本文引用：叶坤,雷敏,谢欣,郑晖,陈敏,余曙光.基于网络药理学与分子对接技术探讨黄芪建中汤治疗腹泻型肠易激综合征的作用机制研究.中国全科医学[J],2022,25(15):1814-1824doi:10.12114/j.issn.1007-9572.2022.02.014
YEKun,LEIMin,XIEXin,ZHENGHui,CHENMin,YUShuguang.MechanismofHuangqiJianzhongDecoctioninTreatingDiarrheaPredominantIrritableBowelSyndromeBasedonNetworkPharmacologyandMolecularDockingTechnology.ChineseGeneralPractice[J],2022,25(15):1814-1824doi:10.12114/j.issn.1007-9572.2022.02.014
1资料与方法1.1黄芪建中汤有效活性成分与作用靶点的搜集与筛选
1.2IBS-D的靶点获取
1.3绘制"药物-活性成分-靶点"网络图
对疾病靶点和药物靶点利用R语言中的Venn程序进行映射取交集，绘制韦恩图；使用Cytoscape3.8.1软件[23]绘制"药物-活性成分-靶点"网络图，利用内置工具NetworkAnalyzer分析网络的拓扑参数，依据节点连接度值（degree）筛选核心活性成分。
1.4构建黄芪建中汤治疗IBS-D靶点的蛋白相互作用（PPI）网络
1.5基因本体论（GO）功能和京都基因和基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析
1.6分子对接验证
2结果2.1黄芪建中汤活性成分与作用靶点
以OB≥30%，DL≥0.18为标准检索TCMSP数据库，筛选得到142种活性成分，其中甘草88个、大枣19个、黄芪17个、白芍8个、桂枝6个、生姜4个，饴糖未在TCMSP数据库中检索到活性成分，通过查阅文献补充葡萄糖、糊精、麦芽糖3个化合物，均未满足筛选标准，故删除。其中共有活性成分11个，删除活性成分中的重复项和不能在Uniprot数据库找到officialsymbol的活性成分后，最终得到123个活性成分，选取共有活性成分11个进行展示，见表1。在TCMSP数据库中选取"RelatedTargets"模块，获得247个黄芪建中汤活性成分对应的靶点。
Figure1
Figure1Venndiagramofdrug-IBS-Dintersectedtargets
2.3"药材-活性成分-靶点网络图"的分析
利用Cytoscape对180个交集靶点进行"药材-活性成分-靶点"网络图的绘制，该网络有306个节点，其中6个药材节点、121个化合物节点、180个靶点节点，2396条边，见图2。根据NetworkAnalyzer计算网络中的拓扑参数，筛选中心度值、紧密中心度值、节点连接度值较大的节点，这些节点在整个网络中起到枢纽的作用，可能是关键的化合物或者靶点[32]。每个靶点平均与12.53个化合物相互作用，每个化合物平均与14.94个靶点相互作用，体现了中药多成分与多靶点共同作用的整体性和联系性的特点[33]。通过筛选得出前8名的活性成分：槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、异鼠李素、刺芒柄花素、豆甾醇、毛蕊异黄酮、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇度值，除7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇只为黄芪活性成分外，其余均为共有活性成分，见表2。依据节点连接度值（degree）调节网络中靶基因的面积大小，由图2可知PTGS2、HSP90AA1、雌激素受体1（ESR1）、PPARG、AR、NOS2、PTGS1、NCOA2、PRSS1、SCN5A、CDK2等靶基因度值较大。
Figure2
Figure2Networkofherbals-activeingredients-targets
2.4黄芪建中汤治疗IBS-D潜在作用靶点互作网络构建与分析
基于String数据库获取黄芪建中汤治疗IBS-D靶点间的互作信息，下载TSV文件，导入Cytoscape3.8.1进行可视化及分析，得到PPI网络，见图3A，该网络包括180个节点、3762条边，通过NetworkAnalyzer分析，得到紧密中心度值平均值为0.543096779、节点连接度值平均值为41.8、中心度值平均值约为0.0049，以节点连接度值≥83.6、中心度值≥0.00992为条件进行筛选，得到核心网络（图3B）。依据PPI网络图，度值排名前10位的核心靶标为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、细胞肿瘤抗原p53（TP53）、肿瘤坏死因子（TNF）、白介素（IL）-6、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）、IL-1B、表皮生长因子受体（EGFR）、连环蛋白β1（CTNNB1）、转录因子AP-1（JUN）、ESR1，见表3。
Figure3
Figure3PPInetworkofpotentialtargetsofHuangqiJianzhongDecoctionintreatmentofIBS-D
2.5GO功能和KEGG信号通路富集分析
GO功能富集分析中BP分析获得2376个条目，前3条为responsetoinorganicsubstance（对无机物质的反应）、responsetolipopolysaccharide（对脂多糖的反应）、responsetoxenobiticstimulus（对异种刺激的反应）；CC分析获得115个条目，前3条为membraneraft（膜筏）、plasmamembraneproteincomplex（质膜蛋白复合物）、apicalpartofcell（细胞顶端）；MF分析获得194个条目，前3条为transcriptionfactorbinding（转录因子结合）、proteinkinasebinding（蛋白激酶结合）、proteindomainspecificbinding（蛋白质结构域特异性结合）；选取BP、CC、MF分析中最为显著的20个过程绘制GO功能分析图，见图4。KEGG信号通路富集分析共获得352条信号通路，选取最为显著的20个过程绘制KEGG信号通路富集分析图，见图5。使用Cytoscape3.8.1绘制"药物-活性成分-靶点-疾病-信号通路"图，见图6。
Figure4
Figure4GOenrichmentanalysisofpotentialtargetsofHuangqiJianzhongDecoctionintreatmentofIBS-D
Figure5
Figure5EnrichmentanalysisofKEGGsignalpathwayofpotentialtargetofHuangqiJianzhongDecoctionintreatmentofIBS-D
Figure6
Figure6Networkofdrug-activeingredients-keytarget-IBS-D-signalingpathway
2.6分子对接
利用AutoDock软件将"活性成分-靶点"网络图中度值最高的8个活性成分（槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、异鼠李素、刺芒柄花素、豆甾醇、毛蕊异黄酮、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇）与PPI网络图中8个核心蛋白（AKT1、TP53、TNF、IL-6、CASP3、IL-1B、EGFR、CTNNB1）进行分子对接。配体和受体结合能越低，结合越稳定，两者结合能≤-5.0kcal/mol说明两者可以结合，≤-7.0kcal/mol说明有较好的结合能力[34]。结果表明8个核心蛋白和8个活性成分结合能均≤-6.0kcal/mol，见表4。将对接结果导入PyMOL软件进行视觉优化，输出三维图，部分活性成分和蛋白分子对接图见图7。
Figure7
Figure7PartoftheactiveingredientsandproteinmoleculardockingdiagramofHuangqiJianzhongDecoctioninthetreatmentofIBS-D
3讨论
通过PPI网络图，筛选得出黄芪建中汤治疗IBS-D的关键靶点有AKT1、TP53、TNF、IL-6、IL-1B等，体现出中药治疗的多靶点特点。AKT1作为AKT的亚型，参与代谢、生殖、细胞存活、生长以及血管生成等在内的多种生物学过程，AKT是治疗IBS的主要焦点分子，而AKT1作为AKT的同源基因，推测其应与IBS有密切联系[50,51]。TP53作为一种常见的突变基因，与早发性癌症的易感性有密切关系，但目前尚无研究表明其与IBS-D的发生有联系[52]。关于IBS的发病机制，近年发现低度炎症和免疫激活在一定程度上参与了该病的发生、发展[53,54]。TNF-α、IL-6、IL-1B为促炎因子，有研究显示采用慢性束缚联合番泻叶灌胃法建造的小鼠模型相较空白对照组血清、结肠TNF-α、IL-6、IL-1B均增高，表明痛泻药方可降低结肠组织TNF-α、IL-6、IL-1B表达，抑制炎症，治疗IBS-D[55,56]。
根据分子对接结果，核心蛋白与核心活性成分的结合能均≤-6kcal/mol，表示黄芪建中汤核心化合物与核心受体蛋白稳定结合，可起到治疗IBS-D的作用，其中AKT1、EGFR与活性成分对接结果较好，提示AKT1、EGFR可能与IBS-D有一定联系，但目前关于这2个靶点与IBS-D的关联研究极少。
本研究利用网络药理学探讨黄芪建中汤治疗IBS-D的机制，验证了中药复方多途径、多靶点、协调治疗疾病的过程。黄芪建中汤可能通过活性成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、异鼠李素、刺芒柄花素、豆甾醇、毛蕊异黄酮、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇与AKT1、TP53、TNF、IL-6、CASP3、IL-1B、EGFR、CTNNB1等蛋白相结合，进一步调节MAPK、NF-κB、cAMP、雌激素等信号通路，从而增强肠屏障功能、降低内脏敏感、减少炎性反应、调节肠道菌群，治疗IBS-D。
本文无利益冲突。
本文表格略
参考文献略
基于网络药理学与分子对接技术探讨黄芪建中汤治疗腹泻型肠易激综合征的作用机制研究