本发明涉及一种用于检测犬瘟热病毒抗体的致敏聚苯乙烯纳米微球及其制备方法和应用，特别涉及一种用于检测犬瘟热病毒血凝蛋白h抗体的致敏聚苯乙烯纳米微球及其制备方法和应用，本发明属于病毒抗体检测技术领域。
背景技术：
犬瘟热(caninedisease)是由犬瘟热病毒(caninedistempervirus,cdv)引起的狐、貂、貉等毛皮动物及犬、熊猫等的一种高度接触性传染病。犬最易感，其主要特征为双相热，眼、鼻、消化道等处黏膜炎症，以及卡他性肺炎、皮肤温疹和神经症状。病死率可达30％～80％。近年来由于犬的养殖数量增多，缺乏科学的疫苗预防接种，在工作犬养殖场、宠物犬交易场所和流浪犬救助站等高密集犬群中，该病的流行趋势也在不断上升，临床诊断病例明显增多，成为危害犬类健康的主要疾病之一。
目前防治该病的主要措施是预防接种疫苗，但除了病毒变异引起免疫失败以外，母源抗体干扰和抗体水平过低也是造成免疫失败的原因。因此，通过抗体监测可以了解幼犬母源抗体水平和免疫犬的抗体水平，确定幼犬首次免疫和加强免疫的时机，对发挥疫苗免疫保护作用具有重要意义。
尽管实验研究建立了多种cdv抗体检测方法，但在临床上应用的商品化cdv抗体检测试验盒并不多，主要有犬瘟热病毒igg抗体检测试剂盒(dotelisa，美国)、犬瘟热病毒抗体检测试剂盒(双抗原夹心elisa，国产)。elisa检测试剂盒价格昂贵，适合批量样本集中检测，不适于宠物医院对单份血清的随时检测。斑点elisa试剂盒可对单份血清样品检测，但操作较复杂，价格昂贵，限制了犬主人对犬抗体效价主动监测的积极性。因此，建立一种操作简单，准确、快速、经济，可对单份血清样品随时检测的cdv抗体检测方法，对增加宠物犬抗体监测比率，科学制定免疫程序，提高疫苗的免疫效力具有重要的意义。
血凝蛋白h是一种糖蛋白，编码该蛋白的基因是由1944～1946个核苷酸组成。h蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要保护性抗原，对于cd的免疫起着重要作用，cdv通过h蛋白吸附到细胞表面的受体，并协助f蛋白使病毒进入宿主细胞，h蛋白容易发生抗原漂移，导致毒株毒力和抗原性变异。在2003年，hirayama发现用h蛋白单克隆抗体，能中和cdv病毒，与抗f蛋白单克隆抗体相比，对免疫小鼠有更好的保护力。
h蛋白有许多糖基化位点，这些位点的差异性会影响h蛋白的抗原性。普通的onderstepoort疫苗株有4个，野毒株的糖基化位点有8～9个，其中，野毒株在309～311位的氨基酸糖基化位点是特有的。h蛋白的抗原变异率在所有蛋白中最高，依据h基因序列系统进化树分析，cdv存在asia-1、asia-2、asia-3、europe、america-1、america-2、european-wildlife、acrtic-like8个型。新分离的病毒株h蛋白的遗传变异可能是造成犬瘟热暴发的重要原因。woma等对非洲株的h基因进行对比分析，发现南非分离毒株在所有非洲分离毒株上自成一体。对野毒株和疫苗株的对比分析中发现：h基因在核苷酸序列、氨基酸序列均有明显差异。核苷酸水平差异在7％～10％，氨基酸水平差异为8％～11％。
cdv感染过程中h蛋白起重要作用。cdv感染后首先通过h蛋白与细胞表面上的受体相吸附，再激活f蛋白。这两种蛋白还介导相邻细胞发生融合，而且这种融合作用f蛋白不能单独完成。因此在cdv感染过程中h蛋白是致病性决定因素之一，机体针对h蛋白产生免疫反应，用来抵抗cdv的感染。zipperle等发现a75/17h基因中的与信号淋巴细胞激活分子(slam)受体结合的3个关键位点，而这3个关键位点位于h蛋白头部与受体结合部的凹陷的表面。
本发明通过分离现地流行cdv，分析其主要蛋白h的编码基因的遗传变化情况，了解流行毒株与疫苗株主要抗原蛋白h的差异性，为临床上选择疫苗提供依据；以重组h蛋白致敏彩色聚苯乙稀纳米微球，建立一种间接凝集试验，为动物诊疗提供简便、快速、准确、经济，可对单份血清样品随时检测的cdv抗体检测方法。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种用于检测犬瘟热病毒血凝蛋白h抗体的致敏彩色聚苯乙烯纳米微球及其制备方法。
本发明的目的之二在于提供一种犬瘟热病毒抗体聚苯乙烯纳米微球间接凝集检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明将临床确诊为cdv病死犬的肠内容物处理液接种mdck细胞，经传代培养后，通过电镜观察、间接免疫荧光检测、rt-pcr鉴定后确定分离获得了1株cdv，命名为cdv-dn17-1。根据对cdv-dn17-1h基因序列分析，本发明克隆了h基因两段抗原区域片段，原核表达获得了两种重组蛋白rcdv-sdh1和rcdv-sdh2，并分别免疫实验兔制备了抗血清。血清中和试验结果显示，用rcdv-sdh1制备的血清抗体中和效价为1:35，高于rcdv-sdh2制备的血清抗体，因此选择rcdv-sdh1作为凝集试验的检测抗原。经偶联条件优化，将纯化的rcdv-sdh1与红色羧化聚苯乙烯纳米微球偶联，制备了致敏免疫彩色纳米微球。以致敏微球为凝集原，cdv阳性血清为凝集素，经特异性、敏感性和稳定性试验验证，建立了cdv抗体检测间接凝集试验。通过与商品化试剂盒对血清样品的检测结果对比分析，证明该方法具有良好的特异性，只与cdv阳性血清发生凝集反应；试剂盒检测值s≥3的阳性血清，凝集试验结果均为阳性；4℃保存1～3个月的致敏微球与阴性、阳性血清的凝集结果无变化。初步对40份临床血清样品的检测结果显示，本发明建立的间接凝集试验与试剂盒的检测结果一致。
因此，在上述研究的基础上，本发明首先提出了一种犬瘟热病毒重组血凝蛋白h，所述的重组血凝蛋白h为犬瘟热病毒血凝蛋白h的截短蛋白，其氨基酸序列如seqidno.3所示。
编码所述的犬瘟热病毒重组血凝蛋白h的核苷酸序列以及含有所述的核苷酸序列的重组表达载体也在本发明的保护范围之内，优选的，所述的核苷酸序列如seqidno.2所示。
进一步的，本发明还提出了所述的犬瘟热病毒重组血凝蛋白h在制备检测犬瘟热病毒血凝蛋白h抗体的试剂中的用途。
更进一步的，本发明还提出了一种用于检测犬瘟热病毒血凝蛋白h抗体的致敏聚苯乙烯纳米微球，所述的致敏聚苯乙烯纳米微球的表面偶联有本发明所述的犬瘟热病毒重组血凝蛋白h。
一种制备所述的致敏聚苯乙烯纳米微球的方法，包括以下步骤：取醋酸盐缓冲液，加入纯化后的所述的重组血凝蛋白h、羧化聚苯乙烯纳米微球、edc，漩涡混匀，室温下轻微振荡；将充分混合的液体离心弃去上清液；加等渗溶液使球体重新混悬，重复洗一次，最后加入等渗溶液得到混悬液，即得。
其中，优选的，取1mlph5.0醋酸盐缓冲液，加入浓度分别为300μg/ml纯化后的所述的重组血凝蛋白h1ml、浓度为5％w/v的聚苯乙烯纳米微球25μl、200mg的edc，漩涡混匀，室温下轻微振荡2h。
其中，优选的，所述的等渗溶液为0.1mol/lph6.8的吗啉乙磺酸缓冲液(mes)。
其中，优选的，所述的聚苯乙烯纳米微球为410nm的彩色聚苯乙烯纳米微球。
进一步的，本发明还提出了所述的致敏聚苯乙烯纳米微球在制备通过间接凝集反应检测犬瘟热病毒血凝蛋白h抗体的试剂中的用途。
一种犬瘟热病毒抗体聚苯乙烯纳米微球间接凝集检测方法，按照以下步骤进行：取干净的玻片滴加10μlpbs(作为对照)，10μl待检血清，然后分别加入10μl所述的致敏聚苯乙烯纳米微球的悬液，充分混匀后手动摇晃1～2min观察凝集现象。实验证明本发明所建立的cdv抗体检测间接凝集试验具有良好的特异性、敏感性、稳定性，可满足临床对单份血清的检测需求，具有明显的应用价值。
相较于现有技术，本发明的有益效果为：
1、犬感染cdv后，cdv可分布于肝、脾、脑等组织器官和肠内容物中，因此常采集肝、脾、脑等组织器官和肠内容物作为病料样品分离cdv。本发明用疑似cd病死犬的肝脏、脾脏、肠内容物分别接种mdck细胞，肝脏、脾脏样品接种的mdck细胞无明显细胞病变，肠内容物接种的mdck细胞产生了明显细胞病变，本发明从肠内容物中分离获得1株cdv。
2、cdvh蛋白能够诱导机体产生中和抗体，应用h蛋白作为致敏微球的抗原检测免疫犬血清抗体或幼犬母源抗体是较合理的选择。本发明在预试验中曾尝试表达完整的h蛋白作为抗原，因编码h蛋白基因全长约1.8kb而没有获得理想的可溶性表达重组蛋白。可溶性表达蛋白作为抗原，其结构更接近天然蛋白的构象，有利于检测血清中和抗体，还可免去对包涵体蛋白进行复性等复杂操作。本发明通过dnastar对抗原性进行分析，去除h基因n端高度疏水的549nt的核苷酸序列，将之后的1275nt片段进行表达，但无论如何表达方式为包涵体表达。最后选取抗原位点集中的550nt～1002nt和3’端816ntcdv两段基因，将h蛋白截短成两段，用大肠杆菌rosetta表达了两个截短的重组蛋白rcdv-sdh1和rcdv-sdh2，这两个重组蛋白均可在rosetta中表达可溶性蛋白。蛋白纯化后免疫新西兰白兔制备了重组蛋白抗体，并进行了针对分离毒株的细胞中和试验。结果显示，相同条件下rcdv-sdh1免疫新西兰白兔制备的血清抗体中和效价明显高于rcdv-sdh2抗体，说明rcdv-sdh1具有更好抗原性。因此，选取rcdv-sdh1作为纳米微球的致敏原。建立的间接凝集试验结果显示，rcdv-sdh1与几种常规疫苗免疫抗体均能发生明显的凝集反应。
3、本发明建立了检测cdv抗体的间接凝集试验。临床上采集40份犬血清样本，用建立的方法和商品试剂盒分别对样品进行血清抗体检测，结果显示，两种方法的检测结果趋势一致。建立的间接凝集试验凝集度≥“++”时对应的商品试剂盒检测s≥3(试剂盒说明，s≥3时免疫犬血清抗体具有免疫保护作用)。本试验建立的cdv抗体间接凝集试验具有良好的特异性，操作简单，眼观判定结果，适合临床上对单个血清样品的检测，成本低，便于推广等优点。
附图说明
图1为病料样品引起的细胞病变；
a.未接病料的mdck细胞；b.肝脏病料接种mdck细胞；c.脾脏病料接种mdck细胞；d.肠内容物病料接种mdck细胞；
图2为电子显微镜下的病毒粒子；
图3为分离株h基因pcr鉴定结果；
m.dnatepmarker2000plusii；1.水；2.病毒培养物；
图4为间接免疫荧光鉴定结果；
a.接种病毒mdck细胞荧光染色；b.正常mdck细胞荧光染色；
图5为cdv-dn17-1与其它株h基因的核苷酸同源性对比；
图6为cdv-dn17-1与其它株h基因的核苷酸系统发育进化树；
图7为cdv-dn17-1与其它株h基因的氨基酸同源性对比；
图8为抗原表位分析；
图9为重组蛋白的sds-page分析；
m.未预染marker；1.rosetta/pet-30a空载；2.rosetta/pet30a-sdh130℃诱导上清；3.rosettapet30a-sdh130℃诱导沉淀4.rosetta/pet30a-sdh230℃诱导上清；5.rosetta/pet30a-sdh230℃诱导沉淀
图10为纯化重组蛋白western-blot鉴定；
a.m.预染蛋白质分子质量蛋白标准；1.rosetta/pet-30a空载体；2.纯化的rcdv-sdh1；b.m.预染蛋白质分子质量蛋白标准；1.纯化的rcdv-sdh2；2.rosetta/pet-30a空载体；
图11为凝集程度判定；
a.cdv阳性血清“++++”；b.cdv阳性血清“+++”；c.cdv阳性血清“++”；d.cdv阳性血清“+”；
图12为间接凝集试验和商品试剂盒对样品检测结果的比较；
x轴为商品试剂盒比色卡s值，y轴为致敏微球凝集度(0、1、2、3、4代表“-”、“+”、“++”、“+++”、“++++”)；
图13为凝集试验的特异性；
左-右依次是：pbs；cdv阳性血清；cpv阳性血清；rabv阳性血清；cav阳性血清；
图14为凝集试验的敏感性；
a.pbs；b.s＝5～6，凝集度为“++++”；c.s＝4，凝集度为“+++”；d.s＝3，凝集度为“++”；e.s≤2，不凝集；
图15为间接凝集试验和商品试剂盒符合率。
x轴为商品试剂盒比色卡s值，y轴为致敏微球凝集度(0，1，2，3，4代表“-”，“++”，“+++”，“++++”)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
1、菌、毒株、质粒、疫苗、实验动物
感受态细胞rosetta、dh5α、表达质粒pet-30a用于cdvh基因克隆表达，mdck细胞用于分离病毒，均为东北农业大学动物医学学院兽医传染病学教研室(以下简称本实验室)保存。疫苗：吉林五星五联苗(犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、狂犬病病毒)；辉瑞四联苗(犬瘟热病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒、犬细小病毒)；英特威二联苗(犬瘟热病毒、犬细小病毒)；优乐康六联苗(犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒1型、犬腺病毒2型、副流感病毒、钩端螺旋体)均购自东北农业大学动物医院。新西兰白兔购自辽宁长生生物技术有限公司。
2、主要试剂、培养基和耗材
dmem培养液、胎牛血清、96孔细胞培养板用于mdck细胞培养，购自哈尔滨凯誉生物试剂有限公司；bamhi、saci限制性内切酶、pmd-19t用于基因克隆、dnamarker2000plusii、easy-taq酶、dntps、蛋白质分子质量标准、彩虹预染marker、t4dna连接酶用于蛋白表达，购自北京全世金生物公司；病毒rna提取试剂盒，反转录试剂盒，购自天根生化科技有限公司；immunocombcaninevaccicbeck试剂盒用于免疫犬血清抗体检测，购自中兴动物医药有限公司；异硫氰基荧光素(fitc)标记羊抗兔igg购自北京中杉公司，辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗兔igg购自北京博奥森生物技术有限公司均用于间接免疫荧光试验；tritonx-100购自biosharp生物技术有限公司；n,n-二甲基甲酰胺(n,n-dimethylformainide,dmf)购自申翔化学试剂有限公司；吗啉乙磺酸缓冲液(mes)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸(1-(3-dimethylamino-propyl)-3-ethylcarbodiimide-hydrochloride,edc)均用于间接凝集试验，弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂用于重组蛋白多克隆抗体的制备均购自哈尔滨佰杰斯公司；410nm红色羧基聚苯乙烯微球用于制备免疫微球，购自上海涛宇国际有限公司。
3、病料和血清
用于分离病毒的病料样品为来自临床疑似犬瘟热病死犬的肠内容物、肝脏和脾脏；阳性犬腺病毒(cav)血清、狂犬病病毒(rabv)血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所曲连东研究员惠赠；狂犬病预防血清购于哈尔滨市疾病预防控制中心；兔抗犬瘟热病毒(cdv)血清和兔抗犬细小病毒(cpv)血清由本实验室保存。40份免疫犬血清，其中15份来自东北农业大学动物医院就诊犬，25份来自哈尔滨铁路局警犬基地健康犬，用于临床样本检测。
实施例1cdv的分离鉴定
1方法
1.1犬瘟热病毒的分离鉴定
1.1.1病料处理及细胞培养增殖
采集疑似cd病死犬的肠内容物、肝脏、脾脏分别按1:5的比例加入灭菌的生理盐水，用预冷灭菌的研钵在冰上研磨，反复冻融3次，离心取上清经滤器过滤，-80℃冰箱保存。
将本实验室-150℃冻存的mdck细胞冻存管，置37℃水浴锅融化。在超净台中，将1mlmdck细胞液加入7ml的dmem中，混匀，加入细胞培养瓶中，放置5％co237℃温箱1h，待细胞贴壁后，弃去上清液，加入10％胎牛血清dmem。当细胞长至70％单层时，弃去上清液，用2％胎牛血清的dmem培养液的更换。按1:10加入病料处理液。
每天观察细胞，当80％病变时，取出培养瓶，反复冷冻解冻3次，收取培养液上清，然后按10％的比例接入新培养的mdck细胞单层，盲传4代，收取的细胞培养液保存于-150℃。
1.1.2细胞培养液的电镜观察
取第四代细胞培养物送中国农业科学院哈尔滨兽医研究所电镜室检测。
1.1.3rt-pcr鉴定
表1rt-pcr引物序列
取第四代病料细胞培养物，根据病毒基因组rna提取试剂盒说明书的操作步骤提取总rna。然后反转录成cdna。反转录体系为20μl。见表2。
表2反转录体系(20μl)
在pcr仪上反转录：30℃反应5min，55℃反应60min，85℃反应5min，降温至4℃。得到的cdna模板用于pcr扩增。
pcr反应体系(25μl)及操作如下：10μmol/l上、下游引物各1μl，10mmol/ldntps2μl，10×easy-taqbuffer2.5μl，12ueasy-taq酶0.5μl，cdna模板2μl，用灭菌去离子水补充至25μl。反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃终延伸7min。反应结束后，经0.8％琼脂糖核酸电泳鉴定。
1.1.4间接免疫荧光鉴定
观察接种第四代细胞培养物的mdck细胞，待细胞病变达到80％时，弃去病毒培养液，用ph7.2的pbs反复冲洗3次，每次5min。用4％的细胞固定剂多聚甲醛室温固定30min，晾干用pbs冲洗，用0.2％的triton-100室温穿孔10min，pbs冲洗。加入用3％bsa稀释的兔抗犬瘟热病毒血清100μl，37℃孵育1h，pbs冲洗。用3％bsa稀释的羊抗兔fitc标记的二抗，37℃孵育30min，最后用pbs冲洗3次，晾干。荧光显微镜观察。
1.2犬瘟热病毒h基因克隆及序列分析
1.2.1cdvh基因扩增
表3扩增cdvh基因的引物序列
病毒总rna的提取和反转录方法同1.1.3。pcr反应体系(25μl)及操作如下：10μmol/l上、下游引物各1μl，10mmol/ldntps2μl，10×easy-taqbuffer2.5μl，12ueasy-taq酶0.5μl，cdna模板2μl，用灭菌去离子水补充至25μl。反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃终延伸7min。同时设h2o作为阴性对照，扩增产物经0.8％琼脂糖核酸电泳凝胶分析鉴定。
1.2.2cdvh基因克隆
将纯化的cdvh基因片段与克隆载体pmd-19t16℃过夜连接，转化dh5α感受态细胞，涂于固体lb平板上(amp+，100μg/ml)，37℃温箱过夜培养。挑取单个菌落，接种于含amp的液体培养基。37℃摇床震荡培养10h，进行pcr鉴定。将鉴定为阳性的克隆质粒，送上海生工进行测序。
1.2.3cdvh基因序列分析
将分离毒株及临床常用疫苗中cdvh基因序列分别拼接整理，对犬瘟热分离毒株h基因与genbank上已发表的cdvh基因序列，用dnastar软件进行序列(核苷酸序列、氨基酸序列)、推测抗原表位比对分析。
1.3cdvtcid50测定
取第四代cdv细胞培养液10倍系列倍比稀释，然后接种到96孔细胞培养板上的mdck细胞单层，每个稀释度8个孔，每孔100μl。同时，设未接毒的mdck细胞作为对照。将培养板放置37℃5％的co2培养箱，每天观察记录cpe情况。以reed-muench法计算cdv分离毒株的tcid50。
2、结果
2.1cdv分离鉴定
2.1.1细胞病变
将处理的病料接种mdck细胞36h后，只有肠内容物处理液接种的细胞出现了明显的细胞病变(cpe)，特征为细胞开始圆缩，融合，形成空泡，拉网，脱落。肝脏、脾脏处理液接种的细胞无明显的cpe(见图1a～d)。
2.1.2电镜观察
取第四代病毒细胞培养物送至中国农业科学院哈尔滨兽医研究所电镜室检测。电镜下可见表面有囊膜、多数呈球形，直径约为200nm的病毒粒子(图2)。
2.1.3rt-pcr鉴定
取第四代病毒细胞培养物200μl，按2.2.1.3中的方法提取rna，反转录成cdna。以cdna为模板，h-f、h-r为鉴定引物扩增目的片段。用0.8％的琼脂糖核酸电泳鉴定扩增片段。结果显示，在1000bp上方出现单一条带，与预期目的条带大小相符(图3)。
2.1.4间接免疫荧光鉴定
接种病料的mdck细胞出现cpe时，以抗兔cdv阳性血清为一抗，以羊抗兔fitc标记的血清为二抗。荧光显微镜下显示，接毒的mdck细胞呈绿色荧光(图4a)，正常的mdck细胞没有荧光出现(图4b)。
经过电镜观察、rt-pcr、间接免疫荧光试验，结果表明，分离得到的病毒为cdv，命名为cdv-dn17-1。
2.2cdvh基因克隆及序列分析
2.2.1cdvh基因的扩增
以h1、h2为引物，提取cdv-dn17-1细胞培养液、cdvsnyderhill、cdvonderstepoort1、cdvonderstepoort2、cdvrockborn的总rna，反转录成cdna为模板，pcr扩增产物，胶回收，连接克隆载体，转dh5α感受态细胞，涂于固体lb平板上，挑取单个菌落进行pcr鉴定，结果显示接近2000bp下方均出现单一条带，与预期片段大小相符。鉴定为阳性的克隆质粒测序结果显示，扩增产物大小均为1824bp。
表4cdv毒株
2.2.3cdvh基因氨基酸的序列分析
将cdv-dn17-1的h基因氨基酸序列分别与26d、heb(09)3、mdj38、5804p、00-2601、ln(07)3、98-002、panda1992-2、98-2654、dog1999、cdv3、5840、01-2689、164071、a75/17、snyderhill、onderstepoort1、onderstepoort2、rockborn、lederle共20株病毒株h基因氨基酸序列进行同源性比较分析。结果为，cdv-dn17-1与asia-1型的heb(09)3株的同源性为99.8％，与europe(5804、5804p)的同源性分别为96.1％、95.7％，与european-wild型panda-1992株的同源性为95.6％，与america-2型(002601、a75/17株)的同源性分别为95.1％、96.5％，与arctic-like型dog-1999株的同源性为93.3％，与疫苗型rockborn株的同源性为96.2％，与其它疫苗株同源性在89.6％～91.9％之间。可以看出，分离毒株与hb(09)3的同源性最高，与其它型的分离毒株同源性均较低(图7)。
2.2.4h蛋白的糖基化位点预测
netnglyc1.0server在线软件分析cdv-dn17-1及常用疫苗株snyderhill、onderstepoort1、onderstepoort2、rockborn、lederle潜在的糖基化位点变化。cdv-dn17-1的h基因预测的氨基酸序列分析见表5，可见含有9个潜在的n-联糖基化位点，分别在19～21位，149～151位，309～311位，391～393位，422～424位，456～458位，587～589位，584～586位和603～605位共9个潜在糖基化位点。常用疫苗株中，rockborn株潜在8个糖基化位点，lederle株潜在7个糖基化位点，snyderhill株潜在6个糖基化位点，其它疫苗株潜在4个糖基化位点。这些数据表明，分离毒株糖基化位点数目与疫苗株糖基化位点数目存在一定差异。
表5cdvh蛋白糖基化位点预测
2.2.5分离毒株与疫苗毒株h蛋白抗原表位分析
根据dnastar软件分析分离毒株cdv-dn17-1与疫苗株snyderhill、onderstepoort1、onderstepoort2、rockborn、lederle的h蛋白抗原表位分析，分离毒株与疫苗株在98～102位、393～406位抗原表位有差异(图8)。
2.3cdvtcid50测定
测定cdv第四代细胞培养物tcid50，按reed-muench的计算方法(如表6)，结果为分离毒株cdv-dn17-1的tcid50为10-5.33/0.1ml。
表6tcid50的测定
实施例2重组cdvh蛋白的表达
1.1重组cdvh蛋白的表达
1.1.1cdvh基因的分段克隆
通过h基因序列对比分析，去除n端高度疏水区，选取抗原位点聚集且相对保守的h基因片段，设计引物sd-f/r、sd-f2/r2，扩增两段截短的h基因，第一段(sdh1)从550nt～1002nt，第二段(sdh2)从1000nt～1815nt预期扩增片段大小为453bp和816bp。引物见表7。
表7pcr引物序列
注：括号内为限制性内切酶，横线标示的为酶切位点。
取第四代cdv-dn17-1病毒的细胞培养物，提取rna，反转录成cdna。以cdna为模板，使用sd-f/r、sd-f2/r2两对引物分别进行pcr扩增。反应体系(50μl)为：5×psbuffer10μl、ddh2o32.5μl、dntps4.0μl、上游引物1.0μl、下游引物1.0μl、模板1.0μl、primerstar聚合酶0.5μl。pcr扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收纯化目的片段；将目的片段与载体pmd-19t，于16℃过夜连接。取重组dh5α培养液进行pcr鉴定，并将鉴定为阳性的克隆质粒命名为pmd-19t-sdh1、pmd-19t-sdh2，送上海生工测序。
1.1.2重组菌的构建
经鉴定无误的pmd-19t-sdh1、pmd-19t-sdh2、pet-30a质粒，分别用bamhi、saci限制性内切酶对进行双酶切，回收目的片段，用t4dna连接酶将酶切回收的片段与sdh1(bamhi、saci)、sdh2(bamhi、saci)分别与pet-30a(bamhi、saci)连接并转化到rossta感受态细胞，转化后得到阳性重组菌命名为rossta/pet30a-sdh1和rossta/pet30a-sdh2。同时将pet-30a也转化到感受态细胞rossta中。提取重组质粒双酶切验证，将阳性重组菌送上海生工测序。
1.1.3重组蛋白的表达
将鉴定后的重组菌液分别以1：100比例接种于100mllb(kan+，300μg/ml)液体培养基中，37℃，200r/min震荡培养，测其od600nm值为0.4～0.6时，加入iptg剂进行诱导，收集样品，对样品进行sds-page分析。为优化表达条件，分别在16℃、30℃和37℃条件下诱导4h、6h、12h，诱导后的rossta/pet30a-sdh1和rossta/pet30a-sdh2预期表达大小分别22.6ku和30.8ku的重组蛋白。收集所有优化条件诱导后的样品上清和沉淀用sds-page分析。以优化后的条件诱导表达重组蛋白。
1.2重组蛋白的纯化
吸取2mlni-nta填料加入到10ml纯化柱中，添加3倍体积去离子水轻轻重悬ni-nta填料，并清洗镍柱。分别加入两种重组蛋白的上清处理液，轻轻震动以确保ni-nta琼脂糖悬浮于蛋白样品中，4℃孵育2h，其中每隔10min轻混样品。用20mm、40mm含咪唑的washbuffer洗去未结合的杂蛋白，最后用100mm含咪唑的elutebuffer溶解结合的his标签蛋白，收集液即为重组蛋白纯化液，保存于4℃用于后续试验。
1.3重组蛋白的western-blot鉴定
纯化的重组蛋白电泳后(sds-page)，取出凝胶，放入转印缓冲液中浸泡，将nc膜、滤纸放入转印缓冲液中浸湿。然后在转印仪上依次放滤纸、nc膜、聚丙烯酰胺凝胶、滤纸。设置电流恒流50ma转印30min。转印结束后，取出nc膜，用去离子水反复冲洗后，放入5％脱脂乳的封闭液中4℃封闭过夜。第二天取出过夜封闭的nc膜，放入pbst中洗涤，每次10min，然后放入一抗(兔抗cdv血清，用5％脱脂乳1：500稀释)中室温缓慢摇动作用2h，再用pbst反复洗涤，然后将nc膜放入二抗(hrp标记的羊抗兔igg，用5％脱脂乳l：1000稀释)中，室温缓慢摇动作用2h后用pbst反复冲洗，曝光显色。鉴定正确的重组蛋白分别命名为rcdv-sdh1，rcdv-sdh2。
1.4重组蛋白免疫原性比较
1.4.1免疫原的制备
将已经纯化制备的rcdv-sdh1和rcdv-sdh2两种蛋白，测定浓度后调制为2mg/ml，将纯化蛋白与弗氏佐剂(首免用弗氏完全佐剂，之后用弗氏不完全佐剂)按1:1混合后乳化。
1.4.2动物免疫及收集血清
选用18周龄的新西兰白兔3只，分别免疫乳化后的rcdv-sdh1、rcdv-sdh2和pbs，免疫途径为背部皮下多点注射，抗原量均为每只1mg，共免疫3次，间隔2周，免疫后每七天采一次血。用间接elisa检测抗体效价后，在首免第42d将实验兔麻醉进行心脏采血，37℃静置1h，4℃放置过夜，收集血清，-20℃保存。
1.4.3免疫抗体检测
(2)以rcdv-sdh2(4.0μg/ml)为包被抗原检测抗rcdv-sdh2血清抗体，hrp标记的羊抗兔igg稀释度为1:2000，其他步骤及试剂用量与抗rcdv-sdh1血清抗体检测方法相同。
1.4.4细胞中和试验
测定rcdv-sdh1和rcdv-sdh2制备的抗cdv血清抗体的中和效价。通过血清抗体中和效价的测定评估重组蛋白的免疫原性。
2.1cdvh基因的分段克隆
取第四代细胞培养物，提取rna，反转录成cdna；以cdna为模板，分别以sd-f/r、sd-f2/r2为引物扩增目的片段；胶回收目的片段，连接克隆载体，转dh5α感受态细胞，涂于固体lb平板上，过夜培养；挑取单个菌落进行pcr鉴定，结果显示接近500bp和750bp上方有单一条带，与预期片段大小相符。鉴定为阳性的克隆质粒命名为pmd-19t-sdh1、pmd-19t-sdh2，测序结果显示条带分别为453bp和816bp。
2.2重组菌的构建
将pmd-19t-sdh1、pmd-19t-sdh2、pet-30a表达质粒，分别用bamhi、saci进行双酶切；回收目的片段与酶切的pet-30a连接，转化rossta感受态细胞，过夜培养；酶切鉴定结果显示的条带与预期条带大小(453bp和816bp)相符。阳性重组菌命名为rossta/pet30a-sdh1和rossta/pet30a-sdh2。
2.3重组蛋白的表达
重组菌液rossta/pet30a-sdh1、rossta/pet30a-sdh2在1％iptg诱导后，表达产物的sds-page分析结果显示，在30℃下诱导12h，重组蛋白在上清和沉淀中均有表达，分别在25.0ku左右和35.0ku左右有明显的条带，与预期条带相符(图9)。
2.4重组蛋白的纯化和免疫原性鉴定
2.4.1重组蛋白的纯化
对两段重组蛋白上清进行纯化处理，经由ni-nta柱按照所述方法处理后，经过sds-page结果显示，分别在25.0ku和35.0ku附近有明显的单一条带，与预期大小相符。
2.4.2western-blot鉴定
将纯化的重组蛋白进行western-blot鉴定，结果显示重组蛋白分别在25.0ku下和30.0ku上有明显的单一条带，与预期大小相符。证明重组蛋白均有良好的免疫反应性(图10)。鉴定后的重组蛋白命名为rcdv-sdh1和rcdv-sdh2。
2.5重组蛋白免疫原性比较
2.5.1免疫抗体检测
用间接elisa对一免、二免、三免的兔血清抗体检测结果显示，三免的抗体水平最高。其中，rcdv-sdh1的效价为1:12800，rcdv-sdh2的效价为1:6400。
2.5.2细胞中和试验
用rcdv-sdh1和rcdv-sdh2制备的三免兔抗cdv血清进行细胞中和试验。结果显示，用rcdv-sdh1制备的血清中和效价为1:35；用rcdv-sdh2制备的血清中和效价为1:18。如表8。
表8细胞中和试验
通过间接elisa方法和细胞中和试验对重组蛋白免疫原性比较，rcdv-sdh1的免疫原性比rcdv-sdh2免疫原性更好。因此，建立间接凝集试验的抗原选择rcdv-sdh1。cdvh基因全克隆序列如seqidno.1所示，其中编码rcdv-sdh1蛋白的核苷酸序列如seqidno.2所示，其氨基酸序列如seqidno.3所示。
实施例3cdv抗体检测间接凝集试验的建立
1.1重组蛋白致敏微球的制备
(1)最佳蛋白浓度的选择：取1mlph5.0醋酸盐缓冲液，加入1ml浓度分别为100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml纯化重组蛋白rcdv-sdh1、25μl(5％w/v)的羧化聚苯乙烯纳米微球、200mg的edc，漩涡混匀，室温下轻微振荡2h；将充分混合的液体离心弃去上清液；加1ml等渗溶液(0.1mol/lph6.8的吗啉乙磺酸缓冲液(mes))使球体重新混悬，重复洗一次，最后加入500μl等渗溶液得到混悬液；与4份cdv阳性血清(四种疫苗分别三次免疫犬所得血清)进行凝集反应，确定最佳致敏蛋白浓度。
1.2检测cdv抗体间接凝集试验阳性标准确立
(1)商品化试剂盒检测犬血清抗体：将20份免疫犬血清用canine商品试剂盒检测cdv抗体水平，检测结果按照试剂盒测试板样本标准进行判定。
(2)致敏微球检测犬血清抗体：将上述20份免疫犬血清分别取10μl于干净的玻片上，加入10μl致敏的彩色微球，pbs做对照，充分混匀后手动摇晃1～2min观察结果。
通过致敏微球间接凝集试验和商品试剂盒对20份犬血清检测，分析比较这两种方法的检测结果，并确立犬瘟热病毒抗体检测间接凝集试验阳性判定标准。
1.3凝集反应的特异性和敏感性试验
(1)凝集反应的特异性试验：取10μl致敏微球分别与等量兔抗cdv阳性血清、兔抗cpv阳性血清、rabv阳性血清、cav阳性血清进行凝集反应。用pbs作阴性对照，观察凝集反应的特异性。
(2)凝集反应的敏感性试验：将试剂盒检测结果s值为0～6的血清，分别与致敏微球进行凝集反应，观察凝集反应的敏感性。
1.4凝集反应的重复性和稳定性试验
(1)批内重复性试验：从新制备的致敏微球中取3份(a、b、c)，分别对pbs、兔抗cdv血清、兔抗cpv血清、rabv阳性血清、cav阳性血清进行特异性、敏感性试验，检测同批次致敏微球的凝集反应的可重复性。
(2)批间重复性试验：取三个批次制备的致敏微球(编号：0905、0914、1020)分别对pbs、兔抗cdv血清、兔抗cpv血清、rabv阳性血清、cav阳性血清进行特异性、敏感性试验，检测不同批次致敏微球的凝集反应的可重复性。
(3)稳定性试验：取出置于4℃冰箱1个月、2个月、3个月后的致敏微球，分别与兔抗cdv血清、兔抗cpv血清、rabv阳性血清、cav阳性血清进行特异性、敏感性试验。检测致敏微球的保存稳定性。
1.5cdv抗体检测间接凝集试验的初步应用
应用本发明建立的cdv抗体检测间接凝集试验和商品化试剂盒检测临床上采集的40份免疫犬血清样品，比较间接凝集试验与商品化试剂盒检测结果的符合率。
2结果
2.1聚苯乙烯微球致敏条件优化
2.1.1最佳偶联蛋白量的选择
取25μl(5％w/v)羧化聚苯乙烯纳米微球，以1mlrcdv-sdh1作为致敏原，分别用100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml的蛋白浓度结合微球。制备好的致敏微球与阳性cdv血清反应，观察凝集现象。结果显示，蛋白量为300μg时，凝集效果最好(表9)。
表9偶联蛋白的确定
取25μl(5％w/v)的羧化聚苯乙烯纳米微球，1mlrcdv-sdh1(300μg/ml)，分别作用30min、1h、2h和3h，离心弃上清。制备好的致敏微球与阳性cdv血清反应，观察凝集现象。结果显示，作用2h的致敏微球，凝集效果最好(见表10)。
2.1.3最佳偶联缓冲液选择
表11偶联缓冲液的确定
2.1.4凝集程度的判定
取4份cdv疫苗免疫犬阳性血清各10μl滴加在洁净的载玻片上，再分别滴加10μl致敏微球，pbs对照。迅速将两者混匀，1～2min内出现凝集现象。凝集结果显示，出现粗大凝集块，周边液体澄清，凝集度是“++++”；出现明显凝集颗粒，周边液体澄清，凝集度是“+++”；出现凝集颗粒，周边液体较澄清，凝集度是“++”；出现少许细小凝集颗粒，周国液体浑浊，凝集度是“+”；无凝集现象，反应液与阴性对照相同呈混悬液凝集度是“-”(如图11a～d)。
2.2cdv抗体检测间接凝集试验阳性标准确立
2.2.1商品试剂盒检测犬血清抗体
20份采集的免疫犬血清用canine商品试剂盒检测后按照试剂盒测试板样本标准进行判定，s≥3为阳性，抗体对免疫犬有免疫保护作用。结果显示，s≥3的有12份(其中s＝3为2份，s＝4的有6份，s＝5的有3份，s＝6的有1份)，s≤2的有8份。
2.2.2致敏微球检测犬血清抗体
相同的20份犬血清用本发明建立的间接凝集试验检测，进行凝集程度的判定，结果为凝集度“++～++++”的共12份(凝集度为“++”的有2份，s＝3；凝集度为“+++”的有6份，s＝4；凝集度为“++++”的有4份，s＝5～6)。没有凝集的共8份(凝集度为“-”，s≤2)(见图12)。
通过间接凝集试验和商品试剂盒对20份犬血清抗体检测。分析可知，当间接凝集试验的凝集度≥“++”时，对应的商品试剂盒的s值≥3，判定为阳性，该血清抗体对免疫犬具有免疫保护作用。
2.3凝集反应的特异性和敏感性试验
2.3.1凝集反应的特异性试验
10μl致敏微球分别与等量阳性cdv血清、cpv血清、rabv血清、cav血清进行反应，由图可见，致敏聚苯乙烯纳米微球只与cdv阳性血清反应，与cpv阳性血清、rabv阳性血清、cav阳性血清不发生凝集，说明制备的免疫微球具有良好的特异性(见图13、表12)。
表12cdv特异性试验结果
2.3.2凝集反应的敏感性试验
致敏微球分别与试剂盒检测效价为0～6的血清反应，结果显示，s≤2的血清不凝集；s＝3的血清，凝集度为“++”；s＝4的血清，凝集度为“+++”；s＝5～6的血清，凝集度为“++++”(图14)。表明该cdv抗体间接凝集试验具有良好的敏感性。
2.4凝集反应的重复性和稳定性试验
2.4.1凝集反应的批内重复性试验
抽取三份同一批致敏微球a、b、c与不同血清样品进行凝集反应，凝集结果一致(表13)。
表13cdv批内重复性试验
2.4.2凝集反应的批间重复性试验
取三份不同批次制备的致敏微球与不同血清样品进行凝集反应，结果显示，三批致敏微球与血清样品的凝集结果一致(表14)。
表14cdv批间重复性试验
2.4.3致敏微球稳定性试验
置于4℃冰箱1～3个月的致敏微球与血清样品进行凝集反应，结果显示，凝集结果一致，说明4℃保存1～3个月的致敏微球具有良好的稳定性。
2.5犬瘟热病毒抗体检测间接凝集试验的初步应用
2.5.1间接凝集试验检测犬血清抗体
40份采集的犬血清分别与致敏微球进行凝集反应，按2.2.1判定凝集度。结果显示，致敏微球凝集度为“++++”的有7份；凝集度为“+++”的有8份；凝集度为“++”的有10份；凝集度“-”的为15份。
2.5.2商品试剂盒检测犬血清抗体
40份犬血清分别用canine商品试剂盒检测cdv抗体，试剂盒测试板样本判定标准是s≥3时，血清抗体具有保护作用。结果显示，具有保护效力血清共25份，其中s≤2的有15份，s＝3的有10份，s＝4的有8份，s＝5的有7份。
2.5.3间接凝集试验和商品试剂盒的符合率
两种方法对40份免疫犬血清样品检测结果显示，经致敏微球凝集检出的阴性血清为15份(即凝集度“-”)，阳性血清为25份(即凝集度≥“++”)；商品试剂盒检出的阴性血清为15份(即s≤2)，阳性血清为25份(即s≥3)。两种cdv抗体检测方法的符合率为100％(表15，图15)。
表15间接凝集试验和商品试剂盒符合率
根据检测结果的比较，应用本研究建立的间接凝集试验可对免疫犬抗cdv血清抗体水平做出初判定，即当凝集度≥“++”时(对应的商品试剂盒检测s≥3)，免疫犬血清抗体具有免疫保护作用。
序列表
<110>东北农业大学
<120>用于检测犬瘟热病毒血凝蛋白h抗体的致敏聚苯乙烯纳米微球及其制备方法和应用
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1824
<212>dna
<213>canineparvovirus
<400>1
atgctctcttaccaagacaaggtgggtgccttctataaggataatgcaagagctaattca60
tccaagctgtccttagtgactgaagagcaagggggacggagaccaccctatttgctgttt120
gtccttctcatcctactgattggaatcctggccttgcttgccatcactggagttcgattt180
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<210>2
<211>456
<400>2
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