本申请要求于2014年02月14日提交的美国临时专利申请号61/940,275和2014年07月11日提交的美国临时专利申请号62/023,773的权益，这两篇文献的发明名称均为“作为治疗剂的人雄激素受体二聚体结合结构域(DBD)化合物及其使用方法”。
技术领域
本发明涉及治疗化合物和组合物及其用于治疗各种适应证、包括各种癌症的方法。特别地，本发明涉及用于治疗癌症、例如前列腺癌的疗法和方法。
背景
AR具有所有核受体的模块化组成特征。它由N-末端结构域(NTD)、中心DNA结合结构域(DBD)、段铰链区和C-末端结构域构成，所述C-末端结构域包含激素配体结合袋(配体结合结构域，其还包含激素结合位点(HBS))和活化功能-2(AF2)位点(Gao，W.Q.等人Chem.Rev.(2005)105：3352-3370)。后者代表以正电荷和负电荷区为侧翼的AR表面上的疏水性沟-“电荷夹”，它们对于结合AR活化因子而言是有效的(Zhou，X.E.等人J.Biol.Chem.(2010)285：9161-9171)。近期研究已经鉴定了在AR上称作结合功能3(BF3)的新位点，其牵涉AR转录活性。当AR被易位入核时，DBD二聚化并且结合雄激素效应元件(AREs)，且由此诱导转录，这是对于野生型AR和AR剪接变体的AR转录的必需过程。重要地，结合AREs的ARDBD二聚体的晶体结构是可得到的，这启示鉴定具有通过经基于合理的结构的药物设计靶向ARDBD的新机制的小分子抑制剂的可能性和易操作性。此外，因为迄今为止研究的所有抗性机制仍然牵涉AR结合至DNA且DBD以野生型AR和剪接变体存在，所以靶向DBD代表了克服抗性的新方法。
活化AR遵循得到充分表征的途径：在细胞质中，该受体结合维持AR激动剂结合构象的伴侣蛋白质(Georget，V.等人Biochemistry(2002)41：11824-11831)。在结合雄激素时，AR进行一系列的构象改变：从伴侣蛋白中解离、二聚化并且易位入核(Fang，Y.F.等人J.Biol.Chem.(1996)271：28697-28702；和Wong，C.I.等人J.Biol.Chem.(1993)268：19004-19012)，其中它进一步与AF2位点上的辅激活因子蛋白发生相互作用(Zhou，X.E.等人J.Biol.Chem.(2010)285：9161-9171)。该事件触发RNA聚合酶II和其它因子募集以便与AR形成功能转录复合物。
值得注意地，目前的抗雄激素药例如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特和MDV3100均靶向这种特定过程。这些抗雄激素药通过结合AR配体结合位点起作用。因此，通过防止雄激素结合，它们还防止了对于辅激活因子相互作用所必需的受体的构象改变。尽管用这些AR抑制剂治疗最初可以抑制前列腺癌生长，但是长期激素疗法逐渐变成有效性降低(Taplin，M.E.等人J.Clin.Oncol.(2003)21：2673-8；和Tilley，W.D.等人CancerRes.(1994)54：4096-4102)。因此，对于用于治疗癌症的靶向AR的另外的化合物存在显著性的需求。
概述
本发明部分基于如下令人意外的发现：本文所述的化合物调节雄激素受体(AR)活性。具体地，本文鉴定的化合物显示调节雄激素受体DNA-结合结构域(DBD)。
根据一个实施方案，提供具有式I的结构的化合物，其中
A可以是
根据另一个实施方案，提供本文所述的化合物在制备用于调节AR活性的药剂中的用途。
根据另一个实施方案，提供本文所述的权利要求11-21的化合物在调节AR活性中的用途。
根据另一个实施方案，提供本文所述的用于调节AR活性的化合物。
根据另一个实施方案，提供药物组合物，其包含本文所述的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
根据另一个实施方案，提供商品包装，其包含本文所述的化合物和用于调节AR活性的说明书。
根据另一个实施方案，提供具有式II的结构的化合物，其中Q可以是M1可以是H、CH3、F、SO2CH3、OCH3、OH、NO2或NH2；M2可以是H、CH3、F、SO2CH3、OCH3、OH、NO2或NH2；M3可以是H、CH3、F、SO2CH3、OCH3、OH、NO2或NH2；且M4可以是H、CH3、F、SO2CH3、OCH3、OH、NO2或NH2；
条件是该化合物不是表1系列2部分中的化合物中除了化合物14409之外的一个或多个。该化合物可以是
根据另一个实施方案，提供调节AR活性的方法，该方法包括对有此需要的受试者施用具有式的结构II的化合物：其中Q可以是M1可以是H、CH3、F、SO2CH3、OCH3、OH、NO2或NH2；M2可以是H、CH3、F、SO2CH3、OCH3、OH、NO2或NH2；M3可以是H、CH3、F、SO2CH3、OCH3、OH、NO2或NH2；且M4可以是H、CH3、F、SO2CH3、OCH3、OH、NO2或NH2。
根据另一个实施方案，提供调节AR活性的方法，该方法包括对有此需要的受试者施用表1-系列3-6中列出的化合物。
根据另一个实施方案，提供一组用于调节AR活性的本文所述的化合物。
根据另一个实施方案，提供药物组合物，该药物组合物包含本文所述的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
根据另一个实施方案，提供表1-系列3-6中列出的化合物在制备用于调节AR活性的药剂中的用途。
根据另一个实施方案，提供表1-系列3-6中列出的化合物在调节AR活性中的用途。
根据另一个实施方案，提供药物组合物，其包含如表1-系列3-6中列出的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
根据另一个实施方案，提供商品包装，其包含如表1-系列3-6中列出的化合物和用于调节AR活性的说明书。
该化合物可以选自如下化合物中的一个或多个：
根据一个实施方案，提供具有选自表1或权利要求中所述的结构的化合物或其药学上可接受的盐的用途。
根据另一个实施方案，提供具有选自表1或权利要求中所述的结构的化合物或其药学上可接受的盐的用途。
根据另一个实施方案，提供药物组合物，其包含本文举出的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂。
根据另一个实施方案，提供用于调节AR活性的方法，该方法包括对哺乳动物细胞施用本文举出的化合物或其药学上可接受的盐。
根据另一个实施方案，提供用于调节雄激素受体(AR)活性的药物组合物，其包含如本文所述的化合物和药学上可接受的载体。
根据另一个实施方案，提供商品包装，其包含(a)本文所述的化合物或本文所述的药物组合物；和(b)其用于调节雄激素受体(AR)活性的使用说明书。
所述哺乳动物细胞可以是人细胞。该细胞可以是前列腺细胞。该细胞可以是前列腺癌细胞。
根据另一个实施方案，提供具有选自表1或权利要求中所述的结构的化合物。
附图简述
图1显示剂量响应曲线(0-12.5μM)，其示例使用eGFP(A)和PSA(B)测定法、在R1881的存在下14368对LNCaP细胞中AR转录活性的抑制。(C)无R1881存在下14368对LNCaP细胞中的AR转录的活化。值1相当于来自用0.1nMR1881刺激的LNCAP细胞的eGFP信号。显示用WT-AR(D)或T877A-AR突变体(E)瞬时转染的PC3细胞中AR转录活性的荧光素酶报道分子。用14368或恩杂鲁胺(Enzalutamide)(Enz)在R1881刺激的存在下无其刺激的存在下处理细胞。数据点表示三次独立实验的平均值±SEM。100％是指仅用0.1％DMSO记录的发光。(F)14368和比卡鲁胺(Bic)在0.1nMR1881的存在下对R1-AD1细胞中内源性野生型AR的抑制。
图2左侧小组：14368、14435、14436、14439、14404和比卡鲁胺(Bic)、使用eGFPAR转录测定法、在0.1nMR1881的存在下对AR转录抑制的剂量响应曲线。右侧小组：用14368、14435、14436、14439和14404、使用极性筛选雄激素受体竞争绿色测定试剂盒的雄激素置换的剂量响应曲线。
图3显示14228的体外特性，包括eGFP转录活性、PSA、细胞存活率、雄激素置换和BLI。
图4对AR突变体(Glu592、Tyr594、Val582、Arg586和Phe583)与野生型AR的14228的转录活性比较。
图5显示假拟原子所示的人ARDBD同源性模型上预计的结合位点的图示。该位点被人ARDBD中的残基Ser579、Val582、Phe583、Arg586、Gln592、Tyr594、Arg609、Lys610和Pro613包被，其中阴影区位于Phe583、Tyr594、Lys610与Pro613之间，相邻Val582和Lys610右侧代表疏水区。此外，阴影区Arg586、Arg609、Arg616和Lys610代表极性区。
图6显示对AR具有特异性的DBD-相互作用化合物的选择的棒形图，其中在对瞬时表达的AR、GR和PR或对MCF-7细胞中内源性ER-_的荧光素酶测定中以所示浓度测试的恩杂鲁胺(enz)在示意图(A)、14228(B)和14449(C)中显示，并且使用ARR3tk-荧光素酶报道分子评价AR、GR和PR活性。MCF-7细胞包括稳定转染的雌激素响应元件-荧光素酶基因。100％是指仅使用有0.1％DMSO的各受体的荧光素酶活性(误差条表示平均值_S.D.，6次重复enz，恩杂鲁胺)。
图7显示DBD-相互作用化合物对AR靶基因表达的作用，A是显示从LNCaP细胞中分泌的PSA的线性图，所述LNCaP细胞用1nMR1881和化合物(即恩杂鲁胺、14449和14228)以所示浓度处理2天，其中分泌的PSA通过分析来此2次独立实验的每个孔的150μl细胞培养物来定量。B是显示在R1881、化合物14449和恩杂鲁胺(Enz)的存在下AR靶基因和非雄激素响应基因(α-肌动蛋白，ACTB)的基因表达改变的棒形图*＝基于14449+R1881与DMSO+R1881和恩杂鲁胺+R1881与DMSO+R1881之间的2-样品t检验的基因表达显著性下降(p值<0.05)。
图8显示化合物-14449减小肿瘤体积并且消除去势小鼠的LNCaP异种移植物模型中的PSA产生，对所述小鼠每日2次施用14449(100mg/kg)或恩杂鲁胺(Enz)(10mg/kg)4周并且评价LNCaP异种移植物肿瘤体积(A)和血清PSA(B)，其中将数据表示为平均值±S.E.，n＝4。P值<0.05被视为与媒介物对照组相比具有显著性(*)；p值<0.001被视为与媒介物对照组相比具有极其的显著性(**)。
图9显示一系列示意图，(A)使用LNCaPeGFP细胞在0.1nMR1881的存在下，通过测定荧光来比较化合物25(即14449)与恩杂鲁胺的AR抑制活性；(B)通过使用相同的LNCaPeGFP细胞测定分泌入培养基的PSA来评价中心化合物的抑制作用；和(C)使用MTS测定法的25(即14449)对LNCaP、MR49F(恩杂鲁胺-抗性)和PC3细胞的抗增殖作用，其中用不同浓度的所述抑制剂在0.1nMR1881的存在下将LNCaP、MR49F和PC3细胞处理3天。
详细描述
DNA-结合结构域是用于抑制AR二聚化和/或DNA结合的有吸引力的靶标。生物信息学(Insilico)计算机药物研发方法用于进行>3百万可购买到的来自ZINC数据库的先导类化合物的实际筛选(Irwin，J.等人AbstractsofPapersAm.Chem.Soc.(2005)230：U1009)，以鉴定潜在的DBD结合物。生物信息学方法包括大规模对接、原位重新评分(in-siterescoring)和共享投票(consensusvoting)法。
本领域技术人员应当理解，COOH和NR2可以包括相应的离子，例如分别为羧酸根离子和铵离子。或者，如果显示离子，则本领域技术人员可以理解还可以存在抗衡离子。此外，本领域技术人员应当理解，其它部分可以包括相应的离子，且如果显示离子，则本领域技术人员可以理解还可以存在抗衡离子。
对于其它化合物，对于它们中的大部分进行单一剂量筛选，而对于具有高抑制百分比的那些仅测定IC50，除了少量具有相对低％抑制的有意义的化合物之外。当以3μM或1μM浓度测定％抑制时，对于活性和无活性化合物的％抑制阈值低至你所认可的程度。发现在3μM下约30％的抑制率可以得到约50μM的IC50。因此，一般具有低于30％的抑制值的化合物可以被视为无活性的。尽管如此，但是化合物的活性不应当始终根据％抑制来确定。实际上，如果系统的敏感性在一定程度上下降，则所测试和视为无活性的任意化合物都可以被视为有活性。当化合物变得越来越好时，敏感性水平增加。因此，在测定系统中测定低活性化合物变得更为困难。然而，由于较新的化合物基于上述成功的化合物，所以它们在一些水平上可以具有一定的活性。因此，“无活性”可能是不正确的术语，而“未检测到”可能更适合。
本领域技术人员将理解，所述部分与如本文所述的化合物的共价连接点可以是，例如、但不限于在特定条件下裂解。特定条件可以包括，例如、但不限于体内酶或非酶方式。所述部分的裂解可以例如、但不限于自发地进行或可以被催化、被另一种试剂或物理参数或环境参数的改变诱导，例如酶、光、酸、温度或pH。所述部分可以是，例如、但不限于起掩蔽官能团作用的保护基、作为一种或多种主动或被动转运机制的底物起作用的基团或起传递或增强化合物特性例如溶解性、生物利用度或定位的基团。
在一些实施方案中，如上述表1和权利要求中所述的化合物可以用于至少一种适应证的全身治疗，所述至少一种适应证选自：前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、脱发、痤疮、多毛症、卵巢囊肿、多囊卵巢病、性早熟和老年性黄斑退化症。在一些实施方案中，表1和如权利要求中所述的化合物可以用于制备用于全身治疗本文所述的适应证的药剂或组合物。在一些实施方案中，还提供了全身治疗本文所述的任意适应证的方法。
在一些实施方案中，本文所述的化合物及其所有不同形式(例如，游离形式、盐、多晶型物、异构形式)可以呈溶剂加合物形式，例如溶剂化物形式。溶剂化物含有化学计算或非化学计算量的与化合物或其盐物理缔合的溶剂。所述溶剂可以例如但不限于药学上可接受的溶剂。例如，当溶剂是水时形成水合物，或当溶剂是醇时形成醇化物。
在一些实施方案中，本文所述的化合物及其所有不同形式(例如，游离形式、盐、溶剂化物、异构形式)可以包括结晶和无定形形式，例如多晶型物，假多晶型物，构象多晶型物，无定形形式，或它们的组合。多晶型物包括相同元素组成的化合物的不同晶体堆积排列。多晶型物通常具有不同的X-射线衍射图、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶形、光学和电学性质、稳定性和/或溶解性。本领域技术人员将理解，包括重结晶溶剂、结晶速率和贮存温度的各种因素可以导致单一晶型占优势。
在一些实施方案中，本文所述的化合物及其所有不同形式(例如，游离形式、盐、溶剂化物、异构形式)包括异构体，例如几何异构体、基于不对称碳的旋光异构体、立体异构体、互变异构体、单一对映异构体、单一非异构对映异构体、外消旋体、非对映异构体混合物、和它们的组合，并且不限于为了便利目的而示例的结构的描述。
在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物可以包含这类化合物的盐，优选药学上或生理学上可接受的盐。药物制剂将典型地包含一种或多种载体、赋形剂或稀释剂，其适于制剂的施用模式、例如通过注射、吸入、局部施用、灌洗或适于所选治疗的其它模式。适合的载体、赋形剂或稀释剂(在本文中可以互换使用)是本领域已知用于这类施用模式的那些。
如本文所述的药物组合物的“有效量”包括治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是指在所需剂量下和时期内有效获得所需治疗结果(如减小的肿瘤尺寸、增加的寿命或增加的预期寿命)的量。化合物的治疗有效量可以根据例如以下因素改变：受试者的疾病状态、年龄、性别和体重以及化合物在受试者中引发所需反应的能力。剂量给药方案可以进行调整以提供最佳的治疗反应。治疗有效量也是其中化合物的任何毒性或有害作用被治疗有效作用超过的量。“预防有效量”是指在所需剂量下和时期内有效获得所需预防结果(例如较小的肿瘤，增加的寿命，增加的预期寿命或防止前列腺癌向雄激素非依赖性形式进展)的量。典型地，在疾病之前或疾病早期在受试者中使用预防剂量，因此预防有效量可以少于治疗有效量。
通常，本文所述的化合物应当在不导致实质毒性情况下使用。本文所述化合物的毒性可以使用标准技术测定，例如通过在细胞培养物或实验动物中测试和确定治疗指数，即LD50(50％群体致死剂量)和LD100(100％群体致死剂量)之间的比率。然而，在一些情况下，例如在重病情况下，可能需要施用显著过量的组合物。本文所述的一些化合物可以在一些浓度下是有毒性的。可以使用滴定研究来测定毒性和无毒性浓度。可以如下评估毒性：使用不表达AR的PC3细胞作为阴性对照，研究具体化合物或组合物对细胞系的特异性。可以使用动物研究来提供证明化合物是否对于其它组织具有任何影响。靶向AR的系统治疗将不大可能对其它组织导致重大问题，因为抗雄激素药和雄激素不敏感综合征不是致命的。
所用的定义包括使用用于研究目的的雄激素例如双氢睾酮(DHT)或合成雄激素(R1881)对雄激素受体(AR)的配体依赖性活化。AR的配体依赖性活化是指在没有雄激素(配体)的存在下对AR的反式激活，例如，用福司柯林(FSK)刺激cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)途径。
如本文所述的一些化合物和组合物可以干扰特异性二聚化-和/或DNA-结合依赖性活化(例如潜在地结合ARDBD以通过破坏AR二聚化和防止DBD-DNA结合阻断AR转录的机制。
本发明的不同可选实施方案和实施例如本文所述。这些实施方案和实施例是示例性的，而不应当被视为限定本发明的范围。
材料和方法
生物信息学流水线
1.蛋白质和配体制备
使用Maestro9.3(LLC)内的ProteinPreparationWizard制备ARDBD二聚体-DNA(1R4I.pdb)的晶体结构。加入氢原子，指定键级并且使用Prime添加用于一些残基的缺失侧链。使用OPLS-2005力场使侧链最小化。
将具有3百万个小分子的先导类ZINC试剂盒输入MolecularOperatingEnvironment(MOE)2010。通过洗涤过程使全部分子质子化/脱质子化，添加偏好电荷并且用MMFF94x力场最小化至梯度。在最小化后，将数据库作为sdf文件输出。
2.ARDBD中的成药(Druggable)结合位点检测
为了鉴定ARDBD二聚体-DNA结构中潜在的成药结合位点，使用基于几何学和给予能量的方法如MOE2010内的SiteFinder、Pocket-Finder和Q-siteFinder检测ARDBD二聚体-DNA复合物、DBD二聚体和DBD单体。检查可能的结合位点并且基于参数如大小、形状、氨基酸组成和袋体积比较。
3.潜在ARDBD结合物的虚拟筛选
Maestro9.3和eHiTs2011中的两种对接程序Glide用于虚拟筛选。预测的结合位点中的残基用于确定虚拟筛选的活性位点。为了Glide对接，使用位于选择的残基中心的盒确定栅格。不应用系统规定参数，且将全部设置值保持为默认值。使用GlideSP模式对接ZINC数据库并且制定截止值以便清除对受体具有潜在低结合亲和力的化合物。使剩余的化合物进行默认设置中的eHiTs对接。eHiTs的截止值用于保持用两种对接程序良好地保持对化合物始终如一地评分。使用来自两种程序的对接方式计算RMSD(根中值平方差(rootmediansquaredeviation))值，并且除去RMSD值高于的化合物。基于MOE2010中的结构相似性集合其余化合物并且化合物根据与受体的有利相互作用选自上部有序的集合。
化合物的体外鉴定
1.细胞培养：LNCaP和PC3人前列腺癌细胞得自美国模式培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC，Manassas，VA)，并且使其生长在补充5％胎牛血清(FBS)(Invitrogen)的RPMI1640培养基中。使用慢病毒方法，用与eGFP报道基因(LN-ARR2PB-eGFP)融合的雄激素响应前列腺碱性蛋白衍生的启动子稳定转染LNCaPeGFP细胞系，并且使其生长在无酚红的补充了5％CSS的RPMI1640中。在补充了5％FBS和10μMMDV3100的RPMI1640中培养Inihouse研发的MDV3100-抗性LNCaP细胞。将全部细胞维持在37℃、5％CO2下。
2.eGFP细胞AR转录测定：如上所述测定AR转录活性(Tavassoli，Snoek等人2007)。
3.前列腺-特异性抗原(PSA)测定：使用相同板与eGFP测定平行地进行分泌入培养基的PSA水平的评价。在将细胞温育3天后，从每个孔中取出150μl培养基并且加入到150μlPBS中。然后使用Cobase411分析仪(RocheDiagnostics)、根据制造商的说明书评价PSA水平。
4.生物层干扰量度(BLI)测定：如上所述测定小分子与AR之间的直接可逆相互作用(Lack，Axerio-Cilies等人2011)。
5.雄激素置换测定：使用极性筛选雄激素受体竞争物绿色测定试剂盒(PolarScreenAndrogenReceptorCompetitorGreenAssayKit)、根据制造商的说明书评价雄激素置换(Lack，Axerio-Cilies等人2011)。
6.SRC2-3肽置换测定：如上所述测定ARAF2特异性肽置换。
7.细胞存活测定：将PC3、LNCaP和MDV3100-抗性细胞以3,000细胞/孔在96-孔板中的包含5％活性炭处理的血清(charcoalstrippedserum)(CSS)的RPMI1640上PC3铺板，用0.1nMR1881和化合物(0-25μM)处理96hrs。在4天处理后，使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓测定法、根据制造商的方案测定细胞密度(CellTiter961AqueousOneSolutionReagent，Promega)。
8.突变研究：使用QuickchangeTM定点诱变试剂盒、根据说明书使预测结合位点上的残基突变。
9.瞬时转染：将PC3/MCF7细胞接种入96-孔板(2,000细胞/孔)。24hrs后，使用转染试剂TT20将野生型AR(50ng/孔)/AR突变体和AR3TK-荧光素每日质粒(1:3)共转染入PC3细胞或将ERE-荧光素酶(50ng/孔)转染入MCF7细胞。转染后24hrs，用不同浓度的化合物处理细胞，并且在24hrs后，裂解细胞，且使用发光计取读数值。
构建体
在pcDNA3.1表达质粒上编码全长人AR(hARWT)或剪接变体(AR-V7)。
细胞培养、转染和荧光素酶测定
使PC3人PCa细胞(AATC)在补充5％活性炭处理的血清(CSS)的RPMI1640培养基(InvitrogenTM)(含有5％CSS的RPMI1640培养基)中血清饥饿5天，然后转染。为了进行荧光素酶测定，将PC3细胞接种入96-孔板(5000细胞/孔)中的具有5％CSS的RPMI1640培养基24h，然后用50nghAR或其它核受体质粒、50ngARR3tk-荧光素酶和0.3μl/孔TransIT20/20转染试剂(TT20，MirusTM)转染48h。然后用不同浓度的化合物和0.1nMR1881(在100％乙醇中)处理24h。分别用1nM地塞米松或孕酮刺激GR或PR活化。使用具有稳定转染的雌激素响应元件-荧光素酶报道分子的MCF-7细胞系测定ER-α转录活性，用1nM雌二醇刺激转录活性。使用60μl1X被动性裂解缓冲液/孔(PromegaTM)进行细胞裂解。
将来自每个孔的20μl细胞裂解液与50μl荧光素酶测定试剂(PromegaTM)混合，并且用TECANTMM200pro平板读出器记录发光。按照相同方式使用剪接变体AR进行荧光素酶测定，但仅使用5ngpcDNA3.1AR-V7(以便限制高水平的AR-V7表达)，且不使用R1881。R1-AD1和TALEN-改造的R1-D567细胞系如上所述(Nyquist，M.D.等人，(2013)TALEN-engineeredARgenerearrangementsrevealendocrineuncouplingofandrogenreceptorinprostatecancer.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110，17492-17497)。如上所述使用R1-AD1和R1-D567细胞进行测定，但仅转染ARR3tk-荧光素酶报道基因和10,000细胞/孔。
蛋白质印迹
用10％SDS-聚丙烯酰胺微型凝胶从荧光素酶测定(96-孔板)中分离细胞裂解液(40μl)。将蛋白质转入添加甲醇的PVDF膜并且用抗-AR441(小鼠，SigmaTM)单克隆初级抗体探测。还用显示等同载量的多克隆抗-肌动蛋白(家兔，SigmaTM)和多克隆抗-PARP/抗-裂解PARP(家兔，SigmaTM)探测印迹，以便测试细胞凋亡诱导。与化合物一起温育2天后，再用多克隆抗-FKBP5(家兔，SigmaTM)探测来自CWR-R1细胞的裂解液。
PSA测定
将维持在具有5％CSS的RPMI1640培养基中的LNCaP细胞在96-孔(10,000细胞/孔)中的相同培养基中和化合物和1nMR1881的存在下温育2天。在温育期后，从每个孔中取出150μl培养基并且使用Cobase411分析仪(RocheAppliedScienceTM)、根据制造商的说明书定量PSA水平。相同仪器用于分析体内分析过程中来自小鼠的血清PSA。
微阵列基因档案
使LNCaP细胞生长在如下4种条件下24h：1)DMSO，无R1881；2)DMSO与R1881(1nM)；3)400nM化合物14449与R1881；和4)120nM恩杂鲁胺与R1881。化合物浓度遵循在荧光素酶报道分子测定法中测定的约IC50浓度。
一式三份重复每种条件。24h后，从12份样品中各自提取总细胞mRNA(4种条件，3次)并且从定制的Agilent微阵列中测定50,737个转录物的基因表达水平。
在全部样品中以分位数校准基因表达数据并且转化成log2等级。对条件3(化合物14449与R1881)与条件2(DMSO与R1881)和条件4(恩杂鲁胺与R1881)与条件2(DMSO与R1881)之间的每种转录物的表达水平进行两种-样品t检验。如果来自两种-样品t检验的p值小于0.05，则将基因视为差别表达的。Fisher确切检验和比值比用于评价不同组差别表达的基因之间的重叠。
共焦显微镜检查
将约40,000PC3细胞在置于12-孔板内在具有5％CSS的RPMI1640培养基中的无菌盖玻片上接种48h。使用TT20(3μl)将YFP-AR或YFP-V7质粒(100ng/孔)转染48h。然后用10nMR1881和25μM化合物将细胞处理6h。抽吸培养基后，用PBS将细胞洗涤1次，并且用4％低聚甲醛在4℃固定过夜，然后使用DAPI固定器(VectorLaboratories)在带电荷的盖玻片上固定。用Zen2012软件控制的ZeissLSM780共焦旋转盘式显微镜取图像。分别使用508和388nm的激发波长使YFP和DAPI显影。
染色质免疫沉淀法(ChIP)
用单独的DMSO、DMSO+R1881或化合物+R1881将除去雄激素的LNCAP细胞处理24h。在室温下使用1％甲醛处理进行DNA-蛋白质交联10min，并且用125mM甘氨酸终止5min。用ThermoScientificTM1/8-英寸超声处理探头和SonicDismembrator550TM仪器将细胞裂解液(1X107细胞/ml)进行超声处理，以便产生200-1000bp大小的DNA片段。使用5μg抗-AR-N20抗体(SantaCruzBiotechnologyTM)或1μg家兔同种型控制IgG(SantaCruzBiotechnologyTM)、应用EZ-ChIP〗染色质免疫沉淀试剂盒(MilliporeTM)对裂解液(3.3×106细胞等份)进行免疫沉淀。使用如下引物组，通过定量PCR(SYBRGreen主要混合物，InvitrogenTM)对结合的DNA进行定量：PSA增强子，正向5'-ATGGAGAAAGTGGCTGTGGC和反向5'-TGCAGTTGGTGAGTGGTCAT；FKBP5增强子，正向5'-CCCCCCTATTTTAATCGGAGTAC和反向5'-TTTTGAAGAGCACAGAACACCCT；GAPDH启动子，正向5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG和反向5'-TCGAACAGGAGCAGAGAGCGA。将定量的PCR结果呈现为使用控制IgG抗体的PCR扩增的折叠富集，并且给予总输入值(未沉淀的染色质)校准。将用于GAPDH启动子的引物用作缺乏任何雄激素响应元件的阴性对照。
AR-DBD蛋白质的纯化
将编码AR-DBD+铰链的质粒转入BL21(DE3)。将为表达生物素标记的AR-DBD+铰链设计的BL21细胞与Pan4AR-DBD+铰链(氨苄西林筛选)和生物素连接酶表达载体(pBir-Acm，氯霉素筛选)共转化。使单一克隆生长在补充了50μg/ml氨苄西林和35μg/ml氯霉素(如果适合)的2升LB培养基中至A600nm＝0.6，然后在37℃下用0.1mM异丙基β-D-1-半乳糖硫吡喃糖苷诱导3h。在诱导步骤过程中同时给表达具有生物素化序列的AR-DBD的培养物补充0.150mM生物素。将细胞沉淀重新混悬于补充了10mM咪唑的～20ml50mMTris-HCl，pH8.0、300mMNaCl、5％甘油(缓冲液A)，并且与0.1mg/ml鸡卵白溶菌酶(SigmaTM)和0.1mMPMSF蛋白酶抑制剂一起在冰上温育30min。通过超声处理进行细胞裂解，然后在4℃以13,000Xg离心30min。在4℃将上清液与2ml镍-琼脂糖珠(GEHealthcareTM)一起旋转1h，然后直接上Poly-Prep10-ml重力色谱柱(Bio-RadTM)。用补充20mM咪唑的2X4ml缓冲液A进行洗涤。用2ml缓冲液A洗脱包含250mM咪唑的500-μl级分中纯的蛋白质。
EMSA(凝胶转移)测定法和生物层干扰量度分析
使用纯化的AR-DBD和具有ARE2序列的dsDNA进行电泳迁移位移试验(EMSA)。通过使乳腺互补寡核苷酸在H2O中退火形成ARE：上链，5'-TACAAATAGGTTCTTGGAGTACTTTACTAGGCATGGACAATG；和下链，5'-CATTGTCCATGCCTAGTAAAGTACTCCAAGAACCTATTTGTA。给六聚化AREs的位置加下划线。使乱序的DNA从如下序列中退火：上链，5'-TAAAACGTGGTCCCTGGTACTGCCTTCGTGCCATTCGATTTT；和下链，5'-AAAATCGAATGGCACGAAGGCAGTACCAGGGACCACGTTTTA。使蛋白质-DNA复合物在冰上在加样缓冲液(20mMTris，pH8、50mMNaCl、1mMEDTA、10μg/ml聚(dI-dC)、5mMMgCl2、200μl/mlBSA、5％甘油和1mMDTT)中温育30min，然后在6％天然-PAGE上的1XTBE，pH8.0中电泳。使用SyberSafeTMDNA染色染料使蛋白质-DNA复合物显影。
在全部实验的至始至终，使用生物素化AR-DBD+铰链在具有5％DMSO的缓冲液A中进行使用ForteBioOctetRedTM仪器的生物层干扰量度分析。使DBD(0.1mg/ml)上链霉抗生物素传感器的200μl缓冲液中30min，然后用生物胞素(10μg/ml)封闭游离链霉抗生物素位点10min。然后用在相同缓冲液中的50μM化合物或单独的5％DMSO使加载DBD的传感器预平衡100s。通过使传感器运动入包含dsDNA(ARE，3μM)的补充了50μM化合物的孔120s监测DNA连接动力学。然后在缓冲液+化合物、但无DNA中解离，再经过120s。使生物胞素-封闭的对照传感器(无AR-DBD)接触相同的实验条件，并且从每个曲线上扣除与dsDNA的非特异性相互作用。
肿瘤生长评价和去势抗性LNCaP异种移植物的PSA
给称重25-31g的6-8-周龄裸鼠(HarlanSprague-Dawley)的后背部位上皮下接种LNCaP细胞(BDMatrigel中106细胞，BDBiosciences)。每周测量肿瘤体积、体重和血清PSA水平。当血清PSA水平达到25ng/ml以上时，阉割小鼠。当PSA恢复至阉割前的水平时，将小鼠随机分入如下的3个治疗组：媒介物、10mg/kg恩杂鲁胺或100mg/kg化合物14449，并且通过每日2次腹膜内注射4周治疗。卡钳用于测量每个肿瘤的3个垂直轴以便计算肿瘤体积。另外，每周称重小鼠并且每日监测毒性症状，包括死亡、昏睡、失明和定向障碍。
实施例
生物信息学假说
1.ARDBD中潜在成药的结合位点的鉴定
在比较来自DBD二聚体-DNA复合物、DBD二聚体和DBD单体的全部鉴定的结合位点后，鉴定DBD单体中的潜在结合位点，如果化合物结合，则推定其能够打断DBD-DNA结合。该结合位点主要由来自一种α-螺旋的残基包括Arg568、Val564和Phe565和一些来自环路的极性残基Tyr576和Gln574组成。它是牵涉残基的区，所述残基构成了对DNA结合的关键相互作用，如形成范德瓦尔斯力的Arg568接触Val564和核苷酸(未显示)。
2.通过虚拟筛选法鉴定结合ARDBD的化合物
首先通过对接程序Glide对ARDBD亚单位中检测的结合位点筛选ZINC数据库。弃去具有对接评分大于(<-4)的总计462,588个化合物并且用分子量、电荷和环数过滤化合物，且将其余化合物(170,000)进行eHiTs对接。保留具有低于(<-3)的eHiTs评分的59,586个化合物，并且计算这些化合物的RMSD值。处理具有RMSD的8,953个化合物以便筛选潜在的虚拟命中数。通过对受体-配体相互作用进行视觉检查，选择100个化合物用于实验评价。
3.靶向ARDBD的AR抑制剂的体外鉴定
1.有效和多种AR抑制的鉴定
使用无破坏性eGFP测定法评价选择的化合物，所述无破坏性测定法对AR转录活性水平进行定性，并且鉴定属于不同化学类型的化合物(表1-系列1-6)，且特别是4-(4-苯基噻唑-2-基)吗啉化合物(14228)显示出高效能的AR转录抑制。该化合物抑制AR转录并且以浓度依赖性方式抑制PSA水平，其中IC50s处于低纳摩尔范围(分别为0.274μM和0.188μM)。进一步确定了在3种细胞系AR-阳性LNCaP和MDV3100-抗性细胞系和AR-阴性PC3细胞系中抑制前列腺癌细胞生长的能力。显示该化合物强烈抑制AR-阳性前列腺癌细胞系，而对AR-阴性细胞无影响，表明该化合物的效能通过抑制AR进行(图3)。
4.不与AR中的其它已知结合位点发生相互作用的化合物14228
因为在AR中存在其它已知的结合位点，包括激素结合位点(HBS)、活化功能-2(AF2)位点、结合功能3(BF3)和N-末端活化功能-1(AF1)位点，所以我们使用另外的测定法以便排除可能与那些位点的结合。雄激素置换测定法证实，它不会置换雄激素以占据ARHBS，因此，它是非竞争性AR抑制剂。它不会置换通过针对AF2的荧光偏振肽置换测定法所显示的AF2结合位点中的肽。此外，生物层干扰量度(BLI)测定法显示，在C-末端配体结合结构域(LBD)中不存在结合，因此，它不是BF3结合剂。所有这些证据启示，所述化合物不结合LBD中的任意结合位点。然后，我们使用AF1测定法测定该化合物是否来自AF1反式激活的抑制。将CREB和Gal4质粒共转染入AR-阴性细胞系PC3，并且在处理后，无CREB和Gal4抑制，表明它不影响AF1(数据未显示)。
5.化合物结合ARDBD的直接证据
为了进一步如所推定的证实化合物结合ARDBD，我们对预测的结合位点进行了突变研究。基于我们的分子模型化，Val581、Phe582、Arg586、Glu591和Tyr593是可能具有氢键和与配套的疏水性相互作用的关键残基。因此，我们使这些残基突变成天冬氨酸并且使用这些突变体测试我们的化合物。在这些突变体中，当将Val581、Phe582和Arg586突变体与AR3TK-荧光素酶报道分子一起共转染入AR-阴性PC3细胞中时，所述突变体不能在荧光素酶试验中活化荧光素酶表达(图4)，同时，在蛋白质印迹中未检测到AR表达(数据未显示)。所述化合物不抑制Glu591和Tyr593突变体(可以活化野生型AR)，这启示该化合物结合ARDBD，而这两种残基对于结合亲和力而言是关键(图4)。
通过蛋白质消化试验进一步证实了化合物结合ARDBD。在化合物14288的存在下用胰蛋白酶无法消化ARDBD，而用媒介物或其它抗雄激素药如MDV3100可以消化(数据未显示)。
6.鉴定的化合物的特异性
因为DBD是核受体中高度保守的结构域时，所以靶向该结构域的化合物可能具有极差的选择性。为了排除非特异性的问题，我们测定我们的化合物在其它核受体如ER中抑制。在用ERE-荧光素酶报道基因转染的乳腺癌MCF7细胞中测试所鉴定的化合物，它们未显示对ER抑制的显著作用(数据未显示)。
7.对14228的结构修饰
因为起始命中的化合物14228显示有利的特性，所以购买或基于对接模型合成更多类似物(未显示)。使用14228的三部分组成苯环、噻唑和吗啉基团进行结构修饰(表1)，且一些类似物如14370与亲代化合物相比显示改善的活性。
8.14368的部分AR激动剂属性的鉴定
9.4-(4-苯基噻唑-2-基)吗啉类的部分激动作用的消除
为了消除观察到的结合人AR的LBD和得到的对AR的部分激动剂作用，我们尝试用疏水性较低的杂环替代所研究的4-(4-苯基噻唑-2-基)吗啉类中的苯基碎片。生成了大量包含不同芳族(14291)、脂族(14403、14406)和杂环(14404、14435、14436、14439)的替代了苯碎片的化合物(参见表2)。这些化学品是由公司LifeChemicals(www.lifechemicals.com)和Enamine(www.enamine.net)定制合成的。其纯度和特性分别通过LC-MS和1HNMR证实。
使用荧光偏振测定法(PolarScreenTM，LifeTechnologies)在不同浓度下测定上述化学品置换来自重组野生型LBD的ABS位点的DHT的能力。按照浓度依赖性方式检测到14368结合ABS，其中在～30μM建立了相应的IC50(表2，图2)。用疏水性较低的杂环和庞大的脂族环替代苯环可以显著地降低化合物的DHT置换能力。尽管衍生物的一些(14291、14403和14406)失去其抗-AR活性，但是其它的化合物例如14435、14436、14439和14404维持了对AR的突变的T877A形式的良好效能，同时未显示出不期望的部分激动剂作用。
表2：4-(4-(3-氟-2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)吗啉衍生物的结构和活性
10.ARDBD表面上潜在成药结合位点的鉴定
结合两个六聚化半位点AREs(PDB代码：1R4I)的大鼠ARDBD二聚体是迄今为止可得到的受体的DBD区的唯一晶体结构。因为大鼠和人ARDBDs的序列相同，所以将1R4I结构用作构建人ARDBD的同源性模型的模板。有关ARDBD二聚体-ARE复合物“热点”根据MolecularOperatingEnvironment(MOE)2011包内的SiteFinder模块预测。将ARDBD的P-框区下的空穴视为可能打断ARDBD-ARE复合物的小分子结合的潜在位点(图5)。该空穴主要被识别螺旋的残基Ser579、Val582、Phe583和Arg586和属于杠杆臂环路的极性残基Gln592和Tyr594和来自另一α-螺旋的残基Pro613和Arg616与环路残基Arg609和Lys610包被。该位点以有溶解能力地暴露于特定残基，预测这些残基在锚定小分子的可能结合方面起关键作用。因此，该位点周围的极性残基Ser579、Gln592和Try594可以被表征为可利用于氢键，而该位点核心中的Phe583可以提供额外的与潜在结合剂的疏水性相互作用。
11.化学
全部试剂和溶剂购自商品供应商并且无需进一步纯化使用，另有描述的除外。通过预涂布的硅胶F254板(Sigma-Aldrich)上的薄层色谱法(TLC)与UV指示剂、使用乙酸乙酯/己烷(1:2v/v)监测反应。收率是纯化产物的收率且未优化。通过LCMS分析测定新合成的化合物的纯度。使用具有400MHz操作频率的VarianGEMINI2000NMR分光光度计系统显示质子核共振(1HNMR)光谱。以ppm给出化学位移δ并且使用如下缩写：单峰(s)、双峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q)、多重峰(m)和宽单峰(brs)。用Agilent1100LC系统采集全部LC/MS数据。将化合物溶液注入以正和负模式操作的电离源，其中流动相为乙腈/水/甲酸(50:50:0.1％v/v)，1.0mL/min。在外部对质量范围m/z100-m/z650校准仪器。
方案1.用于合成杂芳基衍生物14449(25)、14408(27)、14404(28)、14451(31)、14402(32)、14448(34)、14450(36)、14464(38)、14468(40)和14447(41)的方案。
(A)
(B)
(C)
试剂和条件：(A)IPA，100℃，17-38％；(B)THF，H2O，K2CO3，PdCl2(PPh2C6H4SO3Na-m)2，80℃，54-73％；(C)甲苯，PdAc2(PPh3)2，110℃，1062％。
化合物27的合成方法(方案1(A))。将10mmol硫脲(a)和10mmol卤代酮(b)的混合物溶于10mL异丙醇。将形成的溶液回流4h，真空除去有机溶剂。用20mL盐水处理残余物，用30mL乙酸乙酯萃取(2次)。用硫酸钠干燥合并的有机层，过滤，蒸发。通过制备型HPLC(洗脱液EtOAc/己烷＝1/1)纯化得到的固体，得到终产物，为固体。
4-(4-(4,5-二甲基噻吩-3-基)噻唑-2-基)吗啉(27)。1HNMR(DMSO-d6，400MHz)：2.24(3H，s)，2.36(3H，s)，3.41-3.43(4H，m)，3.73-3.76(4H，m)，6.76(1H，s)，7.33(1H，MS(ESI)：m/z(M+H)+281.1。收率：38％；LCMS纯度100％。
化合物28的合成方法(方案1(B))。将9.1mmol溴噻唑(bromthiazole)(方案1(B)，c)、11.8mmol相应的硼酸、22.5mmol碳酸钾和0.1mmol催化剂PdCl2(PPh2C6H4SO3Na-m)2的混合物溶于100mL四氢呋喃和16mL水。然后将该反应混合物回流20h。
冷却后，用100mL乙酸乙酯萃取。分离有机层，用硫酸钠干燥，过滤，蒸发。通过制备型HPLC(洗脱液EtOAc/己烷＝1/1)纯化得到的残余物，得到终产物，为固体。
4-(4-(噻吩-3-基)噻唑-2-基)吗啉(28)。1HNMR(DMSO-d6，400MHz)：3.41-3.43(4H，m)，3.72-3.74(4H，m)，7.14(1H，s)，7.49-7.55(2H，m)，7.72-7.73(1H，m)。MS(ESI)：m/z(M+H)+253.1。收率：54％；LCMS纯度95％。
用于合成化合物14449(25)，14408(27)、14404(28)、14451(31)、14402(32)、14448(34)、14450(36)、14464(38)，14468(40)和14447(41)的通用方法(方案1(C))。将4mmol溴噻唑(c)、12mmol相应的咪唑(d)、0.1mmol催化剂PdAc2(PPh3)和50mL甲苯的混合物回流24h。冷却后，真空除去有机溶剂。通过制备型HPLC(洗脱液EtOAc/己烷＝1/1)纯化得到的残余物，得到终产物，为固体。再通过反相HPLC(洗脱液乙腈/水)纯化化合物，其中乙腈含量为20-80％。
4-4(4,5-二溴-1H-咪唑-2-基)吗啉(25)。1HNMR(DMSO-d6，400MHz)：3.39-3.42(4H，m)，3.70-3.73(4H，m)，7.14(1H，s)，7.80(1H，s)。MS(ESI)：m/z(M+H)+395.0。收率：51％；LCMS纯度98％。M.p.116-118℃。
4-(4-(5-溴-4-氯-1H-咪唑-1-基)噻唑-2-基)吗啉(31)。1HNMR(DMSO-d6，400MHz)：3.41-3.43(4H，m)，3.71-3.73(4H，m)，7.15(1H，s)，8.16(1H，s)。MS(ESI)：m/z(M+H)+351.0。收率：14％；LCMS纯度96％。
4-(4-(4,5-二氯-1H-咪唑-1-基)噻唑-2-基)吗啉(32)。1HNMR(DMSO-d6，400MHz)：3.41-3.45(4H，m)，3.71-3.73(4H，m)，7.15(1H，s)，8.14(1H，s)。MS(ESI)：m/z(M+H)+305.1。收率：48％；LCMS纯度99％。
4-(4-(4-氯-1H-咪唑-1-基)噻唑-2-基)吗啉(34)。1HNMR(DMSO-d6，400MHz)：3.42-3.44(4H，m)，3.71-3.73(4H，m)，6.97(1H，s)，7.83(1H，s)，8.17(1H，s)。MS(ESI)：m/z(M+H)+271.1。收率：62％；LCMS纯度99％。
4-(4-(4-溴-5-氯-1H-咪唑-1-基)噻唑-2-基)吗啉(36)。1HNMR(DMSO-d6，400MHz)：3.41-3.43(4H，t)，3.70-3.72(4H，m)，7.14(1H，m)，8.15(1H，s)。MS(ESI)：m/z(M+H)+351.0。收率：27％；LCMS纯度96％。
4-(4-(4,5-二碘-1H-咪唑-1-基)噻唑-2-基)吗啉(38)。1HNMR(DMSO-d6，400MHz)：3.41-3.42(4H，m)，3.71-3.73(4H，m)，7.10(1H，s)，8.10(1H，s)。MS(ESI)：m/z(M+H)+488.9。收率：12％；LCMS纯度96％。
4-(4-(4-氯-5-碘-1H-咪唑-1-基)噻唑-2-基)吗啉(40)1HNMR(DMSO-d6，400MHz)：3.41-3.42(4H，m)，3.70-3.71(4H，m)，7.14(1H，s)，8.14(1H，s)。MS(ESI)：m/z(M+H)+397.5。收率：10％；LCMS纯度96％。
4-(4-(4-溴-1H-咪唑-1-基)噻唑-2-基)吗啉(41)。1HNMR(DMSO-d，6400MHz)：3.42-3.43(4H，m)，3.71-3.74(4H，m)，6.98(1H，s)，7.88(1H，s)，8.18(1H，s)。MS(ESI)：m/z(M+H)+316.1。收率：53％；LCMS纯度99％。
用于其余化合物(4-4-(3,4-二氟-2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)吗啉(26)、2-氟-6-(2-吗啉代4-基)苯酚(29)、4-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)吗啉(30)、2,3-二氟-6-(2-吗啉代4-基)苯酚(33)、5-氟-2-(2-吗啉代4-基)苯酚(35)、4-(5-甲基-4-苯基噻唑-2-基)吗啉(37)、4-(4-吡啶-2-基)噻唑-2-基)吗啉(39)、4-(4-(吡啶-4-基)噻唑-2-基)吗啉(42)、3-氟-4-甲氧基-5-(2-吗啉代4-基)苯酚(43)和4-(4-(3-氟-2-甲磺酰基-苯基)-噻唑-2-基)吗啉(44)和化合物(72-84)的合成方法遵循上文。
本文所述的化合物可以如本文所述使用本文所述的改进方法或通过本领域技术人员公知的方法合成。
附加的参考文献
Lack，N.A.，P.Axerio-Cilies等人，(2011)。JournalofMedicinalChemistry54(24)：8563-73。
Tavassoli，P.，R.Snoek等人，(2007)。Prostate67(4)：416-426。
更详细地举出如下实施例(即12-17)，DalalK.等人，“SelectivelyTargetingtheDNA-bindingDomainoftheAndrogenReceptorasaProspectiveTherapyforProstateCancer”THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRYVOL.289、NO.38，pp.26417-26429，2014年9月19日(在线公布，2014年8月1日)。
12.荧光素酶报道试验
使用PC3细胞中由基于ARR3tk前列腺碱性蛋白的启动子驱动的荧光素酶报道试验(Snoek，R.等人，(1998)Differentialtransactivationbytheandrogenreceptorinprostatecancercells.Prostate36，256-263)，预测结合AR-DBD的两种化合物显示对瞬时表达的全长人AR的剂量依赖性抑制作用(数据未显示，14228和14449，相应地，IC50＝2.36和0.340μM)，不影响AR蛋白质表达(数据未显示)。近期报道14337(扑蛲灵)通过靶向DBD抑制全长和剪接变体AR形式(Lim，M.等人，(2014)Ligand-independentandtissue-selectiveandrogenreceptorinhibitionbypyrvinium.ACSChem.Biol.9，692-702)，并且还可以抑制AR转录活性(数据未显示，IC50＝0.194μM)。对照实验证实14449可以将AR抑制至与恩杂鲁胺相差无几的水平(数据未显示，IC50＝0.314μM)。针对PARP的蛋白质印迹证实化合物处理不影响总PARP水平，也不产生任何PARP裂解产物，除了14337(数据未显示)之外。这些结果表明扑蛲灵(14337)强有力地诱导细胞凋亡，而DBD抑制剂(14228/14449)显示几乎物毒性或无毒性。
13.DBD-相互作用化合物减量调节LNCaP细胞中雄激素应答基因的表达
为了评价14228/14449阻断天然存在的AR-调节基因的转录能力，同时用R1881和化合物处理LNCaP细胞，然后测定分泌的PSA(图7A)。结果显示使用14228/14449和恩杂鲁胺的剂量依赖性抑制作用，其中在亚微摩尔浓度下建立了全部相应的IC50值。
14.DBD-相互作用化合物抑制AR剪接变体的转录活性
因为大部分AR剪接变体保留DBD结构域，所以我们测试了对AR-V7转录活性抑制。使用相同的荧光素酶报道基因测定法，使用递增浓度的14228/14449或扑蛲灵降低瞬时表达的AR-V7的活性，不改变AR-V7表达(数据未显示)。
使用恩杂鲁胺的对照实验证实对AR-V7活性无作用(数据未显示)，并且与无LBD存在下来自这种变体的结果一致。值得注意地，当与全长受体的抑制作用比较时，所述化合物无法实现完全抑制且对AR-V7的转录活性的有效性较低(IC50＝4-8μM)。我们有充分理由认为，全长和剪接变体ARs的DBDs可以共有相似的蛋白质结构。因此，我们将Y594D突变导入AR-V7编码序列，以便测定该突变是否可以消除药物抑制作用。AR-V7Y594D的转录活性可以不受14228/14449抑制(数据未显示)，这启示所述化合物的结合位置在所有AR形式上是类似的。与具有该突变的全长AR一样，AR-V7Y594D仍然可以被扑蛲灵强烈地抑制(数据未显示)。
15.DBD-相互作用化合物不阻碍AR核转位
16.化合物在染色质水平和体外减少AR的DNA结合
由于预期所研发的ARDBD抑制剂结合AR-DBD上接近的蛋白质-DNA界面，所以所述化合物应当影响AR结合雄激素调节的基因的增强子(具有AREs)。在对来自用R1881和化合物处理的LNCaP细胞的染色质进行ChIP分析(AR-N20抗体)后，14428和14449与用单独的R1881处理相比减少了PSA和FKBP5增强子的AR折叠(数据未显示)。对照实验揭示出在恩杂鲁胺处理后或在使用GAPDH启动子阴性对照的任何条件下，在无R1881的存在下，无增强子破坏。
可以预期通过诱变改变表面暴露的或埋藏的袋的特性。例如，T877A的单一氨基酸取代将AR交联剂转化成激动剂(Taplin，M.E.等人，(1995)Mutationoftheandrogenreceptorgeneinmetastaticandrogen-independentprostatecancer.N.Engl.J.Med.332，1393-1398)，且这种转化可以用与药物复合的AR-LBD的晶体结构进行理论说明(Lallous，N.等人，(2013)Targetingalternativesitesontheandrogenreceptortotreatcastration-resistantprostatecancer.Int.J.Mol.Sci.14，12496-12519)。此处，AR的Tyr-594和Gln-592上的天冬氨酸或丙氨酸残基取代对两种化合物抑制AR转录活性的能力具有显著影响，从而提供了对DBD结构域的作用的令人瞩目的证据。不排除化合物与AR其它结构域之间的可能的相互作用，但事实上，剪接变体的转录活性可能因对DBD的一些偏好的争议而受到强烈影响(数据未显示)。值得注意地，14449在≥25μM浓度下展示出对Y594D和Q592D突变体的抑制作用(数据未显示)，这启示任一突变都可以使化合物的结合平衡移动，或实际上，14449能够衔接作为第二靶标的LBD或NTD结构域。
在与全长AR比较时，14228/14449的抑制作用对于剪接变体较弱。可以达到对于瞬时表达的V7的70-90％抑制率的最大值(数据未显示)和对于内源性产生的V567es的50-70％(数据未显示)。这些抑制水平与EPI-001的抑制水平类似，当在浓度25μm下对与ARR3tk-荧光素酶报道基因共转染的PC3细胞测试时，可以达到对AR(1-653)截短的缺乏LBD的突变体～80％的抑制率(Andersen，R.J.等人，(2010)Regressionofcastrate-recurrentprostatecancerbyasmall-moleculeinhibitoroftheamino-terminusdomainoftheandrogenreceptor.CancerCell17，535-546)。
我们证实在已知抗雄激素药(恩杂鲁胺)和14228/14449的存在下，YFP-AR的核定位特性之间存在显著性差异(数据未显示)。尽管未受阻碍的核定位不会严格地排除14228/14449对LBD的作用，但是清楚地说明不同于恩杂鲁胺活性的机制，这促进了YFP-AR在细胞溶胶中的大量保留，可能通过替换R1881和改变AR蛋白质结构来进行(Watson，P.A.等人，(2010)Constitutivelyactiveandrogenreceptorsplicevariantsexpressedincastration-resistantprostatecancerrequirefull-lengthandrogenreceptor.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107，16759-16765；和Tran，C.等人，(2009)Developmentofasecond-generationantiandrogenfortreatmentofadvancedprostatecancer.Science324，787-790)。还启示14228/14449作用必须发生在核内，基需要破坏蛋白质-DNA相互作用。YFP-V7在药物的存在下或无药物存在下完全定位于核(数据未显示)这一事实也与预先的报道一致，表明恩杂鲁胺不能导致AR-V7再进入细胞溶胶(Watson，P.A.等人，(2010)Constitutivelyactiveandrogenreceptorsplicevariantsexpressedincastration-resistantprostatecancerrequirefull-lengthandrogenreceptor.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107，16759-16765)。
所观察到的核定位动力学与化合物影响AR结合染色质或改变dsDNA以纯化的AR-DBD结合的能力一致(数据未显示)。14228/14449可能无法完全消除DNA结合，但是可以按照这种方式相当地弱化或调节这种结合，以便防止核AR的专利激活。澄清14228/14449干扰AR结合雄激素效应元件的确切模式是重要的研究领域。
17.体内异种移植试验
最终，我们证实化合物14449在体内具有有利的治疗特征(图8)。除对动物没有可观察到的毒性作用外，还抑制肿瘤体积和PSA表达至与恩杂鲁胺治疗相差无几的水平。因此，靶向AR的DNA结合在体内可以与用恩杂鲁胺防止核转位(Tran，C.等人，(2009)Developmentofasecond-generationantiandrogenfortreatmentofadvancedprostatecancer.Science324，787-790)或通过用EPI-001阻断AR-NTD上的辅因子募集(Andersen，R.J.等人，(2010)Regressionofcastrate-recurrentprostatecancerbyasmall-moleculeinhibitoroftheamino-terminusdomainoftheandrogenreceptor.CancerCell17，535-546)同样有效。14449影响来自各种其它细胞系(雄激素敏感性的和雄激素依赖性的)的肿瘤异种移植物的能力面前正在进行中。
具有对AR剪接变体的活性的特异性AR-DBD抑制剂的鉴定对于治疗恩杂鲁胺抗性或或AR-变体驱动的去势抗性Pca而言具有极佳的潜能。
更具体地举出如下实施例(即18)，Li，H.等人，(2014)Discoveryofsmall-moleculeinhibitorsselectivelytargetingtheDNA-bindingdomainofthehumanandrogenreceptor.J.Med.Chem.10.1021/jm500802j。
18.14449的ARI抑制活性、PSA抑制和抗增殖活性
产物，对于预测的结合位点残基的定点诱变研究显示化合物14228和14449直接结合该位点。将野生型hAR和hAR突变体质粒(S579D、V582D、F583D、R586D、Q592D，Y594D和K610D)ARR3tk荧光素酶报道基因一起转染入PC3细胞，并且基于发光测定测试化合物14228、14449和恩杂鲁胺在10μM下的转录活性。经证实化合物14228和14449以浓度依赖性方式抑制AR-V7转录。将野生型hAR/ARV7质粒与ARR3tk-荧光素酶报道基因共转染入PC3细胞并且用化合物14228、14449和恩杂鲁胺处理。
尽管在此公开了本发明的各种实施方案，但是可以根据本领域技术人员的公知常识在本发明范围内进行许多改编和改动。这样的改动包括用已知等价物替代本发明的任一方面，以便以基本上相同的方式获得相同的结果。数字范围包括定义该范围的数字。措词“包含”在本文中作为开放式术语使用，基本上等价于短语“包括、但不限于”，并且措词“包括”具有相应的含义。如本文所用，单数形式“一个(a)”，“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代，除非上下文有清楚相反指示。因此，例如，提到“一个事情(athing)”包括多于一个这样的事情。本文中对参考文献的引用不是承认这些参考文献是针对本发明实施方案的现有技术。特别地和分别地将本说明书中引述的任何优先权对比文件和所有的出版物包括、但不限于专利和专利申请引入本文参考，如同指示将每篇出版物特别地和分别地引入本文参考一样，不过，没有完整地举出。本发明包括如上文所述的所有实施方案和变化形式，并且参照了实施例和附图。