本发明涉及免疫学、分子生物学及临床医学检测领域，具体地说，涉及特异性过敏原ige的检测方法。
背景技术：
由于免疫学的进展，1975年首度有学者提出，以融合瘤技术制造只针对单一抗原反应的单一种抗体，称之为单抗(monoclonalantibody)。1980年后，单抗因为蛋白质新药的发展而积极发展，再加上抗原结合位点(antigen-bindingsites)概念被加入人源抗体igg的fc片段以后，显著的降低了单抗分子的大小，也增加了单抗药物的实用性。之后在生技界以及制药界，无不想尽办法找是否有更合适的分子，比单抗的更小更稳定的分子，并且能专一性结合在目标物上，如单链变异区段(singechainvariablefreagment)。1989年，hamers-casterman等偶然发现单峰骆驼血液中有半数的抗体是重链抗体(heavy-chainantibodies,hcabs)，它是一种缺失了轻链的重链二聚体抗体。1997年，ghahroudi等利用噬菌体展示技术获得骆驼重链可变区片段(variabledomainofheavychainofheavy-chainantibody,vhh)基因库，经多轮淘选后得到了只含有一个结构域的最小单元抗原结合蛋白片段，被称为单域抗体(single-domainantibodies,sdabs)。
微量化的免疫检测，现在主流以蛋白质生物芯片以及荧光微粒检测为主。因为方法学上的不同，“反应速率”以荧光微粒检测的反应快均质性高，检测方法以流式细胞仪相同概念进行同时多颗粒荧光标记的判读，占有一定的速度优势。在“多目标检测”上，因为蛋白质芯片是同时在一个固态表面如玻璃或者是硝化纤维膜上，可以根据检测目标项目的总数，进行较大规模的增加，只要在操作许可范围以及检测灵敏度许可范围下，蛋白质芯片在同时检测项目上，占有绝对的优势。但是两个系统在、反应稳定性、反应速率上的研究，一直有各自的进展。
在蛋白质芯片的反应速率上，临床样本通常是以液态形式参与免疫检测反应，这些样本包括了血清、血浆、唾液、尿液等各式体液。在液态的反应系统内，如果反应用的抗体或抗原固定于固态表面，则抗体抗原本身的碰撞机率，决定了反应完成的速度。无论多抗或者是单抗，因为抗体本身的大小，在反应速率上会有一定的限制，如果使用较小的蛋白质或多肽链来取代抗体，则有可能提高反应的速率，达成医疗检测时对于反应速度的需求。另外，在液态系统的主要反应速率决定因子在于温度、反应分子相对浓度、反应物的分子大小、反应物间的亲和力、反应物之间的空间障碍等。在蛋白质芯片系统中，除了改善抗体或小分子蛋白的分子大小之外，在液态系统中如果可以提升反应温度、增加反应分子的相对浓度，克服分子间的立体空间障碍，极可能提升反应速率，甚至于同时提高灵敏度以及特异性。
国际上针对抗ige的单域抗体，已经多有研究。但针对ige检测方面，尚未进行深入的研究和开发。
技术实现要素：
本发明的目的是解决目前单抗或多抗在微量免疫检测上的缺点，提供用于检测特异性过敏原ige的单域结合蛋白。
本发明的另一目的是提供利用所述单域结合蛋白检测特异性过敏原ige的方法，以取代蛋白质芯片惯用的多抗或单抗，提升其反应速率、灵敏度及专一性。
为了实现本发明目的，本发明提供用于检测特异性过敏原ige的单域结合蛋白，所述单域结合蛋白选自e02a2、e03b1、e04a1或e05a2，它们的氨基酸序列分别如seqidno:1-4所示，或seqidno:1-4所示序列c端去掉6个his标签形成的序列。
本发明还提供用于检测特异性过敏原ige的单域结合蛋白组合，所述组合为单域结合蛋白e02a2、e03b1、e04a1或e05a2中的至少两种组合。
本发明还提供含有所述单域结合蛋白或其组合的用于检测特异性过敏原ige的检测试剂、试剂盒或芯片。
优选地，所述单域结合蛋白是经过荧光物质(如cy3)标记的单域结合蛋白。
本发明所述单域结合蛋白单独或组合使用的以下任一种应用：
1)特异性过敏原ige的蛋白质芯片检测中的应用；
2)制备特异性过敏原ige检测试剂中的应用；
3)特异性过敏原igeelisa免疫分析检测中的应用；
4)制备特异性过敏原ige的胶体金检测试纸条中的应用。
本发明还提供特异性过敏原ige的检测方法，所述检测是指基于蛋白质芯片的微量免疫检测。
包括以下步骤：
(1)将过敏原蛋白质固定于固相载体(如玻片)表面；
(2)将待测血样或ige标准品进行适当浓度稀释后，直接与固相载体表面上的过敏原蛋白质进行抗体抗原反应；
优选地，步骤(1)具体为：先将过敏原原料以无菌水清洗，洗净后的过敏原原料浸泡于抑菌溶液(包括但不限于0.01％nan3或0.05％proclin300的磷酸生理盐水缓冲液)中，再将过敏原原料从抑菌溶液中取出干燥后，进行均质化处理，然后冷冻干燥得到过敏原原料粉末；然后，依照各类过敏原不同的特性，与不同的萃取缓冲液混合均匀，再将混合液依次用液氮和加热方法急速地冷冻与解冻，使得过敏原自细胞组织内释放至混合液中；混合液经离心，收集上清过敏原溶液，将上清转移至透析袋中进行透析；经透析后的过敏原溶液，调整至适当浓度后，点制于固相载体表面，经酪蛋白缓冲液(如1％酪蛋白磷酸缓冲液，caseinphosphatebuffer,ph7.5)封闭后，干燥即得包被有过敏原蛋白质的固相载体。
优选地，步骤(3)中反应完成后，清洗反应产物，再向反应产物中加入e02a2和e04a1两种预先经过荧光标记的所述单域结合蛋白，与黏附在固相载体表面过敏原蛋白质上的ige进行反应。
本发明方法适用于所述血样(包括血清、血浆或全血)中特异性过敏原ige的定性或定量检测。
在蛋白质芯片应用于临床时，通常使用多抗或者是单抗，抗体上面标记特定荧光物质或酶，用于示踪反应结果。当其针对的目标物留存于蛋白质芯片上时，抗体会与目标物结合。当操作者以特定光学仪器读取信号时，标记于抗体上面的荧光物质会产生信号，或者酶与加入显色的反应底物(substrate)产生冷光信号，操作者读取信号强度得以了解抗体反应的强度，进而知悉检测目标物的多寡，是一种定量检测反应。其中抗体的亲和性强弱、抗体本身是否可以到达目标物的结合位置、以及反应系统的均质性，都会影响最终的信号结果。本发明中以单域结合蛋白，取代多抗及单抗的角色，担任反应结果示踪的抗体。
在本发明中，提供了数个应用于蛋白质芯片的单域结合蛋白氨基酸序列、其荧光物质的标记方法以及使用的方式。这些单域结合蛋白与蛋白质芯片组成的试剂套组，和原始由单抗和蛋白质芯片组成的套组进行比较，可以发现在反应速率、灵敏度以及专一性上，都有显著的提升。
在本发明中，提供一种蛋白质芯片的制作过程。这种蛋白质芯片可应用于临床医学检测或者是动物检测，针对多样品的过敏原检测，是将纯化过的过敏原蛋白，经过特定的固定方式将过敏原蛋白黏着于玻璃材质的试片上。检测的对象样本是血清、血浆或者是全血，其中的针对过敏原有特异性反应的ige(specificige,sige)是主要的检测对象。将样本与蛋白质芯片上的过敏原反应后，sige会黏附于各过敏原蛋白上，再以本发明所提的其中一个或数个单域抗体与黏附在芯片过敏原上的sige进行反应后，即可以雷射扫描仪读取单域抗体上标记的荧光强度。荧光可以反映出受检样本内，是否有针对特定过敏原有反应的sige，并且荧光强度可以推测出受检人sige的多寡，间接了解受检者过敏的严重程度，是一种临床医学上的定量检测。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
附图说明
图1为本发明实施例3中过敏原蛋白质芯片及点制示意图。其中包括6种过敏原以及30种过敏原的两种蛋白质芯片样式。
图2为本发明实施例3中过敏原蛋白质芯片以特定卡匣固定示意图。其中，①-防渗漏弹性胶垫；②-点制完成封闭后的蛋白质芯片；③-卡匣上盖；④-卡匣下盖；⑤-血清反应槽体；⑥-组装完成图。
图3为本发明实施例4中单域结合蛋白与过敏原蛋白质芯片的单独性能测试结果。
图4为本发明实施例5中单域结合蛋白分组混合性能测试结果。
图5为本发明实施例5中单域结合蛋白分组混合性能测试，测定血清经过稀释2,4,8,16倍，其反应信号与对照组比对结果。其中，mab*2：单抗*cy3，500倍稀释浓度；sbp：单域结合蛋白-cy3产物(包含e03b1、e04a1；测试时，e03b1、e04a1为1000倍稀释浓度)；猫皮屑、花生、虾、蟹为mediwiss测定＞6级，芽枝霉菌4.5级，链格孢霉3.7级，鸡蛋白3.3级，蚌3.1级。
图6为本发明实施例6中单域结合蛋白反应缩时实验结果。其中，mab*2：单抗*cy3，500倍稀释浓度；sbp：单域结合蛋白-cy3产物(包含e03b1、e04a1；测试时，e03b1、e04a1为1000倍稀释浓度)；猫皮屑、花生、虾、蟹为mediwiss测定＞6级，芽枝霉菌4.5级，链格孢霉3.7级，鸡蛋白3.3级，蚌3.1级。
图3-图6中，荧光强度为平均值。
具体实施方式
本发明的单域抗体是一种特定序列的蛋白质，此类蛋白质可以针对特定抗原标的物进行反应，此反应可以取代现有常用的单抗或多抗，在临床或动物检验加以应用。在本发明的实施例中，此类蛋白质经过数据库搜寻、克隆方式设计、最后利用大肠杆菌大量表现出蛋白质，经过纯化后，进行荧光物质的标记，最后可应用于检测中。
实施例1抗人类ige单域结合蛋白的设计与克隆
设计完成后，将氨基酸序列逆向翻译为dna序列，并委托进行商业化dna序列合成。合成完的dna，使用pet22plasmid为载体(pet22,为merckmillipore公司novagen系列商标产品)，送入大肠杆菌e.colirosettagamib(merckmillipore公司novagen系列商标产品)进行表达。利用iptg诱导表现出来的蛋白质皆直接可溶，可利用超音波震荡法浆菌体打破，再利用histag管柱进行纯化。经过纯化后的蛋白即目标单域结合蛋白，其特性与数据库所可以找到的单域抗体表现出来相似。本发明中经过测试的单域蛋白e02a2、e03b1、e04a1或e05a2，它们的氨基酸序列分别如seqidno:1-4所示。
实施例2单域结合蛋白的荧光物标记
纯化完成的每个单域结合蛋白，利用vivaspin6离心浓缩管，在4℃下以1000g离心，浓缩至大于1mg/ml的浓度。以cy3mono-reactivedyepack(ge,amershambiosciences公司产品)或类似的荧光标记套组加以标记。依照标记套组的说明标记阶段完成后，可利用pd-10管柱(ge,amershambiosciences公司产品)进行中产物的纯化分离。对照组采用抗ige单抗(购自biocheck公司，antihumanigemab#70188)，也进行同样步骤的标记。将标记完成的单域结合蛋白-cy3产物，与对照所用的单抗-cy3产物，分别稀释1000倍备用。
实施例3过敏原蛋白质芯片的制作
1、过敏原的提取纯化与制作
过敏原(allergen，又称为变应原、过敏物、致敏原、致敏物)是指能引起过敏的物质。严格地说，过敏原是一种能促进在特应性个体发生第一型过敏反应的非寄生抗原。这些会引起过敏的物质，依照入侵人体的途径，大致上分为吸入性、食入性、侵入性及接触性几大类。常见的吸入性过敏原包含：动物皮毛、毛屑，花粉、霉菌、尘螨、昆虫；食入性的包含常见肉类、豆类、谷类、坚果类、奶蛋类、蔬菜水果等各类食物外，还包含药物。侵入性过敏原包含昆虫类、节肢动物类的毒液。
取得过敏原原料后，先将过敏原原料以无菌水清洗，去除外部脏污(如血液、黏液、土壤等)，以避免污染物影响后续的过敏原萃取。将洗净后的过敏原原料，浸泡于抑菌溶液中(0.01％nan3或0.05％proclin300的磷酸生理盐水缓冲液)，以降低过敏原原料中的微生物含量，以利于后续过敏原萃取和储存时的稳定性。再将过敏原原料从抑菌溶液中取出并初步风干或干燥后，依照过敏原原料特性将体积较大者分成数个以上不等的较小部位，进行搅拌、研磨、打浆等均质化步骤。经均质化的过敏原原料，以冷冻干燥法移除其内所含的水分，增加过敏原的保存期间。
取冷冻干燥后的过敏原原料粉末，依照各类过敏原不同的性质，与不同的萃取缓冲液混合均匀，再将混合液以液态氮气和加热培养箱急速地冷冻与解冻，迫使过敏原自细胞组织内释放至混合液中。将混合液经离心将过敏原溶液与不溶物分层，将上方的过敏原溶液移至透析膜中，根据透析膜的半通透特性，针对过敏原进行浓缩与缓冲液置换步骤。经透析后的过敏原样品溶液，在调整至1mg/ml等适当浓度后，即可使用于过敏原蛋白质芯片制作的原料。
过敏原的详细制作方法可参见，例如eschre.allergensourcematerialsandqualitycontrolofallergenicextracts.methods1997；13:2；或slaterje,eschre.preparationandstandardizationofallergenextracts.in:allergy:principlesandpractice,8thed,adkinsonnf,bochnerbs,burksw,etal(eds),mosby,philadelphia2014.p.470；或griertj.laboratorymethodsforallergenextractanalysisandqualitycontrol.clinicalreviewsinallergyandimmunology2011；21:111-140。
2、过敏原蛋白质生物芯片的制备
将人类ige标准品以2.5,5,10ug/ml的浓度，(低[l]、中[m]、高[h])的浓度，以磷酸缓冲生理盐水(phosphatebuffersaline,pbs)稀释，做为特异性过敏原ige反应的对照组。将实施例3步骤1中制作完成的过敏原，加入已添加表面活性剂剂(<0.1％,tween20或tritonx100)的点片磷酸生理盐水缓冲液，调整至适当浓度(<1mg/ml)。将这些浓度调整完成的过敏原以及对照组，同时点在slideglassb(schott公司的系列产品)的玻片上。每个过敏原及对照组点制三次重复，每个点的大小约为350um。点制完成后，以1％酪蛋白磷酸缓冲液(caseinphosphatebuffer,ph7.5)封闭。为方便后续检验使用，封闭完成的过敏原蛋白质芯片，需要放进超低湿干燥箱进行干燥24小时以上，并以特定卡匣加以固定，封入已经有干燥剂的铝箔袋内，储存备用。
表1蛋白质芯片与allerggyscreen临床比对表
注：tp,阳性；fp,假阳性；fn,假阴性；tn,阴性。
阳性一致百分比＝tp/(tp+fn)×100％
阴性一致百分比＝tn/(fp+tn)×100％
总一致百分比＝(tp+tn)/(tp+fp+fn+tn)×100％
经比较，粉尘螨、猫皮屑、虾、蟹、鸡蛋白这五个过敏原，其阳性一致率皆大于90％，信赖区间约为90～99.6％之间。特异性ige的分析灵敏度(analyticalsensitivity,检测限)约在3.5iu/ml，约等于0.84ng/ml。荧光强度(fluorescenceintensity)信号有效范围200～65535，有效检测范围3.5iu/ml～100iu/ml。
表2过敏原名称代码对照表
实施例4单域结合蛋白于过敏原蛋白质芯片的性能测试
将实施例2中的单域结合蛋白-cy3标记产物，分成两组，分别为第一组e02a2,e03b1两个单域结合蛋白产物，以及第二组e04a1,e05a2，分别独立加入性能测试，并且与对照组加以比对。
性能测试的方法是将实施例3制备完成的过敏原蛋白质生物芯片取出，加入测试用血清ab-e15477，于37℃反应30分钟后，然后以吐温-磷酸生理食盐缓冲液(phosphatebuffersaline–1％tween,pbst)进行冲洗6次。冲洗完成后将各组单域结合蛋白-cy3，以及对照组单抗-cy3加入反应，经37℃反应30分钟后，再以pbst清洗六次，拆卸芯片外卡匣后，以高纯氮气吹干芯片，1小时内以“晶芯luxscan10k”微数组芯片扫描仪(北京博奥晶典生物技术)扫描芯片上的信号，观察血清中各过敏原样品所得的数值，数值的计算必须扣除反应背景值。结果(图3)明确显示，单一独立的各个单域结合蛋白的信号，显然都略差于单抗的信号数值。但是明显地，各信号数值呈一定比例，并未有个别过大差异的状况存在。
实施例5单域结合蛋白分组混合性能测试
理论上推测，可能因为单抗的分子比单域结合蛋白大，而且约为14～16倍。不同的单抗若要结合上ige的不同特定区段时，彼此之间的fc段或其他结构区域，可能会互相干扰或影响，导致两个抗体无法同时对一个ige进行结合反应。但是在单域结合蛋白的组合上，这样的状况似乎轻微许多，所以不同序列的单域结合蛋白，可以在不干扰彼此的状况下，同时结合到ige特定的结合区域上。该结果大大提升了有效信号，在血清样本稀释2倍、4倍、8倍、16倍时，有效提升了检测极限(图5)，实际临床应用中，可有效提高检测灵敏度。
结果显示，样本稀释8倍以上时，芽枝霉菌、链格孢霉、鸡蛋白、蚌以mab进行检测难以区分信号，但混合的单域结合蛋白(e03b1、e04a1)仍可以保持可信信号，依8倍、16倍稀释浓度比例下降信号，信号之间具有鉴别率，说明最低检测极限可以向下发展，显然提高了检测灵敏度。
实施例6单域结合蛋白反应缩时实验
本方法如同传统的酶联免疫法中的一步法(onestepelisa)，是将所有液态系统内所有可能的反应物，一次性的加到反应系统中。如果反应物是一对抗体抗原，其分子量差异并不大，其结果可能会不如预期。本试验结果(图6)明显可以看到单抗对照组在仅反应10分钟的状况下，其反应几乎连一半都尚未完成。但是在60分钟后，比较实施例4结果，显然在单抗cy3产物上不适合这样的反应模式。但是在单域结合蛋白cy3的反应测试上，在30分钟以后，反应强度就已经接近了实施例5的结果(图5)，60分钟后信号会再提高，但是比例不多。结果显示，对照组在反应30分钟时，芽枝霉菌、链格孢霉、鸡蛋白、蚌等低级数过敏原几乎没有明确的信号，但同时sbp组已明确接近了图5实验结果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对的做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。