基于网络药理学和分子对接技术探讨糖网明目颗粒治疗糖尿病视网膜病变的作用机制

将中药、药物有效成分、核心靶点文件导入Cytoscape3.6.0软件构建中药-活性成分-核心靶点网络图。

基因本体论（GO）是注释基因及其表达产物的常用方法。使用R-4.1.1，导入作用靶点，引用“Stringr”“tidyr”“ggpubr”等程序包，设定阈值P≤0.05筛选具有显著性差异的生物过程，并可视化GO富集分析结果。

京都基因与基因组百科全书（KEGG）可对药物作用靶点或差异表达基因进行信号通路分析。将作用靶点导入R-4.1.1，运用“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”等程序包进行KEGG通路富集分析，设定阈值P≤0.05筛选具有显著性差异的可靠靶点通路。

糖网明目颗粒，实验使用该药浸膏粉，3.5g生药/g，由北京红太阳药业有限公司提供，溶于无菌超纯水中配制成300mg/mL的母液。

人视网膜母细胞瘤细胞株Y79购自北纳生物河南省工业微生物菌种工程技术研究中心（BNCC341293）。

RPMI-1640培养基，胎牛血清（FBS），青链霉素混合液购于美国Gibco公司；CCK8试剂盒，5×蛋白上样缓冲液购于北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒和SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司；表皮生长因子受体（EGFR，货号：0407-21）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）14（货号：R1308-3）购于杭州华安生物技术有限公司；Tubulin（货号：AC007）购于武汉爱博泰克生物科技有限公司。

CO2恒温培养箱（HF240，力康生物医疗科技控股有限公司）、电泳仪（PowerPACTMHC，美国Bio-Rad公司）；AmershanImager600凝胶成像系统（日本GE公司）等。

Y79细胞在RPMI-1640培养基（10%胎牛血清、1%青链霉素混合液）中，于37℃、5%CO2的培养箱中培养。待培养瓶中细胞融合至80%~90%时，可进行传代培养。

将Y79细胞以3×104个/孔的细胞密度，接种于96孔板中培养12h。加入不同浓度的糖网明目颗粒（0.2、0.4、0.8、1.0mg/mL）干预24h。利用CCK8试剂盒测定细胞的生存率以探究糖网明目颗粒是否对该细胞具有毒性作用。

细胞造模：在6孔板中均匀接种生长良好的Y79细胞，按5×105个/mL细胞密度加入2mL完全培养基，每孔加入25mmol/L高糖培养液培养12h建立高糖损伤模型。细胞分组：正常对照组（NG组），高糖模型组（HG组），等渗对照组（DS组），0.4mg/mL糖网明目颗粒干预高糖组（HG-TWMMG组），0.2mg/mL糖网明目颗粒干预高糖组（HG-TWMML组）。去掉原高糖培养液，各组中加入含药培养基或空白对照培养基，培养48h。

药物干预48h后，提取细胞蛋白并利用BCA试剂盒测定各样品蛋白浓度，稀释配平变性后进行Westernblot实验。细胞蛋白上样量为10μg/孔；电泳转膜完成后封闭2h，按照蛋白分子量裁取条带，一抗孵育过夜。第2天洗膜进行二抗孵育1.5h，洗膜。AI600凝胶成像系统曝光，统计条带灰度值。目的蛋白相对表达量为蛋白灰度值/内参灰度值/正常组，采用SPSS25.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

分子对接结果表明，糖网明目颗粒中木犀草素、金合欢素等活性成分与EGFR、BMP2、MAPK1、MAPK14等靶点具有良好的结合作用，能够与氨基酸形成较强的氢键相互作用。该结果进一步验证了网络药理学筛选结果，表明糖网明目颗粒治疗DR的主要作用机制在于木犀草素、金合欢素、表儿茶素等活性成分通过EGFR、BMP2、MAPK1、MAPK14等靶点对肿瘤坏死因子、FoxO等信号通路进行调控，从而参与DR的治疗过程。