本发明涉及一种肝脏慢性疾病的诊断靶标，特别是涉及全血microrna标志物作为原发性肝细胞癌、肝硬化、慢性乙型肝炎诊断靶标的应用。
背景技术：
原发性肝癌主要包括肝细胞癌(hcc)、胆管癌和肝血管瘤。作为癌症死亡率第三的恶性肿瘤，肝细胞癌占原发性肝癌的83％。世界范围内，肝细胞癌发病率为恶性肿瘤中的第五位，而在中国为第一位。在临床实践中，肝细胞癌总生存率较低的主要原因是诊断滞后和误诊、鉴别诊断尤其是直径小于3cm的小肝癌的鉴别诊断标志物的缺乏以及准确性较高的非侵入性诊断标志物的缺乏，由此常导致最佳治疗窗的错失和不良预后。肝硬化是肝细胞癌的重要风险因子，而慢性乙型肝炎是肝硬化发生的重要诱因。目前临床上肝癌主要的非侵入性诊断指标即为血清afp水平及超声检查。然而越来越多的研究表明afp诊断的准确性和敏感性不尽人意且不能作为独立的诊断标志物，而超声检查难以鉴别诊断肝硬化的良性结节与肝细胞癌的恶性病灶。因此，在肝癌高危人群(肝硬化及慢性乙型肝炎病例)和肝癌病例中鉴别出新的有效敏感的非侵入性诊断指标对肝癌的防治具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供88-microrna标签组作为肝脏慢性疾病辅助诊断指标的应用。
本发明的另一目的在于提供定量全血88-microrna表达量的试剂组在制备肝脏慢性疾病辅助诊断试剂中的应用。
本发明的再一目的在于提供定量全血88-microrna表达量的试剂组在制备区分正常、慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌4种情况的试剂中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
进一步的，所述肝脏慢性疾病为肝癌、肝硬化、慢性乙型肝炎。
进一步的，所述肝癌为原发性肝细胞癌。
定量全血microrna表达量的试剂组在制备肝脏慢性疾病辅助诊断试剂中的应用，其中，定量全血microrna表达量的试剂组由定量上述88个全血microrna的试剂组成。
进一步的，所述定量上述88个全血microrna的试剂中含有检测上述88个全血microrna的探针，探针序列如seqidno：1～88所示。
进一步的，肝脏慢性疾病为肝癌、肝硬化、慢性乙型肝炎。
定量全血microrna表达量的试剂组在制备区分正常、慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌4种情况的试剂中的应用，其中，定量全血microrna表达量的试剂组由定量上述88个全血microrna的试剂组成。
本发明的有益效果是：
1)本发明88-microrna分子标签可以很好的区分正常、慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌四种人群。
2)在本发明213例全血样本中，本发明88-microrna分子标签诊断肝癌的灵敏度和准确性分别是100％和99.3％，与之相对照的，afp的灵敏度和准确性分别是73.4％和86.8％。
3)在17例肝癌直径小于3厘米的患者中，本发明88-microrna分子标签诊断小肝癌的正确率是100％，与之相对照的，afp的正确率只有64.7％。
附图说明
图1为88-microrna分子标签判别训练组150个样本的二维功能空间聚类图及分类结果表；a为二维功能空间聚类图，b为判别分类结果表；图中，1：正常人群；2：慢性乙型肝炎人群；3：肝硬化人群；4：肝癌人群；
图2为88-microrna分子标签判别训练组150个样本的原始判别结果；
图3为88-microrna分子标签判别验证组63个样本的结果；
图4为训练组样本分别用88-microrna分子标签与afp诊断肝癌的roc曲线比较图；图中，signature表示88-microrna分子标签组；
图5为验证组样本分别用88-microrna分子标签与afp诊断肝癌的roc曲线比较图；signature表示88-microrna分子标签组；
图6为realtimeqrt-pcr验证芯片检测结果。
具体实施方式
实施例1
发明人首先抽提了训练组150例全血样本(包括30例正常(hc)人、30例慢性乙型肝炎(chb)患者、30例肝硬化(lc)患者、60例肝癌(hcc)患者)的rna，进行microrna表达谱芯片杂交，通过芯片扫描，数据提取，数据标准化处理后，经过sam分析，挑选出275个在正常人和病人(包括慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者)之间表达变化倍数大于1.5及p<0.001的microrna。接着，发明人采用fisher判别分析(逐步回归法)等方法对这275个差异表达的microrna进行筛选，签定出一组88个microrna组成的分子标签，结果显示这个标签可以100％的判别正常、慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌。
为了验证此88-microrna标签的诊断作用，发明人同时收集另外63例全血样本组成验证组(包括13例正常人、15例慢性乙型肝炎、15例肝硬化和20例肝癌患者)进行了验证，结果表明，88-microrna分子标签的诊断的准确率与训练组原始诊断正常率类似。此外，为了证实芯片数据可靠，使用实时荧光定量rt-qpcr(realtimeqpcr)对多个microrna的表达水平进行检测，结果显示这些microrna的表达趋势与芯片结果一致。
下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
1.实验材料
1.1全血标本：213例全血标本取自于2014年至2015年，80例肝细胞癌患者全血样本和43例正常人全血样本分别来自中山大学附属肿瘤医院肝胆科和体检中心，45例慢性乙型肝炎和45例肝硬化患者全血样本来自广州市第八人民医院，标本筛选标准为：①正常人每年在中山大学附属肿瘤医院接受健康体检没有慢性乙型肝炎病史；②肝癌患者经过病理确诊，且病人未接受过任何放化疗治疗；③慢性乙型肝炎患者血清hbsag阳性超过6个月；④肝硬化患者经过肝活检确诊。
1.2试验试剂：抽提全血rna的试剂盒购自norgenbiotek公司。所需的探针、引物由life公司合成。qrt-pcr试剂盒购自promega公司。所需的cyanine-5-dutp购自enzolifesciences。
1.3主要仪器设备
分子生物学主要设备：nanodrop1000(thermo)；低温冰箱或冰柜(revco)；centrifuge5415d离心机eppendoorf；pb3002-s电子天平(metler)；紫外分光光度仪(beckmandu800)；数显恒温水裕箱上海跃进医疗器械厂；制冰机(scotsman；microarray)。
寡核苷酸探针及阳性对照序列由上海英骏生物技术有限公司合成：
阳性1positive1序列：cacguacacuaagugugcgau(seqidno：89)；
阳性2positive2序列：agcggugccguacuuacauuc(seqidno：90)。
1.4数据分析软件及网址
2.实验方法
2.1全血rna抽提纯化：参照试剂盒说明书。
2.2表达谱芯片探针的设计：从microrna数据库找出microrna序列，将序列导入arraydesigner2.0软件，连接网络，设置探针设计参数，让软件自动寻找合适的探针，探针设计好后交由life公司合成，引物采用脱盐纯化。
2.3点制芯片步骤
(1)玻片的清洗：a.配制溶液：naoh80g，95％乙醇500ml，dh2o500ml，将玻片置于溶液中100rpm震荡1小时后，自来水洗10次，然后单蒸水洗6次。b.配制溶液：36％hcl96ml,95％乙醇1000ml，将经过上步清洗的玻片置于溶液中100rpm震荡1小时后，自来水洗10次，然后单蒸水洗6次。c.配制溶液:消佳净洗液300ml,dh2o700ml，将经过上步清洗的玻片置于溶液中60℃超声冲洗1小时后，自来水洗10次，然后单蒸水洗10次。d.配制溶液:fisherbrand1500ml,dh2o850ml，将经过上步清洗的玻片置于溶液中60℃超声冲洗1小时后，自来水洗10次，然后单蒸水洗10次。e.将经过上步清洗的玻片1000rpm离心1分钟，然后甩干。f.真空干燥箱140℃，4小时。置于玻璃干燥箱内干燥，过夜。将点制好的玻片存储于玻片盒中，室温真空密闭保存。
(2)芯片的点制：按照前述方法设计好的2份microrna探针溶液和8份点样液混合均匀后，放置于384孔板中，再用本实验室的北京博奥smartarrayertm136printer点样仪将探针点在按照前述方法清洗好的玻片上，温度控制在23℃～24℃之间，湿度控制在33％～35％之间。每一个探针点制两个重复点，一张玻片可点制两个相同的矩阵。
具体点片方法参考北京博奥生物的smartarrayertm136printer点样仪使用说明书。
2.4总rna的荧光标记：(1)将提取的全血总rna的3’端均标记pcp-dy647(红光)，分别在不同的阵列中检测荧光强度。具体操作步骤详情描述如下：positive1(200nm)0.2μl,positive2(200nm)0.2μl,totalrna2.5μg,10×reactionbuffer0.3μl,calfintestinalalkalinephosphatase(20u/μl)0.3μl,depc水补至3.5μl；然后置于pcr仪中37℃进行孵育30min。(2)将上步混合液中加入dmso2.5μl，放于pcr仪中100℃孵育7min，快速将其置于冰水上，终止反应，待温度下降后，再将下列试剂加入：pcp-dy647(0.8nm/μl)0.65μl，t4rnaligase(10un/μl)0.75μl，0.1％bsa1μl，10×t4rnaligasereactionbuffer1μl，depc水0.6μl，然后将反应体系放于pcr仪中，16℃避光孵育过夜(16h)。
2.4纯化荧光标记后的rna：(1)4℃冰箱中拿出microbio-spinchromatographycolumns，将柱子底部的阻塞胶块掰断，并将柱子放入配套的离心管中，使柱子内部的缓冲液慢慢滴至离心管中，最后弃置缓冲液。(2)柱子和离心管置于离心机中，2min，1000g离心，注意观察柱子内部是否变干，然后将离心管弃置。(3)将去掉缓冲液的柱子放置于另一个ep管中。将标记了pcp-dy647红色荧光的乳腺癌的癌组织或正常乳腺组织的rna加入柱子中，离心4min，1000g，滤去未标记的rna。(4)然后将ep管中的液体真空干燥，20min后，待液体彻底挥发干燥后加入15μldepc水。
2.5microrna芯片杂交：(1)将芯片用蒸馏水浸泡1min，后低速甩干。(2)将芯片放置于杂交盒中，然后在盒子两边底部分别加入30ul蒸馏水，以便保持盒内的湿度。(3)芯片阵列两边贴上胶条，放上盖玻片。(4)加入等体积的2×hybridizationbuffer在上述纯化后的rna样品中，混匀后加到阵列上。(5)封装好杂交盒。然后置于预热好的杂交炉中，46℃过夜。(6)拿出芯片后，待冷却，然后放置于1×ssc和0.1％sds的混合溶液中振荡清洗10min，再放置于另一同样的洗液中浸泡10min，以便充分去掉残余的未结合上的rna。(7)最后放置于0.5×ssc溶液和0.1×ssc溶液中再各清洗1min。(8)然后1min，1000rpm离心，甩干芯片上残余液体，最后准备扫片。
2.6microrna芯片扫描：参照luxscantm10kmicroarrayscanner的操作手册。
2.7数据提取：(1)打开genepix6.0软件；(2)打开保存的扫描图像；(3)打开相应的gal文件；(4)利用程序的自动定位功能进行探针点的定位；(5)手动调整自动定位没有定位准确的探针点；(6)提取数据，保存为.gpr文件。
2.8数据去背景和标准化及sam分析：将样本的gpr文件导入gpr分析软件，去除背景值，再对数据进行标准化，将标准化后的数据用sam软件筛选出差异表达的microrna。
2.9判别分析：将筛选出的差异表达的microrna导入spss20.0，采用fisher判别分析方法(逐步回归法)得到fisher判别函数。
2.10roc曲线：将88-microrna和afp判别肝癌的结果导入medcalc软件，选择统计分析中roc曲线。
2.11实时荧光定量rt-pcr：(1)rna反转录：将rtprimer(5μm)稀释为浓度500nm。将试剂放置于冰上融化，分别加入以下试剂：totalrna200ng，rtprimer1μl，depch2o补至5μl，瞬时离心，70℃孵育10分钟，立即放进冰浴，瞬时离心，分别加入以下试剂：mgcl2(25mm)4ul，reversetranscription5×buffer4ul，dntpmixture(10mm)1ul，rnaseinhibitor(40u/ul)0.5ul，reversetranscripase(150u/ul)1ul，depch2o补至15μl，42℃孵育60分钟，70℃孵育10分钟，4℃放置，终止反应。(2)实时定量pcr扩增:配置15μl的qpcr反应体系：反转录产物1.5μl,senseprimers(10μm)0.25μl,antisenseprimers(10μm)0.25μl,sybrgreenpcr(2×)7.5μl,ddh2o补至15μl，瞬时离心。(3)pcr扩增反应程序：95℃/10min，然后95℃/15s，60℃/60s，扩增45个循环。(4)已gapdh作为内参，以thresholdcycle(ct)法进行表达水平的比较分析，以2-△△ct方法计算相对定量。
实验结果如下：
一、芯片筛选全血microrna分子标签
在训练组样本的30例正常人和30例慢性乙型肝炎、30例肝硬化、60例肝细胞癌全血中，根据训练组150例样本表达谱芯片数据，sam分析发现与正常人相比，慢性乙型肝炎、肝硬化、肝细胞癌患者中有275个差异表达的microrna(筛选标准：fdr＝0；foldchange≥1.5)，p<0.001，由于篇幅有限，只列出了其中的88个，如表1所示。
表1.正常人hc与病人(慢性乙型肝炎chb、肝硬化lc和肝癌患者hcc)之间差异表达的275个microrna中的88个
注：microrna差异表达的倍数在正常人与慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者之间都是显著的，p<0.001；加粗显示的microrna是88-microrna分子标签中的microrna。
二、全血88-microrna分子标签的确定
(1)为了有效区分正常人hc、慢性乙型肝炎chb、肝硬化lc和肝细胞癌hcc，应用fisher判别分析法对训练组150例样本中的四类人群进行判别分类。采用判别分析，从差异表达的microrna中筛选出一组由88个microrna组成的分子标签构建的四个fisher's判别函数公式(使用spss20.0软件中fisherdiscriminantanalysis(stepwisediscriminantmethod)筛选出此组88-microrna组成的分子标签)。将训练组150例每个样本中的88个microrna的表达值分别代入4个fisher's判别函数公式，哪一个判别函数值最大，该样本就属于哪一类人群，如表2和图2所示，88-microrna可以100％的准确判别四类人群。
定量上述88个全血microrna的试剂中含有检测该88个全血microrna的探针，所述探针序列如seqidno：1～88所示。
表2.88-microrna判别训练组150个样本的原始判别数值
(2)利用上述88-microrna分子标签(signature)对训练组150个样本进行判别，由spss软件直接输出二维功能空间聚类图及分类结果表。在图1中，(a)二维功能空间聚类图将4类不同的受试者清晰而正确地聚成4组：正常(1)、慢性乙型肝炎(2)、肝硬化(3)、肝癌(4)；(b)分类结果表显示各类不同受试者全部100％地被正确分类。这些结果表明88-mirna分子标签可准确地诊断4类不同人群。
三、88-microrna分子标签的验证
(1)为了验证此88-microrna标签的诊断作用，我们在由63例全血样本组成的验证组(包括13例正常人、15例慢性乙型肝炎、15例肝硬化和20例肝癌患者)中进行了芯片检测和fisher判别分析，结果表明(表3)，88-microrna分子标签诊断的准确率与训练组原始诊断准确率相近。
表3.88-microrna判别验证组63个样本的判别数值
88-microrna分子标签对上述63个全血样本进行判别验证的分类结果如图3所示；结果也表明，88-microrna分子标签诊断的准确率与训练组原始诊断准确率相近，对正常人hc与病人慢性乙型肝炎chb、肝硬化lc和肝癌患者hcc这四类人群具有很好的判别效果。
(2)为了检验88-microrna分子标签诊断肝细胞癌的效率是否高于afp诊断，分别分析了88-microrna分子标签和afp诊断肝细胞癌的特异性和灵敏度，结果表明在213例样本(80例肝细胞癌患者全血样本、43例正常人全血样本、45例慢性乙型肝炎全血样本、45例肝硬化患者全血样本)中，88-microrna分子标签诊断肝癌的灵敏度和准确性分别是100％和99.5％，而afp诊断的灵敏度和准确性只有73.4％和86.8％(表4，表5)。并且我们还发现88-microrna分子标签诊断小肝癌(直径小于3厘米)的效率明显高于afp诊断(表6)。
表4.88-microrna分子标签和afp诊断80例肝癌和133例非肝癌的结果列表
表5.比较88-microrna分子标签和afp诊断肝癌的效率
注：结果根据表4的数据计算得到。
表6.比较88-microrna分子标签和afp诊断小肝癌的准确性
(3)发明人对上述训练组150例样本进行了roc曲线分析，训练组样本分别用88-microrna分子标签与afp诊断肝癌的roc曲线比较图如图4所示；结果显示88-microrna分子标签诊断肝细胞癌的效率显著高于afp诊断。
(4)发明人对验证组63例样本进行了roc曲线分析，验证组88-microrna分子标签与afp诊断肝癌的roc曲线比较图如图5所示；结果显示88-microrna分子标签诊断肝细胞癌的效率显著高于afp诊断。
(5)为了证实芯片数据的准确性，使用qrt-pcr对样本进行检测验证。从筛选出差异表达的microrna中随机挑选4个microrna进行验证，realtimeqpcr验证芯片结果如图6所示。qrt-pcr结果显示mir-4508，mir-135a-3p，mir-1273f和mir-92b-3与芯片数据结果相对应，说明芯片数据的准确性高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>王,辉云
<120>全血88-microrna标记物作为肝脏慢性疾病诊断靶标的应用