属水平上群落组成的相似性和差异性。白酸汤、辣椒红酸汤和番茄红酸汤细菌在属水平丰度不同，但主要分布在变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)5个门中。白酸汤优势菌属为葡萄糖醋酸杆菌属(Gluconacetobacter)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)等；辣椒红酸汤优势菌属为片球菌属(Pediococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、魏斯氏属(Weissella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、奈瑟菌属(Neisseria)等；番茄红酸汤优势菌属为假单胞菌属(Pseudomonas)、青枯菌属(Ralstonia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)等(图4-a)。
白酸汤、辣椒红酸汤和番茄红酸汤真菌在属水平丰度不同，但主要分布在子囊菌门(Ascomycota)、毛霉亚门(Mucoromycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)、担子菌门(Basidiomycota)4个门中。白酸汤的优势菌属为毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、双足囊菌属(Dipodascus)、青霉菌属(Penicillium)；辣椒红酸汤的优势菌属为分子孢子菌属(Cladosporium)、Kodamaea、针壳孢属(Septoria)等；番茄红酸汤的优势菌属为Kazachstania、毕赤酵母属(Pichia)、双足囊菌属(Dipodascus)、小囊菌属(Microascus)(图4-b)。
a-细菌相对丰度热图;b-真菌相对丰度热图图4样本属水平上的相对丰度热图Fig.4Relativeabundanceheatmapatthegenuslevelofsample
白酸汤、辣椒红酸汤和番茄红酸汤的第一优势菌属均为乳酸菌属(Lactobacillus)，第二优势菌属为醋酸杆菌属(Acetobacter)、葡萄糖醋酸杆菌属(Gluconacetobacter)、双球菌属(Pediococcus)、norank_o_Chloroplast，且在辣椒红酸汤和番茄红酸汤中的平均丰度比白酸汤中高(图5-a)。
白酸汤的优势真菌菌属为毕赤酵母属(Pichia)和假丝酵母属(Candida)。辣椒红酸汤和番茄红酸汤的优势菌属为哈萨克斯坦酵母属(Kazachstania)、酵母属(Saccharomyces)。白酸汤、辣椒红酸汤和番茄红酸汤的共有菌属为未分类的子囊菌门(unclassified_p_Ascomycota)、双足囊菌属(Dipodascus)，且unclassified_p_Ascomycota在白酸汤、辣椒红酸汤和番茄红酸汤中的平均丰度依次为74%、25%、1.0%；Dipodascus在白酸汤、辣椒红酸汤和番茄红酸汤中的平均丰度依次为29%、65%、6.3%(图5-b)。
a-细菌Circos图;b-真菌Circos图图5样本在属水平上的Circos图Fig.5Circosatthegenuslevelofsample
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KeywordsIlluminaMiSeq;whitesoursoup;redsoursoup;anaerobicfermentation;variationofmicroflora
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.023081
引用格式:王琪琪，田界先，潘宗东，等.基于IlluminaMiSeq分析贵州凯里酸汤独特风味的优势菌群[J].食品与发酵工业,2020,46(14):40-47.WANGQiqi,TIANJiexian,PANZongdong,etal.AnalysisofdominantmicrofloraassociatedwiththeuniqueflavorofGuizhouKailisoursoupusingIlluminaMiSeqsequencing[J].FoodandFermentationIndustries,2020,46(14):40-47.
第一作者：硕士研究生(张传博教授为通讯作者，E-mail：zhangchuanbo2004@163.com)