虽然CAR和TCR修饰的T细胞已经对少数血癌起到了转变，但很明显，它们目前的临床应用只代表了这项技术可能提供的可能性的一小部分。
CAR-T或TCR-T望而却步？特异性CAR或TCRmRNA-纳米颗粒-T细胞的重复输注可消退疾病
图1如何使用聚合物纳米颗粒携带的IVTmRNA原位重新编程T细胞以表达疾病特异性CARs或TCRs的示意图。这些颗粒表面覆盖有靶向细胞毒性T细胞的配体，因此一旦它们被注入患者的循环，就可以将它们携带的转基因转移到淋巴细胞中，并瞬时对细胞进行编程以表达其疾病特异性CAR或TCR在其表面上。
目前，通过基因转移将CAR或TCR插入淋巴细胞中是在患者体外的专门制造车间中进行的，但将细胞往返于洁净室的过程和基因转移程序本身都是劳动强度大、成本高、耗时宝贵的过程。如果工程T细胞疗法达到其扩展到各种癌症类型的不同人群的承诺，经济和制造方面的挑战可能会增加。
这里证明了mRNA纳米药物可以通过现成药物的便利性实现有效的、无副作用的细胞治疗的能力。就像传统药物一样，有了这种新的治疗方式，只要医疗需要，患者就可以很容易地重新给药。
CAR或TCR基因mRNA纳米载体转染T细胞
图2淋巴细胞编程纳米颗粒的设计与制造。a：实验中使用的T细胞靶向IVTmRNA纳米载体的示意图。为了创造一种可以简单地通过接触来修饰原代T淋巴细胞(非病毒感染方法难以实现的)的试剂，设计了由4种功能成分组成的聚合物纳米颗粒：(i)表面锚定的靶向配体，它选择性地将纳米颗粒与T细胞结合并启动快速受体诱导的内吞作用使其内化。实验中使用了anti-CD8抗体；(ii)带负电荷的涂层，它通过减少纳米颗粒的表面电荷来屏蔽纳米颗粒，以最大限度地减少脱靶结合。由于它已经被广泛用于药物输送平台，选择了聚谷氨酸(PGA)来实现这一点；(iii)载体基质，它当核酸在内吞体内时凝聚并防止核酸被酶降解，但一旦颗粒被输送到细胞质中就会释放它们从而使编码的蛋白质能够翻译。为此，使用了可生物降解的聚(β-氨基酯)(PBAE)聚合物配方，其在水条件下的半衰期在1-7h之间；(iv)包裹在载体中并产生疾病特异性CAR或TCR瞬时表达的核酸(IVTmRNA)。b：描述如何制造纳米颗粒。c：粒径分布，使用NanoSightNS300仪器测量。
图S1CD3靶向的mRNA纳米颗粒选择性转染人T细胞。
纳米颗粒重编程宿主T细胞识别白血病
完全免疫功能正常宿主的治疗反应
为了研究排他性靶向如何将纳米颗粒的相互作用限制在循环中的T细胞，以及它如何影响它们的命运，使用了完全免疫活性的Ai14报告鼠。在这个转基因模型中，所有细胞都含有loxP侧翼的终止盒，阻止CAG启动子驱动的tdTomato蛋白的转录。只有成功地转导了编码Cre重组酶(Cre)的mRNA的细胞才会切除loxP侧翼的终止盒，从而导致永久的tdTomato转录和随后强烈扩增的tdTomato表达。首先在注射CD3靶向(或同型对照功能化)携带CremRNA的纳米颗粒后测量了Ai14小鼠中整个器官的荧光。非靶向颗粒介导的基因表达在肝脏中最高，而淋巴细胞靶向纳米载体诱导的基因转移主要在脾、淋巴结和胸腺(图5a,b)。对脾进行的详细的流式细胞术分析(图5c)显示CD3靶向纳米颗粒优先转染T细胞(8.1±1.9%)，而不影响活性。其他CD45+亚型如巨噬细胞(3.2±1.5%)、B细胞(1.1±0.9%)、中性粒细胞(0.3±0.2%)和DC细胞(1.9±0.8%)的dtTomato信号水平较低。
图5免疫功能正常小鼠的有效T细胞靶向。B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J(Aireporter)小鼠每天静脉注射3剂载有15μgmRNA编码核定位信号(NLS)-Cre的纳米颗粒。使用全长抗CD3MuIgG2a或IgG2a同种型对照将纳米颗粒靶向小鼠T细胞。两种抗体都设计为LALAPG变体，以消除Fc受体结合和补体激活。最后一次注射后48h，收集器官并使用荧光IVIS成像测量全器官dtTomato荧光。脾脏和血液的单细胞悬液用针对各种免疫细胞亚型的抗体标记并通过流式细胞术进行分析。a：在荧光IVIS成像下器官中的代表性dtTomato表达。b：对每个器官的荧光信号进行量化。c：显示脾中免疫CD45+dtTomato+细胞类型的平均±SD百分比。检测巨噬细胞(CD45+、CD11b+、MHCII+、CD11c、Ly6C/Low、Ly6G)、B细胞(CD45+、B220+)、T细胞[CD4+T细胞(CD45+、TCRβ+、CD4+、CD8-)、CD8+T细胞(CD45+、TCRβ+、CD4、CD8+)、中性粒细胞(CD45+、CD11b+、MHCII+、CD11c、Ly6G+)和DC细胞(CD45+、CD11c+、CD11b、MHCII+)。
基于这些分布研究，接下来测试了测量的mRNA纳米颗粒重定向T细胞的数量是否足以减少完全免疫功能宿主中已建立的癌症。为此，将表达荧光素酶的Eμ-ALL01白血病细胞注入白化C57BL/6小鼠（在免疫功能正常小鼠中建立B细胞急性淋巴细胞白血病模型），并使用生物发光成像来量化治疗组之间肿瘤进展的差异(图6a)。小鼠要么接受CD3靶向纳米颗粒递送编码全鼠1928zCAR的mRNA，要么接受GFP对照(方法见图S2)。第三组未接受治疗。发现，只有输注编码1928zCAR的纳米载体才能有效地控制白血病的进展(图6b,c)，与GFP对照组相比，治疗三周后肿瘤负荷平均减少了26倍。
图S2抗CD3小鼠IgG2aLALA-PG和非结合子对照。
实体瘤的治疗反应
为了确定过继转移的T细胞和输注的mRNA纳米载体未能完全清除疾病的原因，用流式细胞术对复发的前列腺癌的抗原表型进行了鉴定。癌症中最常见的逃避策略之一是减少靶抗原的表达，因为CARs产生选择性压力。在临床前和临床研究中，当过继转移的仅针对单一抗原的T细胞用于治疗异种肿瘤(如转移性前列腺癌)时，这种现象都被报道为失败的原因。发现与在不同水平表达ROR1肿瘤抗原的未治疗的LNCaPC42前列腺癌相比，两个治疗组(过继转移的T细胞或纳米颗粒编程的T细胞)CAR靶向肿瘤最终产生了ROR1低/阴性免疫逃逸变体(图7i)。
HBV特异性T细胞的原位编程
图8使用载有TCR转基因的纳米颗粒对HBV特异性T细胞进行原位编程。a：建立了HBV诱导的HCC小鼠异种移植瘤模型。用HBcAg和荧光素酶稳定转导的HepG2细胞通过外科手术注射到用人T细胞重建的NSG小鼠的肝脏中。植入后三周，通过体内生物发光成像观察HepG2肿瘤，并将其分配到纳米颗粒组(每周6次50μg编码HBcore18-17TCRmRNA的剂量)或T细胞治疗组(用编码HBcore18-17TCR的慢病毒体外转导5×10^6T细胞)。b，c：治疗开始6周后生物发光肝脏信号的定量。d：治疗开始后18天从肝脏中回收细胞的多色流式细胞术。通过CD45、CD8和MHCPentamer的阳性标记来鉴定过继转移或原位编程的HBcore18-27TCR+T细胞。绝对数显示在e中，活细胞(台盼蓝阴性)的总细胞计数乘以HBcore18–27TCR+、CD8+和CD45+的百分比。
总之，结果表明，重复输注T细胞靶向聚合物纳米载体可以将肿瘤特异性CAR或病毒特异性TCR转基因递送到足够数量的宿主T细胞中，以类似于体外工程淋巴细胞团注的水平诱导疾病消退。
T细胞编程纳米颗粒具有生物相容性
图9可能的输注反应的体外分析。a：理论血浆浓度的计算。b：T细胞靶向mRNA纳米颗粒的溶血活性。c：用酶免疫分析法定量测定补体活化。相对于阴性PBS对照的2倍变化被定义为测定阈值(虚线)。d：NP转染后淋巴细胞线粒体氧化应激反应的研究。
图10输注纳米载体与急性全身毒性无关。雌性SD大鼠静脉注射编码1928zCAR的CD8靶向IVTmRNA，48h后由委员会认证的病理学家以盲法方式进行全面的组织病理学评价和血清化学分析。a：从对照或纳米颗粒处理的动物中分离出来的各种器官的代表性的H&E染色切片。b：血细胞计数。c：血清化学。d：血清TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子的检测。
总结
在这里，探索了使用IVTmRNA来快速和特异性地将抗原识别能力编程到循环T细胞中作为治疗癌症和传染病的策略。与DNA纳米载体相比，合成的mRNA分子不需要进入细胞核直接翻译为治疗靶蛋白，确保了高转染率和快速治疗效果。它们的剪裁大小(该研究中实际的CAR编码或TCR编码序列+276个碱基的5‘UTR和polyA区)导致了每个纳米颗粒的高拷贝数。此外，由于递送的mRNA在细胞质中发挥其功能，因此避免了不受控制的插入突变和启动子依赖。这里证明，简单注射设计合理的mRNA纳米载体可以选择性地将CAR基因或TCR基因导入宿主T细胞，并对其进行编程，使其数量足以导致疾病消退，其有效性类似于过继方法。几项正在进行的临床试验正在测试在癌症患者中重复输注体外工程的mRNACAR-T细胞(NCT01355965，NCT01897415，NCT02277522和NCT02624258)，并且第一个数据表明细胞输注后瞬时的CAR表达足以引发抗肿瘤反应。
为了将循环中的T细胞原位重定向到常驻肿瘤细胞，几家生物技术制药商已经开发出双特异性抗体，包括BiTEs、DART和diabodies。其中，blinatumomab(一种CD19特异性BiTE)在血液系统恶性肿瘤患者的临床研究中显示出令人鼓舞的结果。然而，BiTEs必须连续输注，这会产生全身毒性。此外，与传统的单抗一样，BiTE在输注后不会进行主动的生物分布或自我扩增。相比之下，这里描述的基于纳米颗粒的基因修饰系统可以产生新生肿瘤特异性T细胞，作为一种“活药”，它主动定位于靶点，数量增加，并连续摧毁癌细胞。人们对CAR-T细胞疗法的兴趣依然浓厚，因此现在是时候推出现成纳米试剂作为一种竞争技术，它可以快速重新编程T细胞，识别和破坏肿瘤，而不需要实验室操作。
在对人类进行临床研究之前，将参照FDA关于纳米药物的规定，扩大与NCL的合作，以确认纳米颗粒在大型动物物种中的安全性。与已在临床上建立的治疗方法(如小分子或抗体)不同，CAR编程纳米颗粒是多组分的三维结构，需要可重复的制造工艺才能可靠地实现预期的物理化学特征、生物学行为和药理学特征。这种纳米药物的安全性和有效性可能会受到许多参数微小变化的影响，需要仔细监测，特别是在靶向非预期部位和潜在毒性的情况下。此外，与传统药物相比，纳米药物需要额外的开发和监管考虑。
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