一致性聚类鉴定两种不同的胰腺导管腺癌免疫亚型
洪叶枫1*，王凤娇1，王帅帅1，张文忠2#
1青岛大学医学部，山东青岛
2青岛大学附属医院心血管内科，山东青岛
收稿日期：2023年6月6日；录用日期：2023年7月1日；发布日期：2023年7月7日
摘要
关键词
胰腺导管腺癌，免疫亚型，一致性聚类，单细胞测序
IdentificationofTwoDistinctImmuneSubtypeofPancreaticDuctalAdenocarcinomabyConsensusClustering
YefengHong1*,FengjiaoWang1,ShuaishuaiWang1,WenzhongZhang2#
1MedicalCollege,QingdaoUniversity,QingdaoShandong
2DepartmentofCardiovascularMedicine,TheAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,QingdaoShandong
Received:Jun.6th,2023;accepted:Jul.1st,2023;published:Jul.7th,2023
ABSTRACT
Keywords:PancreaticDuctalAdenocarcinoma,ImmuneSubtype,ConsensusCluster,SingleCellSequencing
ThisworkislicensedundertheCreativeCommonsAttributionInternationalLicense(CCBY4.0).
1.背景
胰腺导管腺癌是胰腺最常见的恶性肿瘤，发病率与死亡率几乎相等[1][2]。据全球癌症统计报道，2022年胰腺癌新发病例在所有肿瘤中排第七位，而死亡病例在所有肿瘤中位列第三[1]。预计至2030年左右，胰腺癌将超过胃癌，结直肠癌成为肿瘤导致死亡的第二大主要原因。由于早期症状不明显且缺乏有效的早期诊断指标，大约80%的病人在确诊时已发生了远处转移[3]。吉西他滨对延长进展期胰腺癌病人生存期作用有限[4]。因此寻找新的治疗方法对改善胰腺癌预后十分重要。
近几年来，以免疫检查点抑制剂为代表的免疫治疗在结直肠癌，胃癌及黑色素瘤治疗取得重大突破[5]。然而，由于胰腺癌免疫细胞丰度较低和免疫抑制的肿瘤微环境，免疫治疗在胰腺癌的疗效十分有限[6]。由于肿瘤组织内部的抑制性，不同病人对免疫治疗的应答也不相同[7]。因此，建立胰腺癌免疫亚型对改善胰腺癌病人预后，精准诊疗及提高免疫治疗疗效十分重要。
本研究通过一致性聚类方法，基于免疫微环境评分的结果，对145例胰腺癌患者重新分组。随后，通过对两组胰腺癌患者的差异分析，功能富集分析，蛋白互作网络分析来寻找调控胰腺肿瘤微环境的关键基因。为区分不同胰腺癌免疫亚型提供了理论支持，同时也为开发胰腺癌免疫治疗新靶点提出了新思路。
2.材料与方法
从GEO数据库GSE71729芯片获取了145例胰腺癌患者(GSM1844109-GSM1844245)的转录组测序数据。转录组数据标准化采用每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments(FPKM)的方法。
2.2.免疫亚型
2.3.差异分析
利用lmFit函数进行多元线性回归，进一步使用eBays函数进行计算t统计量，通过对标准误差的经验贝叶斯节制来计算差异表达的对数，最终获得每个基因的差异显著性。
2.4.富集分析
将从KEGGrestAPI下载了京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG)通路富集分析基因注释作为背景，将帅选出差异基因映射至背景合集中，使用clusetrprofilerR包进行富集分析。最小基因设定为5，最大基因集设定为5000。p<0.05且FDR<0.25认为有统计学意义。
2.5.蛋白互作网络
本研究运用cytoscape中的cytohubba插件进行分析，本研究跟根据连接度Degree进行排序，筛选Degree前30的基因作为本研究的hub基因。
2.6.单细胞测序
我们使用“seurat”R包进行对16例胰腺导管腺癌患者单细胞测序数据进行质控过滤，检测到基因数小于400，超过6000，线粒体比例超过15%的细胞被移除。随后，我们采用Findvirablefeatures函数，选取vst方法，挑选前1500高变基因进行下游分析。运用主成分分析方法对1500个高变基因进行降维。采用tsne对主成分分析结果进一步降维。用“singleR”R包进行注释。使用seuratR包注释细胞类型。
3.结果
3.1.免疫亚型鉴定
Figure1.IdentificationofthePDACimmunesubtype
3.2.差异分析
Figure2.Volcanomapfordifferentialexpressedanalysisofdifferentimmunesubtypes
3.3.功能富集分析
3.4.蛋白–蛋白互作网络分析
3.5.单细胞测序检测hub基因表达
Figure3.KEGGenrichmentanalysis
Figure4.Protein-proteininteractionnetwork
(a)(b)(c)
Figure5.Single-cellsequencingfordetectionofhubgeneexpression.(a):Top1500highlyvariablegenes.(b):ClassifycellpopulationsusingthetSENalgorithm.(c):HubGenedensitymap
4.讨论
CSF1与外周血单核细胞向肿瘤微环境的迁移有关。与CSF1R结合后，CSF1促进单核细胞向巨噬细胞分化，并向促瘤的M2巨噬细胞表型发展[10]。有研究表明，在胰腺癌小鼠模型中，靶向CSF1/CSF1R轴可以重塑肿瘤微环境，提高胰腺癌小鼠对免疫检查点抑制剂的敏感性[11]。然而，一项II期临床研究表明，CSF1R阻断并不能改善晚期PDAC患者对吉西他滨的敏感性(NCT03336216)。CSF1R阻断主要是抑制巨噬细胞的极化，促进细胞毒性T细胞的浸润，增加免疫检查点如PD-L1和CTLA4的表达[11]。因此，CSF1抑制剂提高胰腺癌病人对免疫治疗敏感程度仍需进一步评估。同时，有报道称CSF1表达水平可以预测非小细胞肺癌的免疫疗法的疗效[12]。CSF1预测胰腺癌免疫治疗疗效的能力仍需评估。
本研究不足之处在于所有数据均来自公共数据库，完整的临床数据难以获得，无法评估肿瘤微环境与生存，预后，肿瘤分型及各项生化指标的关系。
总之，我们通过建立胰腺导管腺癌的免疫亚型以及之后的转录组学，单细胞转录组学分析，初步探索了不同胰腺癌免疫亚型的分子调节机制。基于蛋白互作网络和单细胞测序分析，我们鉴定了30个调控肿瘤细胞与免疫，纤维细胞互作的hub基因，可能成为治疗胰腺癌的潜在靶点。