四川省肠出血性大肠埃希菌（EHEC）O157:H7感染性腹泻疫情处置技术方案
2018/07/13
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感染性腹泻广义系指各种病原体肠道感染引起腹泻。其临床表现均可有腹痛、腹泻，并可有发热、恶心、呕吐等症状；处理原则亦相似，但不同病原体引起之腹泻，在流行病学、发病机理、临床表现及治疗上又有不同特点。肠出血性大肠埃希菌（EHEC）O157:H7感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病。它除引起腹泻、出血性肠炎外，还可引起溶血性尿毒综合征、血栓性血小板减少性紫癜等严重的并发症。自1999年我国部分地区发生了肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157:H7感染性腹泻的暴发，表明肠出血性大肠埃希菌（EHEC）O157:H7感染性腹泻已成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。为系统开展肠出血性大肠埃希菌O157:H7感染性腹泻监测工作，提高我省、市疾控机构的感染性腹泻监测诊断能力，加强肠出血性大肠埃希菌O157:H7感染性腹泻暴发疫情控制工作，制定本方案。
一、概述
（一）病原学
肠出血性大肠埃希菌（EHEC）O157:H7属于肠埃希菌科埃希属，G-埃希菌，对酸的抵抗力较强，但该菌不耐热，对含氯消毒剂敏感，导致人感染的剂量较低，仅需10-100个菌细胞。
（二）流行病学
1.传染源
被大肠埃希菌（EHEC）O157:H7感染的人和动物是主要传染源，无症状携带者可能在传播上起主要作用。
2．传播途径
大肠埃希菌（EHEC）O157:H7感染是一种食源性传染病，主要通过食品进行消化道传播，与患者的密切接触也可传播，苍蝇等媒介生物也可机械传播。
3．易感人群
人群普遍易感，男女均可发病，病后无持久免疫力。儿童和老人比较易感，暴发往往发生在幼儿园、托儿所、敬老院、学校等。
4．流行特征
全年均可发病，但有明显季节性，7-8月为发病高峰。
（三）临床表现
大肠埃希菌（EHEC）O157:H7感染的潜伏期一般为3-7天，包括无症状感染、轻度腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒综合征、血栓性血小板减少性紫癜等。
1.出血性肠炎
腹部剧烈疼痛、先期水样便、继而有类似下消化道出血的血性粪便、低热或不发热。
2.溶血性尿毒综合征
急性肾衰、血小板减少症、微血管异常溶血性贫血。前驱症状是血性腹泻或腹痛，每日泻2-5次，严重者可发热。无脓血便和里急后重症状。
3.血栓性血小板减少性紫癜
40％的患者：发热、血小板减少症、微血管异常溶血性贫血、肾功能异常和NS症状，病情发展迅速，90天内有70％的病人死亡。
（四）诊断标准
1.疑似病例
符合以下条件之一者，即可诊断为疑似病例。
（1）有鲜血便、低热或不发热、痉挛性腹痛的腹泻病例。
（2）腹泻若干天后继发少尿或无尿等表现的急性肾功能衰竭病例。
（3）腹泻病人粪便标本O157抗原免疫胶体金方法检测阳性者。
2.临床诊断病例
3.确诊病例
疑似病例或其他腹泻患者，具有以下条件之一者即为确诊病例。
（1）从粪便标本中检出产生志贺毒素的肠出血性大肠埃希菌O157:H7;或恢复期血清O157脂多糖（LPS）IgG抗体呈4倍升高;或经蛋白印记试验证实血清标本有与O157LPS、或肠出血性大肠埃希菌溶血素、或志贺毒素分子量一致的特异性抗体；
（2）腹泻病例的粪便中分离出不产生志贺毒素1或志贺毒素2以及其变种的肠出血性大肠埃希菌O157:H7，亦为确诊病例（不产毒）。
（五）治疗原则
对症支持治疗，预防发生溶血性尿毒综合征，降低病死率。可以使用微生态制剂，原则上不用止泻药和抑制肠蠕动的药物。
二、发现与报告
（一）发现
通过常规疫情监测、腹泻病门诊、疾病监测点、应急监测和社会信息等渠道发现病例和疫情。
（二）常规病例报告
各级各类医疗机构、疾病预防控制机构、卫生检验机构执行职务的医务人员发现肠出血性大肠埃希菌O157:H7感染性腹泻病例或疑似病例后，按照《中华人民共和国传染病防治法》和《传染病信息报告管理规范》，实行网络报告的单位应于24小时内进行
网络直报，未实行网络报告的单位应于24小时内寄出传染病报告卡。
(三)突发公共卫生事件报告
1.报告标准
本地区新发现的肠出血性大肠埃希菌O157:H7感染性腹泻疑似病例、确诊病例以及临床符合病例。
（2）事件报告
①一般突发公共卫生事件（Ⅳ级）：在县（区）域内1周发现3例以下。
②较大突发公共卫生事件（Ⅲ级）：在县（区）域内1周发现3例以上，或疫情波及2个及以上县；或地级以上城市的市区首次发生。
③重大突发公共卫生事件（Ⅱ级）：波及2个以上县（市），1周内发病水平超过前5年同期平均发病水平2倍以上。
2.报告内容
三、现场调查
（一）病例个案调查
主要为了查明患者发病原因，对病人、疑似病人应调查了解其基本情况、发病情况，重点是发病前的饮食史、活动史、同类病人接触史。调查同时一并填写感染性腹泻个案调查表。
（二）暴发疫情调查
1.组织与准备
（1）组织及实施疫情发生地的疾控中心应在接到疫情报告后2小时开展流调，及时采取相应预防、控制措施，并将调查结果及时向同级卫生行政部门和上级疾控机构报告。根据需要，可请求上级部门给予技术支持和指导。
（2）调查准备调查单位应迅速成立现场调查组，制定流行病学调查计划，明确调查目的、调查组人员组成，确定成员的任务及职责。
2.调查内容和方法
（1）背景资料收集
①当地地理、气象、人口等资料的收集
②当地家禽家畜饲养、食用等资料的收集
（3）病例搜索和流行病学调查在当地主要医疗机构和个体诊所采用查看门诊日志、检验登记本和住院病历等临床资料、入村入户调查等方式主动搜索腹泻病人。对搜索出的病例进行登记、随访、采样、检验以鉴别诊断。
对于搜索和报告的肠出血性大肠埃希菌O157:H7感染性腹泻病例(包括疑似、临床和实验室诊断病例)应及时开展流行病学调查和标本的采集。调查内容包括：病例基本情况、发病经过和就诊情况、临床表现、实验室检查、诊断和转归情况、居住地及家庭背景、个人暴露史、密切接触者情况及病家家禽家畜饲养死亡情况和家禽家畜粪便处理方式等。
①临床资料通过查阅病历及化验记录、询问诊治医生等方法，详细了解病例的临床表现、实验室检查结果、临床进程和治疗进展等情况。
③病例及家庭的饮水、饮食习惯病家饮用水源：水井、水塘、自来水等；厨房位置、卫生状况、食品储存、加工方式情况；饮水、饮食习惯；水源、厨房和厕所的地理位置。
④病例活动史、接触史及暴露史发病前7d内活动时问、地点和范围，有无参加聚餐等活动。
（4）流行因素调查
①分析资料：描述疾病的“三间分布”
地区分布：通过描述发病的地区分布，绘制标点地图，看其是否有地区聚集性或波及多个地区，从而对疫点(疫区)的划分提供依据。
根据病因假设，采用病例对照研究等方法，编制调查表，调查病例和对照可疑饮食史，通过比较可疑食品等在两组中差异，验证假设。
四、实验室检测
(一)标本的采集
标本的采集应该与流行病学调查工作紧密结合，包括对病人、疑似病人、密切接触者及宿主动物进行采样。采集的标本可以是粪便、肛拭子等，其中应以粪便为主，特别是采集病人血性水样便更加有意义，同时由于要进行病原分离，因此尽可能在未使用药物之前采集。
(二)标本的运送
腹泻病人血性水样便从采集到送检不得超过24h，采集的标本应插入Cary—B1ai半固体运送培养基中，立即送实验室接种。培养基要定期调换，保持培养液新鲜。水、食品、动物宿主粪便、环境标本采集后，应在24h内送至实验室进行增菌、培养、分离。
(三)标本的检测
肠出血性大肠埃希菌O157:H7经增菌后使用免疫磁珠富集技术和山梨醇麦康凯琼脂或科玛嘉琼脂分离（详见附件）。
五、防控措施
采取以切断传播途径为主的综合性防治措施。
（一）隔离治疗病人和带菌者
肠出血性大肠埃希菌O157:H7感染性腹泻病例、疑似病例和带菌者进行隔离治疗。对患病或带菌的动物实行集中圈养，粪便要进行严格的消毒处理。
（二）划定疫点、疫区
根据调查和监测得到的信息，确定暴发或流行的影响范围和波及人群，有利于发现感染源，使疫情调查处理工作目标更加明确。
（三）做好各项消毒工作
对病人的排泄物需随时进行严格消毒和处理。对受到污染的用具、物品和场所等要分别予以消毒和处理。
l.随时消毒
对于吐泻物，按1体积吐泻物加l／5体积漂白粉搅拌均匀，消毒2h；成形粪便可加3％～5％甲酚皂溶液或3％漂白粉澄清液浸泡；吐泻物的容器用1％漂白粉澄清液浸泡2h；
餐具用1％漂白粉澄清液浸泡30min或煮沸10min；残余的需要消毒的食物，按1份食物加1／5体积的漂白粉搅拌均匀后消毒2h，或1％漂白粉澄清液浸泡2h，或煮沸10min；
对需要消毒的衣物，以3％甲酚皂溶液浸泡或喷雾方式消毒30min；
地面、家具、墙壁以及运送病人的交通工具等，以3％甲酚皂溶液喷雾、擦拭或洗刷；
对垃圾、厕所，用3％～5％甲酚皂溶液或3％漂白粉澄清液喷雾或洗刷；
2.终末消毒
在病家或发现带菌宿主动物的家庭要向病人或家属解释消毒目的、过程和注意事项，了解患者发病时居住和活动的场所、接触的物品以及吐泻物污染区域，宿主动物的活动范围及排泄物污染区域。
（四）开展三管一灭，切断传播途径
加强食品卫生监督监测取缔无营业执照的食品生产、经营单位。
加强对集中式供水水源的管理。
疫区的家禽、家畜要严格管理。
大力开展群众性的爱国卫生运动，消灭苍蝇孳生地。
（五）密切接触者的管理
对所有的密切接触者要限制其活动范围并进行观察，观察期限为5天。
（六）开展疾病的专项监测工作
根据发病特点，制定监测病例标准，建立运行有效的监测系统，以便及时发现新发病例。
（七）针对疫情的态势和人群，进行有针对性的健康教育。
六、现场保障措施
（一）培训与演练
在肠出血性大肠埃希菌O157:H7感染性腹泻高发季节或流行期内，各级疾控机构应开展流行病学、实验室检测技术、病原学等方面新技术、新方法的培训，同时，开展专项应急处置演练。
（二）组织领导
根据疫情应急处理工作的需要和事件的级别疾控机构应组建现场疫情处理小组。
（三）应急处理物品及器械准备
1.实验室与器械
2.培养基
3.诊断血清及试剂
4.标本采集和现场检测用品
（四）腹泻病门诊的开设
应在该病流行地区及周边地区开展腹泻病的监测工作，疾控机构要加强对腹泻病门诊的规范化指导，重点是腹泻病人规范登记、门诊与诊疗室要相对独立、设置合理，避免交叉感染。
七、附表及附件
（一）附表1年月省腹泻标本登记表
（二）附表2省年月肠出血性大肠埃希菌O157:H7感染性腹泻病例个案表
（三）附件标本采集和运送以及现场和实验室检测
附表1
年月省感染性腹泻标本登记表
省送编码
病人姓名
性别
出生
日期
月龄
（月）
发病
入院
采样
标本体积
备注
填报单位：填报人：填报日期：
附表2
省年月肠出血性大肠埃希菌O157:H7感染性腹泻病例个案表
病例住院号□□□□□□□□标本编号□□□-□□□
1.一般情况
1.1患者姓名：
1.2性别：（1）男（2）女
1.3出生日期：年月日（阳历，若为阴历则在月份上加“1”）
1.4年龄（岁）：
1.5家庭住址（1）“城市”（2）“农村”
2.入院情况
2.1发病日期年月日
2.2入院日期年月日
2.3入院时患者生命体征：体温：（1）测量过，℃（2）未测量
脉搏：/分钟呼吸：/分钟血压：/mmHg
神志：（1）嗜睡（2）意识模糊（3）昏睡（4）昏迷（5）谵妄（6）清醒
2.4入院前腹泻天数天，平均每天腹泻次
2.5粪便性状（可多选）：（1）水样便（2）米泔样便（3）粘液便（4）脓血便
（5）洗肉样便（6）鲜血样便（7）黑便（8）其他
2.6入院前有无呕吐：（1）有（2）无（若无，则跳转至第2.7题）
2.6.1若有呕吐，则呕吐天，平均每天呕吐次
2.6.2若有呕吐，呕吐物性状为：（1）胃内容物（2）水样（3）血性呕吐物
2.7入院前是否采用口服补液治疗：(1)是（2）否
2.8入院前是否有其他明显的临床症状：
（1）呼吸道症状（2）神经系统症状（3）其他（4）无
2.9入院时是否做过粪便常规检测(1)是（2）否（若否，则跳转至第3.1题）
2.9.1若做过便常规，则检测结果为：WBCRBC
3.出院情况
3.1转归情况：（1）痊愈（2）好转
（3）死亡，原因（请根据死亡报告卡填写）（4）其它
3.2出院/死亡日期：年月日
4.标本采集信息
4.1是否收集标本：（1）是（2）否（若否，则结束此表的调查）
4.2收集标本日期：年月日
4.3该标本检测结果：（1）细菌；（2）病毒；（3）未检出阳性
4.4标本采集前患者是否使用抗生素：（1）是（2）否
填报人：调查日期：年月日
附件
标本采集和运送以及现场和实验室检测
（一）标本采集（不同样品的采集方法、包装、要求及注意事项等）
1．临床标本病人粪便样品的采集一般要求在发病早期，服用抗菌药物之前采集。亦可用棉拭子插入直肠内3～5cm处采取,应注意棉拭大小适宜，避免采便量过少，采集后棉拭子应清晰看到粘有粪便。病人的呕吐物，沾染粪便的衣物等亦可作为检材。
2．食品标本无菌采集有代表性的可疑食物，采集量应大于25g（ml）。
3．环境样品：炊事用具如锅、碗、刀、抹布、操作人员的手等用棉拭涂擦采样，菜墩用刀刮取表面后将刮取物放入灭菌容器中或mEC+n肉汤中。
所有样本在现场有条件情况下，可直接接种mEC+n增菌液或CT-SMAC、改良CHROMagarO157等选择平板和增菌液，也可将标本用Cary-Blair运送培养基中送检，每个样品均需做好标记和登记。
（二）现场检测（检测内容、方法、步骤等）
（三）标本运送/报送（运送及生物安全要求、注意事项等）
所有样品须放在4°C或低温环境下运送，尽快送达实验室。样品运送时必须严格按照生物安全运送指南进行运送。严格防止样品间的交叉污染。按疾病控制工作规范的有关规定运送，并确保安全。
（四）实验室检测（检测的方法、种类、程序、生物安全要求及注意事项；可以以附件的形式添加）
1．生物安全要求所有试验操作过程均应在2级生物安全柜内进行，并严格按照2级生物安全的有关操作规程进行操作。
2．分离培养
2.1样品处理：①食品样品：称取25g（ml）样品加入225mlmEC+n肉汤中，均质制成1:10样品均液，37℃18～24h培养，接种CT-SMAC或改良CHROMagarO157显色平板进行培养。②可疑病人样本及可疑病人污染的外环境样本：直接划种CT-SMAC或改良CHROMagarO157显色平板，同时接种mEC+n肉汤增菌18～24h，再次接种CT-SMAC或改良CHROMagarO157显色平板进行培养。③环境样本：接种mEC+n肉汤中增菌18～24h，然后接种CT-SMAC或改良CHROMagarO157显色平板进行培养。
2.2分离培养：将接种好的CT-SMAC或改良CHROMagarO157显色平板置37℃培养18～24h取出观察菌落形态，必要时将混合菌落在选择性平板上分纯。在CT-SMAC平板上，典型菌落为不发酵山梨醇的圆形、光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐色；发酵山梨醇的菌落为红色；在改良CHROMagarO157显色琼脂平板上为圆形、较小的菌落，中心呈淡紫色-紫红色，边缘无色或浅灰色。
3.生化鉴定
3.1初步生化试验
在CT-SMAC和改良CHROMagarO157显色琼脂平板上挑取5个～10个典型或可疑菌落，分别接种TSI琼脂，同时接种MUG-LST肉汤，于36℃±1℃培养18h～24h。必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。在TSI琼脂中，典型菌株为斜面与底层均呈阳性反应呈黄色，产气或不产气，不产生H2S。置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察，无荧光产生者为阳性结果，有荧光产生者为阴性结果；对分解乳糖且无荧光的菌株，在营养琼脂平板上分纯，于36℃±1℃培养18h～24h，并进行下列鉴定。
3.2鉴定
3.2.1血清学试验在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落，用O157:H7标准血清或O157乳胶凝集试剂作玻片凝集试验。对于H7因子血清不凝集者，应穿刺接种半固体琼脂，检查动力，经连续传代3次，动力试验阴性，H7因子血清凝集阴性者，确定为无动力株。
3.2.2生化试验可以使用API20E生化鉴定试剂盒或VITEK-GNI+检测卡，按照生产商提供的使用说明进行。大肠埃希氏菌O157:H7/NM生化反应特征见表1。
表1大肠埃希氏菌O157:H7/NM生化反应特征
生化试验
特征反应
三糖铁琼脂
＋，H2S－
山梨醇
－或迟缓发酵
靛基质
＋
MR-VP
MR＋，VP－
氧化酶
－
西蒙氏柠檬酸盐
赖氨酸脱羧酶
＋（紫色）
鸟氨酸脱羧酶
纤维二糖发酵
棉子糖发酵
MUG试验
动力试验
＋/－
注：＋阳性，－阴性；＋（－）多数阳性,少数阴性；＋/－阳性或阴性；三糖铁琼脂酸性反应为阳性，碱性反应为阴性
4.结果报告
综合生化和血清学的试验结果，报告样品中检出或未检出大肠埃希氏菌O157:H7/NM。在样品中检出O157:H7或O157:NM时，如需要进一步检测Vero细胞毒素基因的存在，可通过接种Vero细胞或Hela细胞，观察细胞病变进行判定，也可使用基因探针检测和聚合酶链反应（PCR）方法或送参考实验室进行志贺氏毒素基因（stx1、stx2）、eae、hly基因等的检测。
5.快速检测方法
5.1全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法
5.1.2操作步骤
1）前增菌
以无菌操作取检样加到mEC+n肉汤中，食品样品取25g(mL)加入到含有225mLmEC+n肉汤的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min～2min；或放入盛有225mLmEC+n肉汤的均质杯中，8000rpm～10000rpm均质1min～2min。其余样品和肉汤的比例为1：10混匀后，于36℃±1℃培养6h～7h。同时做阳性及阴性对照。
2）增菌与处理
取1ml前增菌肉汤接种于9ml改良麦康凯肉汤（CT-MAC），于36℃±1℃培养17h～19h。
然后取1ml增菌的CT-MAC肉汤加入试管中，在100℃水浴中加热15分钟。剩余增菌肉汤存于2℃-8℃，以备对阳性检测结果确认。
3）上机操作
4）输入MLE卡信息
每个试剂盒在使用之前，首先要用试剂盒中的MLE卡向仪器输入试剂规格（或曲线数据）。每盒试剂只需输入一次。
5）校正
在输入MLE卡信息后，使用试剂盒内的校正液进行校正，校正必须做双份测试。以后每14天进行一次校正。
6）检测
取出试剂条，待恢复至室温后进行样本编号。
建立worklist，输入样本编号。
分别吸取500μL对照和样本（冷却至室温）加入到试剂条样本孔中央。依屏幕提示，将试剂条放入仪器相应的位置。
所有分析过程均由仪器自动完成。检测约需45min。
7）结果报告
检测值则是由每份样本的相对荧光值（RVF）与标准溶液RVF相比得出。
检测值=样品RFV/标准RFV
检测值
解释
<0.10
30.10
注：＋阳性，－阴性
8）阳性结果的确认
用2.2、3.1和3.2对保存于2℃-8℃的增菌肉汤分离鉴定确认。
5.2全自动病原菌检测系统筛选法
5.2.1原理BAX系统利用多聚酶链反应（PCR）来扩增并检测细菌DNA中特异片段来判断目标菌是否存在。反应所需的引物、DNA聚合酶和核苷酸等被合并成为一个稳定、干燥的片剂，并装入PCR管中，检测系统运用荧光检测来分析PCR产物。每个PCR试剂片都包含有荧光染料，该染料能结合双链DNA，并且受光激发后发出荧光信号。在检测过程中，BAX系统通过测量荧光信号的变化，分析测量数据，从而判定阳性或阴性结果。
5.2.2操作步骤
1）增菌
同5.1.2。
2）上机操作
打开加热槽分别至37℃和95℃。检查冷藏过夜的冷却槽(4℃)。开机并启动BAX系统软件。如果仪器自检后建议校正，按屏幕提示进行校正操作。
创建“rack”文件：根据提示在完整的“rack”文件和“个样”资料中输入识别数据。
溶菌操作：在管架上放上标记好的溶菌管。在每个溶菌管加入200μL配制好的溶菌试剂。将每个增菌后的5μL样品加入相应的溶菌管中，盖上盖子。把管架放在37℃加热槽中20min。再将管架放在95℃的第2块加热槽中10min。最后将管架放在冷却槽上（冷却槽从冰箱取出后30min内使用完毕），样品冷却5min。
加热循环仪/检测仪：从菜单中选择“RUNFULLPROCESS”，加热到设定温度（热槽90℃，盖子100℃）。
溶菌产物转移：将PCR管支架放到专用冷却槽上，然后将PCR管放入到支架内。将所有的管盖放松并除去一排管盖。用多道加样器将50μL溶菌产物加入此排管中，并用替代的透明盖密封PCR管。换用新吸头，重复上述操作，直至将所有样品转入PCR管中。
扩增和检测：按“PCRWizard”的屏幕提示,将转移后的PCR管放入PCR仪/检测仪中开始扩增。全过程（扩增和检测）需要大约3.5h。当检测完成后，“PCRWizard”提示取出样品，并自动显示结果。