本文将大致回顾小鼠转基因领域的显微操作技术，包括CRISPR/Cas9技术，旨在对这类客户所用的工作流程和术语进行介绍。此外，还针对有用的显微操作系统配置提供一些建议。
显微操作技术概述
图1：CRISPR/Cas9、原核注射和胚胎干细胞移植技术的粗略比较。更多详情请参阅下文。
小鼠胚胎早期发育阶段
图3：原核阶段示意图（透明带标为红色）
图4：囊胚结构示意图
显微操作技术
原核注射（PNI）和胚胎干细胞移植（ESI）
不管是否涉及CRISPR（或者TALEN、ZFN（见第4章）），都要使用原核注射/受精卵注射技术或胚胎干细胞注射技术。这两种技术是成熟的主流技术，在世界范围内使用：
原核注射
受精后约12小时，出现了一个卵子原核和一个精子原核（图2）。在原核融合为一体并构成受精卵细胞核之前，将DNA注入原核阶段受精卵内的一个原核中，直径约80-100μm。注射的靶DNA随机整合到基因组DNA。方向和拷贝数不可预测，即这是一种非靶向技术，快速直接地获得感兴趣的转基因小鼠概率非常有限。
图5：PNI。以固定毛细管固定PN阶段的小鼠胚胎（左侧）。经由毛细管将溶于缓冲液的少量DNA注入其中一个原核（右侧）。可看见被注射的原核发生膨胀。图片以徕卡DIC采集。
图6：PN注射过程DNA随机非靶向整合到基因组中
典型的PNI系统设置：
-DMi8：手动、电动部件可供选择
-透射光轴；S28聚光镜及微分干涉差
-5/10倍物镜（FLUOTAR或NPLAN）用于大致观察
-20倍、40倍长工作距离物镜。40倍物镜用于注射
-3板载物台（固定载物台的物体导杆妨碍显微操作器！）
-气压式手动显微注射仪用于固定（逆时针转动产生的负压可固定胚胎）
-根据实验室偏好选择样品载体（玻璃底器皿、盖玻片等）
PN注射通常在室温下借助放大400倍的微分干涉差显微镜（一些还使用IMC）完成。（一些情况下还将胚胎冷却至10°C，使质膜更僵硬以方便注射）
胚胎干细胞移植
胚胎干细胞注入囊胚（图4），囊胚阶段从第3.5天开始，约128个细胞。内细胞群由多能性胚胎干细胞组成，也就是说它们可以发育并分化为不同类型细胞。有时注入八细胞阶段的桑椹胚胎（图9）。
图7：ESI。以固定的毛细管（左侧）固定小鼠胚囊。经由毛细管将基因修饰的胚胎干细胞注入囊胚腔（右侧）。注射在内细胞群外滋养外胚层细胞之间完成。图片以徕卡AM6000上的徕卡DIC采集。
图8：ES细胞DNA的靶向整合/突变
1）利用分子生物学技术创建含有靶DNA以及新霉素抗性位点、翻转酶识别位点（FTR）和CRE重组酶识别位点（loxP）的DNA。
2）通过转染方式将靶DNA注入ES细胞。重组体通过同源重组整合到基因组DNA。
3）往细胞培养物中添加新霉素（一种抗生素），以选择产生的ES克隆。只有具备新霉素抗性的克隆才能存活生长。挑出这些克隆继续培养。
4）添加翻转酶（一种切割DNA并将其重新结合的重组酶），消除新霉素抗性。
5）通过转基因小鼠与另外一只转基因“CRE小鼠”交配，loxP位点可以条件性敲除。表达CRE重组酶的小鼠通常具有类似组织特异性的表达，这种特异性的表达使小鼠具备例如在大脑中的基因的靶向敲除。
经由同源重组及ES细胞注射的靶向突变，多年来已成为“金标准”。与CRISPR相比，不足之处包括：
选择ES细胞克隆费时
载体克隆和ES细胞工作耗时约3个月
生成纯合子小鼠耗时约1年
如上所述，在大约99%的案例中，产生的嵌合体是杂合的。最终目的是获得用于研究的纯合子动物。
这是一个费时费力的交配、筛选过程：
1)胚囊（♀或♂）+ES细胞（♂）产生♂嵌合体。目的是获得生殖细胞中具有ES细胞修饰的嵌合体
2)♂杂合嵌合体+WT♀产生杂合F1（♂或♀）
3)杂合♂+杂合♀产生纯合F2代
纯合子小鼠的两个等位基因上均携带突变。最终获得这些有价值的动物耗时1年左右！
典型的ES移植系统设置：
-DMi8：手动、电动部件可供选择；
-透射光轴；S28聚光镜
-DIC为非必需。胚胎在胚囊阶段已经足够大，其细节容易观察。
-5/10倍；20倍；40倍长工作距离物镜；较小NA=较大景深
-气压式手动显微注射仪用于固定
-油压式或油压式带齿轮手动显微注射仪用于注射ES细胞。
ES细胞注射通常在室温下借助放大200倍的DIC/IMC/PH显微镜完成。
ESI的差异在于将ES细胞注入8细胞阶段的胚胎中（图9）。这项操作通常使用钝端毛细管完成，以免损伤细胞。激光器（Hamilton-Thorne，Octax或Piezo压电式破膜系统）可帮助钝端毛细管穿过透明带和膜。
图9：ESI注入8细胞阶段的胚胎。钝端毛细管
图10：EMBL转基因过程中使用的DMi8、EppendorfTransferMan4r显微操作器和PiezoXpert压电破膜仪。以钝端毛细管进行胚囊注射。DIC
用于小鼠转基因的CRISPR/Cas9技术
用于小鼠转基因的CRISPR/Cas9技术为靶向突变提供了工具（如ESI），但无需繁杂的ES处理工作！（当然CRISPR也可以用于ES细胞突变）。
转录激活子样效应因子核酸酶（TALEN）技术是一种更为成熟的技术。TALE（转录激活子样效应因子）是结合DNA特定序列的蛋白质。TALE与核酸酶融合即为TALEN，这是一种具有高度特异性的DNA剪刀。TALEN使双链断裂。修复机制导致靶基因缺失或敲除。
目前，CRISPR技术相对于TALEN技术而言并不昂贵。
另外一种基因组编辑技术是锌指核酸酶技术，它通过在用户指定位置上造成DNA双链断裂而发生作用。
CRIPR/Cas9技术所用的工具如下所示：
向导RNA：这种RNA与用户修饰的靶DNA同源。向导RNA与DNA上的大约20个核苷酸结合。RNA链的其余部分用于结合Cas9核酸内切酶。需要对20个结合的核苷酸进行设计，以找到/发现靶序列。
Cas9核酸内切酶：切割效率高，有时甚至切割两个等位基因。
将向导RNA和Cas9蛋白（或Cas9的DNA或mRNA）注射到受精卵里，Cas9切割DNA，修复机制开始起作用。该方法在第一代小鼠体内产生点突变的概率高。更先进的技术是注射携带靶基因或突变的同源DNA以及向导RNA/Cas9混合体。经由同源重组插入DNA相当有效。
小鼠转基因用CRISPR/Cas9的优点/缺点：
优点：
+Cas9切割效率非常高，有时甚至切割两个等位基因，即可获得同源1代小鼠！
+无需繁琐的ES细胞处理工作
+CRISPR/Cas9技术不依赖于小鼠（而PNI和ESI则依赖），即它也可用于其他物种（猪等）。
缺点：
-迄今已公布的最长插入片段为3kB
-目前loxP条件性敲除效率低
需要注射高浓度黏性分子（如RNA、蛋白质），会堵塞毛细管。因此需要更粗的毛细管，而且要求平角注射！
Cas9高效率地剪切DNA,DNA的修复机制造成了点突变。
*注射gDNA+Cas9+同源的DNA
图11：CRISPR/Cas9技术
典型的CRISPR/Cas9系统设置
与PN注射设置相同，以下除外：
将浓度较高的黏性CRISPR成分（RNA、蛋白质）注入受精卵时需要使用较粗的毛细管。这些毛细管结构笔直，内径较大，大多数实验室均制作。
因此极力建议沿着真正的平角方向注射（见图10），以避免胚胎受损。
此外，使用Piezo压电式破膜系统，可以更轻松地穿过透明带，尤其是质膜。
显微操作器水平移动，将目标片段注入悬浮细胞内
图12：受精卵注射过程的注射角度。显微操作器水平移动，零度角注射可使胚胎受损程度较轻。注射角度大于10°将导致受精卵出现较大的“洞”，使其存活率降低。
徕卡显微操作器的移动角度可调，也就是说，即便角度较陡，注射角度本身也是零度角！
这是徕卡显微操作器的一大优点：黏性的向导RNA和cas9蛋白混合物所需的较粗毛细管（减少堵塞）可以沿着零度角方向注射！
其他实验室设备（转基因实验室）
-立体显微镜是选择和控制胚囊、ES细胞和毛细管必不可少的工具。（如TL5000、M80、Rottermanncontrast）
图13：M80及TL5000Ergo。PN注射后的双细胞阶段。
DIC专用玻璃底器皿，一些实验室使用大号盖玻片
毛细管：若干公司提供即买即用产品。许多转基因实验室自己制作毛细管。
直线注射CRISPR/Cas9需要使用内径足够大的毛细管。转基因专家自己制作“高级”毛细管以达到最高效率。
需要工具：
拉针器（如Sutter、Narishige）
磨具（用于毛细管拉拔后加工）
显微拉制仪（用于弯曲毛细管）
上述显微操作器：
徕卡机械式显微操作器：转基因领域赞誉颇高的显微操作器类型。角度可调，即使毛细管角度较陡，也可获得零度注射角。稳健可靠，负载能力强，持久耐用。用户众多。当移动徕卡显微操作器的控制杆时，可以感觉到毛细管触及胚胎。
EppendorfTransferMan4r：全自动显微操作器，具有许多附加功能。可以平角注射。气压式、油压式、油压式带齿轮和Femtojet手动显微注射器经常用于其他显微操作器。性能最优，价格最高。
Narishige：新式Takanome显微操作器无平角操作功能。配备MOM-202D和MON-202D后可以平角操作。油压式显微操作器当然首屈一指。注射器：IM9B、IM9C、IM-11、IM300。
防震：在很大程度上取决于注射室位于地下室还是高层建筑的十层（不管需要与否）。采用被动（铁板、沉重石桌、网球等）和主动设置。
徕卡DMi8转基因系统特点
与Eppendorf和Narishige显微操作器兼容
参考文献
One-StepGenerationofMiceCarryingMutationsinMultipleGenesbyCRISPR/Cas-MediatedGenomeEngineering
HaoyiWang,HuiYang,ChikduS.Shivalila,MeeladM.Dawlaty,AlbertW.Cheng,FengZhang,RudolfJaenisch,Cell153,910-918,May9,2013
-MultiplexedactivationofendogenousgenesbyCRISPR-on,anRNA-guidedtranscriptionalactivatorsystem
AlbertWCheng,HaoyiWang,HuiYang,LinyuShi,YardenKatz,ThoroldWTheunissen,SudharshanRangarajan,ChikduSShivalila,DanielBDadonandRudolfJaenisch,CellResearch(2013)23:1163–1171.doi:10.1038/cr.2013.122;publishedonline27Aug2013