运动功能及炎性和氧化应激反应的影响
代妮，黄思琴，唐成林，谭程方，代攀，曾婷婷，朱正威，杨之雪
(重庆医科大学中医药学院，重庆400016)
【KEYWORDS】Spinalcordinjury;Electroacupuncture;Hindlimblocomotionfunction;ApolipoproteinE;Nrf2/HO1antioxidantpathway;NucleartranscriptionfactorκB;Astrocyte
1材料与方法
1.1实验动物与分组
健康雌性C57BL/6小鼠36只，体质量18~22g，由重庆医科大学实验动物中心提供[清洁级，许可证号：SCXK(渝)2012-0002]。代养于重庆医科大学实验动物中心SPF级动物房，分笼饲养，室温20~24℃，相对湿度45%~55%，明暗12h交替，垫料每日更换，自由摄食、饮水。适应性喂养1周后，随机分为假手术组、模型组和电针组，每组12只。整个实验过程中对动物处置符合重庆医科大学伦理委员会标准。
1.2主要试剂与仪器
1.3造模方法
小鼠称重后用1%戊巴比妥钠(0.08mL/10g)腹腔注射麻醉，俯卧位固定。于后正中线做纵向切口，钝性剥离肌肉暴露出棘突、椎板和横突，行第1腰椎(L1)椎板切除术，充分暴露L1对应的脊髓。改进Paterniti等建立的SCI模型：采用血管夹钳夹该段脊髓25s，造成该段脊髓重度损伤。0.9%氯化钠溶液冲洗清除残留血液，逐层缝合伤口。麻醉苏醒后，小鼠双后肢瘫痪，大小便失禁，即为造模成功。术后每日帮助排尿，3次/d，至小鼠恢复自行排尿，并做好抗感染工作。假手术组小鼠仅行L1椎板切除术，不损伤脊髓。
1.4干预方法
电针组：造模后3h，将小鼠俯卧位固定，根据小鼠常用针灸穴位[15]定位进行针刺，选取双侧“足三里”“三阴交”穴进行电针治疗，直刺3~5mm，同侧“足三里”和“三阴交”穴连接电针仪的一对正负电极，疏密波(1.5Hz/7.5Hz，疏波5s，密波10s)，强度以小鼠后肢轻微震颤为度(约1.0mA)，每日1次，每次10min，连续治疗7d。
假手术组和模型组：仅采用相同方法固定，每日10min。
1.5观察指标及检测方法
BMS评分(BassoMouseScale)：于造模前1d和造模后第1、7天对小鼠后肢运动功能进行评分。观察小鼠后肢踝关节活动度、协调性、脚爪姿态、躯干稳定性和尾巴姿态。评分为0~9分，评分越低运动功能障碍越重。评分由两名熟悉评分标准但非本课题组人员独立进行，每只小鼠观察5min，取两者平均数作为被测小鼠的最终得分。
HE染色观察脊髓组织完整性及炎性浸润程度：造模后第7天，每组各取6只小鼠，4%水合氯醛(0.1mL/10g)腹腔注射麻醉，0.01mol/LPBS和4%多聚甲醛经左心室快速灌注固定，取下损伤脊髓(距损伤中心0.5cm)，4%多聚甲醛后固定12h，常规脱水，石蜡包埋，连续横向切片，厚度6μm，室温保存。检测时，切片脱蜡、水化后，行常规HE染色，光镜下观察。
Westernblot法检测损伤脊髓中ApoE、pNFκB、IL1β、pERK1/2、ERK1/2、Nrf2、HO1蛋白的表达：造模后第7天，每组各取6只小鼠，4%水合氯醛(0.1mL/10g)腹腔注射麻醉后，快速取下损伤脊髓(距损伤中心0.5cm)，液氮速冻1h后保存于-80℃。检测时经过称量、裂解、匀浆、离心提取总蛋白;BCA蛋白浓度测定法测得浓度后，加入上样缓冲液制成蛋白样品;10%SDSPAGE凝胶电泳后转到PVDF膜上;室温封闭2h;加入ApoE、pNFκB、IL1β、pERK1/2、ERK1/2、Nrf2、HO1抗体4℃过夜;对应二抗室温摇床孵育1h;滴加ECL化学发光液，暗室曝光1min，IMAGESTUDIO成像系统采集图像，ImageJ分析并计算相对表达量(相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值)。
免疫荧光染色法检测脊髓损伤区星形胶质细胞的增生程度：检测时，取上述方法制备的石蜡切片进行脱蜡、水化，枸橼酸钠热修复法抗原修复20min，37℃封闭1h，GFAP抗体4℃下孵育过夜。次日复温冲洗后，CY3荧光标记羊抗兔IgG(H+L)二抗37℃孵育1h。PBS冲洗后加抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜400倍下采图，每张切片选取3个视野，ImageJ分析并计算GFAP阳性细胞数。
1.6统计学分析
采用GraphaPadPrism5.0对数据进行统计学处理。实验数据采用均数±标准差(
±s)表示。组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较用Bonferroni检验。P≤0.05为差异有统计学意义的标准。
2结果
2.1各组小鼠BMS评分比较
造模前，假手术组、模型组和电针组间小鼠BMS评分差异无统计学意义(P>0.05)。造模后第1天，与假手术组比较，模型组小鼠BMS评分显著下降(P<0.05)，电针组与模型组间差异无统计学意义(p>0.05)。造模后第7天，与假手术组比较，模型组小鼠BMS评分显著下降(P<0.05)，与模型组比较，电针组小鼠BMS评分显著升高(P<0.05)。见图1。
2.2各组小鼠脊髓损伤区病理形态学的比较
假手术组小鼠脊髓结构完整，神经元形态正常，胞质丰富。模型组小鼠脊髓结构紊乱，出现大量的空腔，炎性浸润严重，存在大量炎性细胞，正常神经元大量减少。电针组小鼠脊髓结构较完整，炎性浸润程度较轻，炎性细胞较少，正常神经元较多。见图2。
2.3各组小鼠脊髓中ApoE表达的比较
造模后第7天，与假手术组比较，模型组小鼠脊髓中ApoE的表达显著增高(P<0.05);与模型组比较，电针组小鼠脊髓中ApoE的表达显著增高(P<0.05)。见图3。
2.4各组小鼠脊髓中pNFκB、IL1β表达的比较
造模后第7天，与假手术组比较，模型组小鼠脊髓中pNFκB、IL1β的表达显著增高(P<0.05);与模型组比较，电针组小鼠脊髓中pNFκB、IL1β的表达显著下降(P<0.05)。见图4。
2.5各组小鼠脊髓中pERK1/2、ERK1/2、Nrf2、HO1表达的比较
造模后第7天，与假手术组比较，模型组小鼠脊髓中pERK1/2、Nrf2、HO1的表达显著升高(P<0.05)，erk1p=''>0.05)。与模型组比较，电针组小鼠脊髓中pERK1/2、Nrf2、HO1的表达显著升高(P<0.05)，erk1p=''>0.05)。见图5。
2.6各组小鼠脊髓中GFAP阳性表达的星形胶质细胞比较
假手术组小鼠脊髓中均匀散在分布着GFAP阳性表达的星形胶质细胞。与假手术组比较，模型组小鼠脊髓中GFAP阳性表达的星形胶质细胞数量显著增加(P<0.05)。与模型组比较，电针组小鼠脊髓中GFAP阳性表达的星形胶质细胞数量显著减少(P<0.05)。见图6。
3讨论
综上所述，电针能够改善小鼠SCI后的炎性反应与氧化应激反应，抑制反应性星形胶质细胞过度增生，从而促进脊髓结构及功能的修复。其作用机制可能与上调ApoE的表达，增强Nrf2/HO1抗氧化途径和抑制NFκB激活有关。（选自《针刺研究》杂志2019年第11期）