多重成像技术可以说是近些年来医学生物技术开发的重点领域之一，更少的样本、更少的成像次数以获得更多有价值的临床信息，以此实现更加高效的更加精准的成像模式。虚拟组织学、质谱成像、核磁共振、表面增强拉曼光谱等等，可以说多重成像领域中有着诸多成员，同时也有更多的生物技术即将加入。循环免疫荧光的多重染色技术通过依次标记再淬灭不同的荧光信号，实现了对单一样本的大量靶标同时成像，而这种看似原理简单的技术却面临着诸多挑战
针对当前难以多靶标成像的困境，美国麻省总医院和哈佛医学院系统生物系的RalphWeissleder与JonathanCTCarlson教授联手开发了一种剪切加速的荧光团交换（SAFE）方法。此技术通过快速生物正交化学从标记细胞表面去除先前的免疫荧光信号探针，借以实现相同样品的循环荧光染色，实现了利用免疫荧光对活细胞或组织的多重成像。作者团队在活体小鼠外周血单个核细胞（PBMC）、肝组织和骨髓标本中展现了此技术的多色染色与多重成像能力，证明了其无毒性与强大功能。
总体思路：
图活细胞的多重时空分析
生物正交协同加速剪切：
提到生物正交技术的生物学应用就不得不面对两个挑战：（1）目前生物正交技术的常用浓度范围对于很多有机化合物而言是具有细胞毒性的；（2）强反应性的化合物通常是亚稳定或易快速降解的，这限制了它们在生物环境中的应用。为了避免这些问题，SAFE的设计利用了荧光猝灭剂BHQ3和Alexa荧光染料之间的协同作用，以在低无毒试剂浓度下快速开启/关闭标记抗体的荧光信号。
图合成、机理与动力学
SAFE使得活细胞循环染色成为可能：
图活细胞体系中快速、持久和无毒多重染色
SAFE使得活体组织循环染色成为可能：
虽然分散细胞的原位分析可以揭示复杂细胞群中的细胞相互作用，但活组织的多重成像将允许在完整的生物结构中可视化细胞动力学。为了探索SAFE在这种情况下的性能，我们从Mer酪氨酸激酶（MerTK）-GFP小鼠中制备了新鲜收获的肝脏切片。我们在三个周期内用SAFE修饰的抗体（抗CD8，CD4，CD11b，Ter119，CD45和MHC-I）染色新鲜的MerTK-GFP肝脏切片。成像结束时的亮钙黄绿素AM染色证实了循环后完整的组织活力，并添加了Hoechst作为核参考标记物。这些结果证明了SAFE在组织切片的循环成像中有着优异的表征细胞免疫表型能力。
图肝组织切片的SAFE成像
高空间分辨率下活体骨髓分化分析：
当多能干/祖细胞分化为成熟后代时，造血发育产生表型的多样性。高维度多重分析和单细胞基因表达/条形码技术追踪了造血谱系的发育层次。然而，在这些变化中直接观察骨髓细胞及其表面标记物的集合是不可能的。作为对SAFE分析活骨髓可行性的初步测试，我们对新鲜采集的小鼠骨髓细分析了12个免疫标记物（每个周期三个标记物，总共四个周期）。
CD8+细胞很少见，这表明非粘附性T细胞在这种染色形式中没有很好的保留。图像显示细胞群中存在红系（Ter119+）、淋巴系（CD19+）和髓系（CD11b+）亚群，也包括了跨功能分化谱的细胞。在高分辨率合成图像中，CD11b、Ly6C和Ly6G连续表达特征很明显（图5b），髓样前体（CD11b+和Ly6C+）呈蓝色/青色，成熟的Ly6G+中性粒细胞呈洋红色/红色。除了这些亚群之外，在四个完整的周期后，还可以观察到微不足道的细胞质信号，这表明在这种细胞背景下，精确、反复染色和剪切、淬灭前荧光信号是可行的。
图骨髓细胞群的SAFE成像
SAFE的长周期循环染色：
在第0天，如预期的那样所有的荧光细胞均为CD45阳性cKit阳性，其余细胞组为阴性细胞。到第2天，随着CD11b和Ly6C+细胞亚群的广泛上调，细胞数目迅速增长。活细胞密度在第4天达到峰值，同时出现明亮的Ly6G染色。由于分化的粒细胞寿命较短45，到第6天，种群密度略有下降，这与流式细胞术通常观察到的死亡细胞比例一致。在中性粒细胞选择性培养条件下，F4/80染色始终呈阴性，这与分化预期一致。
图嗜中性粒细胞分化的纵向分析
小结：
虽然已经探索了细胞内抗体传递的非致死性方法，但此类工具尚不能与常规免疫染色或多维度分析兼容；目前，这些局限性将SAFE多重分析限制在了仅仅对于活细胞和组织的细胞外标记。同样，目前的SAFE化学迭代依赖于清除分裂的染料，这是一个简单的细胞表面的靶点过程，但对于细胞质中的亲水性、膜不透性荧光团作用效果不够直接。
参考文献：
JinaKo,MartinWilkovitsch,JuhyunOh,etal.Spatiotemporalmultiplexedimmunofluorescenceimagingoflivingcellsandtissueswithbioorthogonalcyclingoffluorescentprobes.NatBiotechnol.2022Jun2.