本发明涉及真菌检测，尤其涉及曲霉菌属（包括烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉等）、新型隐球菌、耶氏肺孢子的引物探针组合及检测试剂盒及其应用。
背景技术：
1、侵袭性真菌病(invasivefungaldisease,ifd)，又称侵袭性真菌感染，是指真菌侵入人体组织、血液，并在其中生长繁殖导致组织损害、器官功能障碍和炎症反应的病理改变及病理生理过程。曲霉菌属霉菌、新型隐球菌、耶氏肺孢子属于侵袭性真菌病的病原菌。
2、曲霉菌病是感染曲霉菌引起的一种真菌病，可累及皮肤、黏膜、眼、鼻、支气管、肺、胃肠道、神经系统、骨骼等多器官系统，严重者导致败血症，病例呈世界性分布。病原体曲霉菌属丝状真菌（aspergillusspp.），是一种常见的条件致病性真菌，广泛分布于自然界，其感染者并不少见。曲霉菌易于感染开放的空腔如肺部疾病（如支气管扩张、肿瘤以及结核）导致的肺空洞、鼻窦或外耳道（耳真菌病）。这些部位的感染主要引起局部侵袭性破坏性病变，尽管也可引起系统性感染，尤其在有中性粒细胞减少、使用皮质类固醇的免疫缺陷患者中。常见于临床曲霉菌病的病原体包括，烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉等。
3、新型隐球菌(cryptococcusneoformans)，最常引起的感染为隐球菌性脑膜炎和隐球菌肺炎，此外，还可导致血流感染、心内膜炎、心肌炎、蜂窝组织炎、腹膜炎、肠穿孔、眼内炎、关节炎、骨髓炎、坏死性筋膜炎、感染性休克、积脓症、脓肿等疾病，隐球菌病好发于免疫力低下的人群。有研究表明，在隐球菌感染中，中枢神经系统感染者以既往有基础疾病、免疫力低下者感染为主，而肺部感染患者中，免疫力正常者的感染发病频率也在逐年升高，这提示隐球菌感染的患者中，免疫力低下已不再是必要条件。
4、耶氏肺孢子（pneumocystisjiroveci）是一种呼吸系统的条件致病菌，当前传播方式尚未明确，但有研究证明其可能是通过气溶胶传播。在气管、支气管或肺泡腔内长期潜伏耶氏肺孢子，可形成隐性感染，无症状。潜伏或新感染的耶氏肺孢子在宿主免疫力低下时大量繁殖，侵入肺部，形成耶氏肺孢子肺炎，多表现为弥漫性间质性变化的肺部。在合并艾滋病感染、恶性肿瘤、器官移植术后、免疫抑制剂长期大剂量应用、恶性营养不良等导致机体免疫低下的人群中，耶氏肺孢子肺炎多发。
5、根据《侵袭性真菌病实验室诊断方法临床应用专家共识》（2022版），目前对侵袭性真菌感染的临床检测可分为组织学检查和微生物学检查两类。其中组织学检查虽然可直接获得感染部位的病原菌，但在病原菌载量低时仍需培养步骤，耗时较长，不适于早期诊断。而微生物学检查中，直接镜检存在假阴性、敏感度不高等问题。真菌培养鉴定也存在阳性率低的问题，同时耗时较长。血清学检测中的g试验和gm试验广泛用于曲霉菌属感染的早期筛查和连续检测，但存在假阳性的情况。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题在于提供一种多重定量pcr检测曲霉菌属（包括烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉等）、新型隐球菌、耶氏肺孢子的试剂盒，以解决现有技术中多重检测上述靶标组合的试剂盒不足的问题，所用引物、探针组合特异性较强且灵敏度较高。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了一种用于对曲霉菌属（包括烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉等）、新型隐球菌、耶氏肺孢子进行检测的引物和探针的组合，所述曲霉菌属（包括烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉等）、新型隐球菌、耶氏肺孢子检测引物探针组，以曲霉菌属18s基因中保守性dna片段上第104-131位作为检测靶标、以新型隐球菌cap10基因中保守性dna片段上第104-131位作为检测靶标、以耶氏肺孢子dhfr基因中保守性dna片段上第104-131位作为检测靶标。根据靶标区域序列分别设计引物，并进行筛选，最终得到引物。
4、本发明提供了一种用于对曲霉菌属进行检测的引物和探针的组合，其中，引物核苷酸序列如seqidno.1~2所示，探针核苷酸序列如seqidno.3。
5、在一些实施方案中，所述曲霉菌包括本领域任何常见的曲霉菌属种类。优选地，包括烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉。
6、本发明提供了一种用于对新型隐球菌进行检测的引物和探针的组合，其中，引物核苷酸序列如seqidno.4~5所示，探针核苷酸序列如seqidno.6。
7、本发明提供了一种用于对耶氏肺孢子进行检测的引物和探针的组合，其中，引物核苷酸序列如seqidno.7~8所示，探针核苷酸序列如seqidno.9。
8、在一些实施方案中，所述曲霉菌（包括烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉等）、新型隐球菌、耶氏肺孢子检测引物和探针的组合，包括：
9、以seqidno.1~9任意所示的核苷酸序列为基础，经删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的衍生引物或探针。
10、在一些实施方案中，所述曲霉菌（包括烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉等）、新型隐球菌、耶氏肺孢子检测引物和探针的组合，包括：
11、以seqidno.1~9任意所示的核苷酸序列为基础，经核苷酸取代或修饰，得到与所述核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的衍生引物或探针。
12、在一些实施方案中，所述曲霉菌（包括烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉等）、新型隐球菌、耶氏肺孢子检测引物和探针的组合，包括：
13、与seqidno.1~9任意所示的核苷酸序列具有80%以上同源性或与seqidno.1~9任意所示的核苷酸序列功能相似的衍生引物或探针。
14、在一些实施方案中，所述曲霉菌（包括烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉等）、新型隐球菌、耶氏肺孢子检测引物和探针的组合，包括：
15、与seqidno.1~9任意所示的核苷酸序列互补的引物或探针。
16、本发明提供了一种曲霉菌属、新型隐球菌、耶氏肺孢子多重定量pcr检测的引物和探针的组合，包括：
17、seqidno.1所示核苷酸序列的引物18s-f1，seqidno.2所示核苷酸序列的引物18s-r5,seqidno.3所示核苷酸序列的探针18s-p1-rox；
18、seqidno.4所示核苷酸序列的引物cap10-f3，seqidno.5所示核苷酸序列的引物cap10-r2，seqidno.6所示核苷酸序列的探针cap10-p1-fam；
19、seqidno.7所示核苷酸序列的引物dhfr-f3，seqidno.8所示核苷酸序列的引物dhfr-r5,seqidno.9所示核苷酸序列的探针dhfr-p1-cy5。
20、在一些实施方案中，本发明提供的任何一种引物和探针的组合中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，探针的3’端标记有荧光淬灭基团；其中所述荧光报告基团选自fam、vic、hex、cy5、cy3、joe和rox中的任一种；所述荧光淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3和tamra中的任一种。
21、在一些实施方案中，seqidno.3所示核苷酸序列5’端标记荧光基团rox，3’端标记猝灭基团bhq2。
22、在一些实施方案中，seqidno.6所示核苷酸序列的探针的5’端标记荧光基团fam；3’端标记猝灭基团bhq2。
23、在一些实施方案中，seqidno.9所示核苷酸序列的探针的5’端标记荧光基团cy5，3’端标记猝灭基团bhq3。
24、在一些实施方案中，本发明提供的任何一种引物和探针的组合中，seqidno.3所示核苷酸序列5’端标记荧光基团rox，3’端标记猝灭基团bhq2；seqidno.6所示核苷酸序列的探针的5’端标记荧光基团fam；3’端标记猝灭基团bhq2；seqidno.9所示核苷酸序列的探针的5’端标记荧光基团cy5，3’端标记猝灭基团bhq3。
25、另一方面，本发明提供了一种检测曲霉菌（包括烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉等）、新型隐球菌、耶氏肺孢子中至少一种病原微生物的检测试剂盒：包括上述引物和探针的组合。
26、另一方面，本发明提供了一种曲霉菌属、新型隐球菌、耶氏肺孢子多重定量pcr检测的试剂盒,其包括上述任何一种引物和探针的组合。
27、进一步地，在一些实施方案中，本发明提供的试剂盒包括扩增反应液混合物（又称为“扩增反应液mix”、“pcr反应mix”）、阳性质控和阴性质控。
28、进一步地，扩增反应液mix包括pcr缓冲液、dntp溶液、taqdna聚合酶、udg酶。
29、进一步地，pcr缓冲液包括tris-hcl、mgcl2、kcl和tritonx-100，在pcr缓冲液中tris-hcl的浓度为10~50mm、mgcl2的浓度为3~6mm、kcl的浓度为10~50mm、tritonx-100的浓度为1%~10%(v/v)。
30、进一步地，dntp溶液包括datp、dttp、dctp、dgtp和dutp，在dntp溶液中datp的浓度为0.1~0.3mm、dttp的浓度为0.1~0.3mm、dctp的浓度为0.1~0.3mm、dgtp的浓度为0.1~0.3mm，dutp的浓度为0.1~0.3mm。
31、进一步地，单次检测反应液中包含1.5u~3u的taqdna聚合酶和0.5u~2u的udg酶。
32、在一些实施方案中，本发明提供的任何一种试剂盒中，所述引物18s-f1、引物18s-r5、引物cap10-f3、引物cap10-r2、引物dhfr-f3、引物dhfr-r5的终浓度独立地分别为0.1-0.5μm；探针18s-p1-rox、探针cap10-p1-fam、探针dhfr-p1-cy5的终浓度独立地分别为0.05-0.25μm。
33、在一些实施方案中，本发明提供的任何一种试剂盒中，还包括阳性质控和阴性质控。
34、进一步地，阳性质控包括含有人工合成曲霉菌属18s基因序列的puc57质粒，浓度为1×103~1×106copies/ml、人工合成新型隐球菌cap10基因序列的puc57质粒，浓度为1×103~1×106copies/ml、人工合成耶氏肺孢子dhfr基因序列的puc57质粒，浓度为1×103~1×106copies/ml，以及含有人工合成gapdh基因序列的puc57质粒，浓度为1×103~1×105copies/ml。
35、进一步地，阴性质控为含有人工合成gapdh基因序列的puc57质粒，浓度为1×103~1×105copies/ml。
36、另一方面，本发明提供了上述任何一种引物和探针的组合在制备曲霉菌属、新型隐球菌、耶氏肺孢子多重定量pcr检测试剂盒中的应用。
37、本发明采用的所有试剂均可商业化购买获得。
38、与现有技术相比，本发明的有益效果为：
39、通过设计特定序列结构的引物和探针，制备曲霉菌属（包括烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉等）、新型隐球菌、耶氏肺孢子检测的引物和探针组合及试剂盒，适合多种检测样本，不但灵敏度高、特异性好，而且荧光信号强，为临床针对曲霉菌属、新型隐球菌、耶氏肺孢子感染的检测提供可靠的诊断保障。并且，所述曲霉菌属可涵盖烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉等多种常见曲霉菌属病原菌，具有较好的广谱性。