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1、pcr技术在临床检验中的应用pcr技术在临床检验屮的丿应川amplly生物技术支持医学检验人致对分为形态学、生物化学、血清免疫学和分子生物学几人类，其分别代表几代实验诊断技术。60年代dna双螺旋结构及半保留复制模式的出现，70年代基因重组及体外基因克隆技术、分子杂交技术的应用使分子生物学在疾病诊断小得到了长足的发展。特别是1985年mullis发明了聚合酶链式反应（pcr）技术，使医学界真正兴起了基因诊断技术热，成为现代医学发展的乂一里程碑。用于临床检验的pcr技术与经典的pcr反应在操作上稍有区别，有其自己的特色。一般在样品处理上，多采用非离了去污剂一次加热处理，这种方法对dn
2、a纯化冇限，但适应临床微量、快速的特点。另外pcr反应体系中各组成成份往往都预分装到反应管中，既减少操作者的工作强度而i也减少了污染的机会，具有极高的使用价值。木公司率先研制并推出单管单人份的pcr诊断试剂，具有开创性意义。这些改进都不影响pcr效果，同样表现岀高特异性、高皱感性、简便快捷等pcr最优秀的特征，在常见传染病、性病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、优生优育、法医学等广泛领域中有相当高的实际应用价值。常见的传染性疾病有细菌、病毒、衣原体、支原体等，可引起消化、呼吸、循环、泌尿生殖等不同系统相应的病变。消化系统感染性疾病在我国具有代表性意义的有肝炎、胃炎及肠道感染性疾病。引起肝
3、炎的病原体主要包插乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它还有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。这几种肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是dna病毒，其余均为rna病毒。我国是乙肝高发区，乙肝病人为世界乙肝病人总数的50%。乙肝病诲经血液传播，病毒主要在肝细胞屮增殖，也町以长期存留在骨髓细胞或外周血门细胞中。通常用pcr法检测血清中的乙肝病毒。有报道川pcr法口j以在泪液、孚l汁、精液及血白细胞中检出乙肝病密，这些发现提示其它传染途经存在的可能。pcr法检测乙肝的优势农现在：早期诊断，因为pcr扩増极其敏感，理论上可检出100
4、ctd/ml乙肝病毒的恵者血清，在感染潜伏期即可被pcr法检出。对低持续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，一般酶标试剂无法检出，以用pcr法检出。疗效跟踪及病程判断，因为pcr能半盘量检测乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其数量多少的最直接指标。在治疗过程屮通过监测血清或口细胞中病毒基因存在与否及瓦动态变化即能准确地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的浓度很低，丙肝病毒的分离尚未成功。h前用于丙肝病毒检验的方法主要是elisa法测定血清中的hcv抗体。由于hcv尚无法分离纯化，所以川于包被的抗原是人工介成肽或基因工程蛋白，这些人工抗原与天然病毒抗
6、v逆转录酶，高温逆转录酶，如tth酶。tth酶在镭离了作川下，具有逆转录酶活性，tth酶活性温度高，可以使核酸充分线性化，捉高逆转录效率及特异性。tth酶在镁离子的作用下，又具有dna聚合酶活性，从而真止实现单管单酶单人份的扩增要求，这样就在不降低扩增敏感性的条件下，一步完成扩增，不仅简化操作，而11又减少污染，捉高检测的准确性。国内本公司已采用这种技术推出单管单酶单人份的rt-pcr诊断试剂。丁型肝炎病焉是缺陷病壽，与乙型肝炎病毒协同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人粪便样木中，戊型肝炎病毒也长期存在于血清中。在pcr检测时，需注意取材的合理性。在消化道传染性疾
7、病屮，另-类最重要的感染性疾病是幽门螺旋杆菌（hp）所引起的胃炎、胃溃疡等。hp可以经口一ii途经传播并定位于囚粘膜上皮细胞，早期表现为浅表性专炎，可发展成为胃溃疡。我国胃炎发病率之高估计比乙型肝炎更严重，对hp的检测应受到广大医务工作考的重视。对iip的检测叮以用生化法测试尿索酶或川免疫法测试血清屮对iip特异性抗体，也可对胃液、胃粘膜样本进行细菌培养及菌种鉴定。pcr法检测iip非常敏感j1特异性高，有研究发现可以从病人的唾液或口腔含漱液屮检出hp。pcr法避免了取胃液及胃粘膜，减少病人痛苦，是口前最理想的方法。呼吸系统感染性疾病主耍的冇帅结核、非典型性帅炎等。结核杆菌感染曾
9、体重复插入序列is986、is960、is6110、染色体质粒dnaph7311、pmtb4、p36基因等。其中最常用的是染色体重复插入序列is986或is6110,1990年hermans首先介绍并使用了is986基因设计的引物扩增产物为245bp,研究表明这一基因对人型结核菌有特异性。而后thierry又介绍了插入序列is6110基因，并认为这一基因对人型结核菌具有比ts986更高的特异性及頌感性，最适合m.tb的检测。结核菌痰标本的pcr检测应注意以下儿种常见的问题。其一，多条带。即扩增产物电泳后有三条或三条以上的萤光除最前而的引物以外有两条产物带，这与插入序列木身各
12、疳中，对以用生理盐水湿棉签擦去皮疹表而污物再用钝刀片轻轻刮去上皮及结痂，用洁净棉签取渗出液样本作pcr检测，其敏感性及特升性极高。二期梅毒皮疹中也存在梅毒螺体其取样方法同顼下疳，三期梅毒皮疹中一般无螺旋体存在，因此病人及部分无皮疹的t、h期梅毒病人可以取edta抗凝全血检测。淋病是口前发病率最高的性传播性疾病z,由淋病双球菌引起。淋病双球菌一般为胞内寄生，常见的感染部位为外生殖器、尿道粘膜最常见。在尿道及外生殖器分泌物中冇许多非致病的双菌存在，对分泌物拭子进行涂片镜检时，常导致误诊。另外fi前非淋球菌性尿道炎的发病率不断增加，鉴别诊断特要，培养法准确但费时h费用高，受用药的影响。p
14、去，再用洁净的湿棉签轻压旋转采集宫颈脱落细胞送检，其准确性更mopcr也可以用检测单纯疱疹病毒、eb病毒、乳头瘤病毒等。引物尖锐湿疣的病毒是人类乳头瘤(hpv)，可致生殖系统感染的乳头瘤病毒主耍是6、11、16、18、33型。新近研究结果表明，在乳头瘤病毒引起的良、恶性生殖器病变中，与血清型的关系并不密切，经常有交叉或多型民时感染。为简化操作，对其基因对比分析寻找共同序列设计的简并引物可以同时检出这儿种型别的病毒既简化操作乂减少费用是一种极理想的方法。我国恶性肿瘤为人口死亡的第一位原因，其小以肺癌、专癌及食管癌的发病率最高，占恶性肿瘤死广总数的60%以上。引起肿瘤的原因非常复杂包
15、括外界环境因素及遗传背景。外界因此可分为三大类即化学、物理及工物因素。肿瘤与遗传有关的证据越来越多，除已知的单基因遗传肿瘤如视网膜细胞瘤、肾母细胞瘤等以外，还在几乎所有的肿瘤细胞屮观察到原癌基因的重排，这些基因的变化估导致细胞增殖调控失调终形成肿瘤。癌基因是指在h然或实验条件下具有潜在诱导细胞恶性转化的基因，它们是在研究逆转录病毒时发现的。目前已知的肿瘤基因有60多种,1969年hubner根据rous(1911)的实验,在小鸡肉瘤滤液中发现一种能诱导宿主细胞转化的rna病毒性癌基因(viraloncogene)。后來又在其它哺乳动物基因中发现与病毒癌基因同源序列，这种正常的
16、细胞基因农达产物与细胞生长、增殖、分化有关。但若被某种因素激活就会转化为有活力的癌基因，通常称z为原癌基因(protooncogene)。为了与病毒癌基因区分,分别用v-0nc及c-0nc基因来代表。li前了解较多的癌基因(c-one)有set基因族、ras基因族、mge及myb基因族。原癌基因存在于止常细胞中，并表达生物功能，只有在原癌基因被激活后才能诱导细胞转化，对能的原癌基因活化机理有：点突变，受到射线、化学因索、生物因索的诱导，这样微小的变化，就会活化癌基因，活化的基因产物仅有极微的结构差异，但在功能在却有很人的区别。获得启动子，原癌基因从病毒基因中获得启动子而活化。基
17、因易位，内外界1大1素能导致染色体的某些基因易位、重排使原來无活性的原癌基因移至某些强的启动因子或増强子附近而被活化。原癌基因的过量扩增，原癌基因产物一般与生长因子、生长因了受体、跨膜信息蛋白有关或功能相近，过度表达时，会因调控失常而引起细胞癌变。另一类与肿瘤和关的基因是抑癌基因如p53。抑癌基因较复朵，作用机理不太清楚。癌基因检测中讯用的分子生物学技术有：杂交、dna分子克隆、pcr扩增及序列分析。pcr扩增简便、快捷有较强的实用性，其至町从病人体液样本中检测活化的癌棊因而不需取活组织，对癌症的早期诊断有极重要的意义。ras基因是1964年首次从大鼠肉扌理的急性逆转录病毒(h
18、arvermurinesarcomaandkistermurinesarcomavirus)中分离出来取大鼠肉瘤(ratsarcoma)的字首命名。1982年首次在人膀胱细胞细胞癌中检出有转化能力的ras基因与ilarver大鼠肉瘤病毒癌基因冇同源性称c-11-ras基因，后从肺细胞癌中发现了与kister大鼠肉瘤癌基因同源的c-k-ras基因，从神经母细胞中又发现了n-ras基因。ras基因激活的最常见方式是点突变。人类原发肿瘤吋点突变主要发生在密码子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行灭活，根据其点突变的情况可以基因诊断、疗效观察。用pcr扩增样
19、本ras原癌基因，再使用杂交法、限制性内切酶消化或产物测序法检测基因的突变情况即可用诊断。p53是抑制癌基因的代表，位于17号染色体短臂上，其产物为53kd分子量的蛋白从此而得名，可分为突变型和野生型，前者为癌基因，后者为抗癌基因。1979年cane发现了p53蛋门eliyahu发现了p53基因有抑癌作用。p53突变后其产物突变蛋白稳沱性增加，半衰期较野生型基因产物长，在细胞内堆积，可以用免疫组化法测出。pcr-relp、pcr-sscp则因方法简单、快速、特异性高，更具有实用价值。在sscp分析屮，单链dna因碱基序列的变异，导致构型改变，在进行凝胶电泳时，其泳动速率发生改
21、r法所取代。pcr在遗传病诊断应用小，可以利用引物直接扩增变化的基因产物，也可以结合应用限制内切酶，分子朵交及电泳图谱分析进行诊断。应用较为广泛的冇pcr法检测中海贫血、苯丙酮尿症、血友病、脆性x综合症及性别鉴定等。地中海贫血(thalassmia)是世界上最常见的单基因遗传病，不有同类型，以a地屮海贫血及在中海贫血最常见。a珠蛋白基因位于11号染色体短怦上，0珠蛋口基因突变致血红蛋白的全成减少或缺失，表现溶血性贫血，肝脾肿大，在我国发病率为0.66%,贵州、以川等地高发可达2.2%。应用pcr技术对以直接检测突变的基凶诊断此病。苯虫酮尿症(phonylketouria,pku)