为做好兽药研发指导工作，我部组织制定了《防治奶牛乳腺炎的抗微生物药靶动物安全性和有效性试验指导原则》《防治奶牛临床子宫内膜炎的抗微生物药靶动物安全性和有效性试验指导原则》《兽药残留消除试验指导原则》《畜禽用药物靶动物安全性试验指导原则》等4个试验技术指导原则，现予发布，请参照执行。
特此公告。
附件：1.防治奶牛乳腺炎的抗微生物药靶动物安全性和有效性试验指导原则
2.防治奶牛临床子宫内膜炎的抗微生物药靶动物安全性和有效性试验指导原则
3.兽药残留消除试验指导原则
4.畜禽用药物靶动物安全性试验指导原则
农业农村部
2020年8月26日
附件1
防治奶牛乳腺炎的抗微生物药靶动物安全性和有效性试验指导原则
一、概述
（一）目的
为指导研发单位开展抗微生物药物防治奶牛乳腺炎的安全性和有效性研究，特制定本指导原则。
（二）适用范围
适用于通过乳房灌注给药防治奶牛乳腺炎的制剂。
（三）术语
乳腺炎（Mastitis）：通常是由一种或多种病原微生物引起的乳腺炎症，以乳腺上皮细胞发生病理学改变为特征，继而出现炎症反应和分泌变化，受感染乳区白细胞增多。
临床型乳腺炎（Clinicalinfectiousmastitis）：1个或多个乳区有临床症状（肿胀、发热、痛感、潮红）且乳汁外观改变（凝乳块或絮状物、水样外观，颜色变化），并伴有或无一般临床症状（发热、食欲减少）的乳腺炎。
亚临床型（隐性）乳腺炎（Sub-clinicalinfectiousmastitis）：乳腺炎的一种形式，乳房和乳汁肉眼观察无异常，但乳汁理化性质发生变化，乳汁体细胞数明显增加，且细菌学培养存在病原微生物。
体细胞定量计数（Quantitativesomaticcellcount，QSCC）：利用库氏计数器或电子体细胞计数技术等测定乳汁中的体细胞数。
二、防治乳腺炎产品的靶动物安全性试验（刺激性试验）
（一）概述
研发单位应证明拟上市的用于防治奶牛乳腺炎的产品对靶动物是安全的。下述的安全性试验用于证明受试药对靶动物的安全性。另外，在疗效试验期间，药物发生的任何不良反应也应予以报告。
（二）受试动物
1.用于泌乳期的兽药
选择健康无乳腺炎的经产奶牛和初产奶牛各6头，每组应有半数奶牛（3头）的日产奶量在25kg以上（泌乳早期）、半数奶牛（3头）的日产奶量在15kg以下（泌乳后期）。
对每头受试动物应说明其年龄、泌乳阶段、挤奶次数以及日产奶量情况。
2.用于干乳期的兽药
选择6头正常经产奶牛（已完成2次及2次以上泌乳的经产奶牛）和6头初产奶牛（完成第一个哺乳期的初产奶牛）。
对每头受试动物应说明其年龄、挤奶次数方面的情况。对经产奶牛要说明前一个泌乳期的产奶量。
（三）受试药物
拟用于防治奶牛乳腺炎的制剂。
（四）给药与采样
1.给药前
给药前至少间隔24小时连续2次采集每头牛的4个乳区奶样，分别进行细菌培养鉴定和体细胞定量计数，以确定受试动物是否健康。
2.给药
在第2次采样后间隔24小时开始按照标明的药物给药方案给药，且每头牛的4个乳区均需给药。
3.给药后采样
（1）泌乳期产品
对于多次给药的产品，自第二次给药开始，每次给药前采集每头牛的四个乳区奶样，进行体细胞定量计数。并分别在最后一次给药结束后12小时和第7天采样进行细菌培养和体细胞定量计数。
（2）干乳期产品
分别于给药结束后12小时和第7天采集每头牛的4个乳区奶样，进行细菌培养和体细胞定量计数。
（五）数据收集与结果评价
一般临床观察：每天2次，对每头牛的4个乳区进行检查，并进行触诊，以表明有无肿胀、潮红和疼痛等反应；另外，在每个阶段还要通过定量计数方法测定体细胞数。
根据所收集的上述数据及临床检查结果确定防治乳腺炎产品对靶动物的安全性。
三、防治乳腺炎产品的药物有效性研究
（一）一般性原则
对治疗临床型乳腺炎的药物，其用药条件是：动物应存在某种入侵乳房的病原菌、有细胞学反应且牛奶出现异常，或者出现临床症状（如肿胀、潮红和痛感），或者两者同时存在。对治疗亚临床型乳腺炎的药物，其用药条件是：动物应存在某种入侵乳房的病原菌和有细胞学反应。
在临床研究中，乳腺炎致病菌分布情况将用于确定标签的疗效说明。这需要有足够数量的主要乳腺炎致病菌以证明其有效性。
应报告体细胞定量计数结果。该信息将用于检查在各治疗组内“治愈”和“未治愈”奶牛体细胞定量计数平均值之间的变化趋势。
数据收集应来自具有代表性的靶牛群。为此应对靶牛群中所有泌乳或非泌乳奶牛（取决于标签说明中拟用的适应证）进行检查，所有符合条件的奶牛（被感染的奶牛）都应入选至试验中。
应提交牛群/奶牛的一般性描述数据，这些数据包括整个成年牛群的大小、当前泌乳的奶牛数、牛群中被取样的泌乳奶牛数和百分率、感染乳腺炎的泌乳奶牛数和百分率、每头奶牛的大致年龄、品种、当前日产奶量、泌乳次数和泌乳阶段。
在进行亚临床型传染性乳腺炎研究时，建议试验前进行细菌培养/取样调查。试验前的培养或取样检查应包括来自整个牛群中所有泌乳奶牛的全部乳区的奶样，牛群中所有感染乳区应包括在研究中。
确定治疗临床型乳腺炎的复方产品疗效则应按目前对复方药物的要求进行研究，建议申报单位在研发这类产品前有必要对提交数据的要求以及特定复方产品的优点进行分析讨论。
供临床试验的牛群必须有足够数量的临床乳腺炎病例以满足对各组的动物数要求。在开始研究前应详细说明（规定）牛群数和在每个牛群的分组情况。
建议采用盲法研究，并提供所用盲法的详细情况。
（二）临床试验
1.剂量筛选试验（Ⅱ期临床试验）
包括一个对照组和至少3个药物剂量组，其中3个药物剂量组由一个不十分有效的较低剂量组、一个推荐剂量组和一个较高但并不比推荐剂量更有效的剂量组组成。剂量筛选试验应至少在两个奶牛场执行。每个奶牛场每组动物不少于15头。
2.剂量确认试验（Ⅲ期临床试验）
以剂量筛选试验中确定的有效剂量为基础，试验设计时必须包含一个对照组，最好是阴性对照组。如果未使用阴性对照研究应说明理由。对于原创药物，由于我国各地气候和地域地理条件不同，剂量确认试验应至少在两个地区（南方、北方各一个）进行，并由不同的研究机构实施。每个地区每组动物不少于30头。
3.评价参数
评价药物有效性的关键参数是用药后的临床反应和细菌学培养结果。研究人员应参照奶牛乳腺炎诊断的微生物学程序进行细菌学培养和鉴定。
（三）用于泌乳期奶牛临床型乳腺炎的兽药
1.动物入选标准
（1）试验动物以患有临床型乳腺炎的泌乳期奶牛（如含有凝乳块、絮状物及水样外观的视觉异常乳和/或乳房出现如肿胀、潮红和痛感的临床症状）为单元。一般只有单个乳区患有临床型乳腺炎的奶牛才能被登记用于试验。
2.治疗前采样（研究者在治疗前应对牛群进行筛选，以使感染某一病原菌的牛在各治疗组中均匀分配）
（1）在治疗前采集一份乳样进行微生物学检查和体细胞定量计数。测定分离的乳腺炎病原菌最小抑菌浓度（MIC）和MIC临界点，以评估病原菌对新的抗感染药物的敏感性。
（2）采样时应对来自受试乳区的乳样进行临床型乳腺炎症状（如凝乳块、絮状物、水样外观的异常奶）检查。每次挤奶时将阳性结果记录在动物的数据记录表中，并与每次挤奶时的日常检查收集的数据进行汇总。
3.治疗
只有单个乳区感染的奶牛才被用于治疗试验。在入选试验期间，若奶牛的其它非用药乳区发生乳腺炎，则从试验中剔除该奶牛，但不认为是治疗失败。在评估疗效时应剔除对其他炎症乳区要求和/或接受治疗的奶牛。对照选择包括：试验前后对比、与已批准的对照药物治疗对比。
4.治疗后采样
5.疗效的评估
（1）根据给药后7～14天之间对照组的试验结果评价治愈情况。只有在治疗前从乳样中分离出乳腺炎病原菌的临床型乳腺炎病例才能用于计算治愈率。体细胞定量计数仅作为检查各治疗组内“治愈”和“未治愈”奶牛的平均体细胞数之间的变化趋势。
（2）治愈标准：临床上治愈的乳区必须泌乳正常、无临床型乳腺炎症状，且在微生物学分离培养上，治疗前乳样中分离出的乳腺炎病原菌在治疗后采集的奶样中不得再分离出。
（3）来自临床研究的乳腺炎病原菌分布情况将用于确定标签的疗效说明。例如，对葡萄球菌和链球菌性乳腺炎病原菌有效的抗微生物药适应证是：“用于治疗由葡萄球菌属（如金黄色葡萄球菌）和链球菌属（如无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌）细菌引起的临床型乳腺炎”。
（四）用于泌乳期奶牛亚临床型乳腺炎的兽药
所有防治泌乳期奶牛乳腺炎的抗微生物药必须对临床型乳腺炎有效，一般不会单独批准仅用于防治泌乳期奶牛亚临床型乳房炎的产品。要获得治疗亚临床型乳腺炎的适应证，则需要另外提供亚临床型乳腺炎的试验数据。
选择阳性乳区（感染）的奶牛用于亚临床型乳腺炎治疗试验。研究者在采样前应对牛群进行筛选以尽可能使病原菌在各治疗组中平均分配。
2.治疗前采样
在亚临床研究中，对任何奶牛只治疗一个乳区。对存在多个乳区感染的奶牛，将随机选择其中的一个感染乳区进行治疗，其他乳区不用药治疗。如果其他乳区因临床型乳腺炎而要求额外治疗时，则应从研究中剔除该奶牛。
5.治愈的评价标准
（1）在治疗后7～14天期间根据阴性对照组研究结果评估治愈情况。在亚临床治疗研究中，体细胞定量计数结果如临床研究一样只用于检查体细胞数的变化情况。
（2）治疗前从乳样中分离出的乳腺炎病原菌在治疗后采集的乳品中应不得再检出。
（3）依据亚临床研究中获得的有效数据，产品将得到类似下面的适应证说明：用于治疗由葡萄球菌属（如金黄色葡萄球菌）、链球菌属（如无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌）细菌引起的临床和亚临床型乳腺炎。
（五）用于干乳期奶牛亚临床型乳腺炎的药物
对拟用于干乳期的药物，有必要分别进行治疗和预防效果研究。治疗将意味着消除干乳期奶牛中已有的感染，而预防则意味着防止干乳期奶牛出现新的感染。
对预防性用药，有必要通过阴性对照组确定新感染比率。
将进入泌乳后期准备干奶的奶牛纳入试验研究中。
2.给药前采样
研究者在治疗前1周应从每个乳区采集2次乳样用于微生物分离培养，2次乳样的采样间隔至少为24小时，其中第二份样品在预期干奶的当天采集。其中一份来自给药前的奶牛每个乳区的奶样用于测定体细胞定量计数。
3.给药
用于干乳期治疗和预防的药物，入选奶牛的所有乳区应在第二次乳样采集后通过乳房灌注给药。
4.给药后采样
用于干乳期治疗和预防的药物，应在奶牛产犊后1～5天内从每个乳区采集两次样品用于细菌分离培养，两次采样间隔应为24小时。同时测定每个乳区第2份奶样的体细胞定量计数。
5.疗效的评价标准
（1）对于治疗药物：在再次泌乳时微生物培养应为阴性且无临床症状。
（2）对于预防药物：阳性对照组的，受试药的预防效果应不显著低于阳性对照组的疗效；设阴性对照组的，则受试药组的新增感染率至少降低50%。
（3）体细胞定量计数的结果只用于临床研究中检查体细胞数的变化情况。
四、疗效的判定标准
以下各表所示的给药前和给药后细菌学分离培养结果是本文中所述的采集一份或2份乳样的检测结果。这些组合可外推至其他病原菌。
（一）用于泌乳期奶牛的产品
表1临床型乳腺炎治疗结果
给药前培养结果1
给药后培养结果2
结果判定
SA3
-
对SA治愈
STA4
对STA治愈
SA
STA
对SA治愈5
对STA治愈5
对SA治疗失败
对STA治疗失败
注释：
1.对于传染性乳腺炎病原菌（金黄色葡萄球菌和无乳链球菌），只要有一份样品出现阳性培养结果，动物即可入选试验中，对于其他病原菌，给药前的2份样品连续培养均必须为阳性的动物才可入选试验研究。
2.对于所有病原菌，在治疗后只要有一份样品出现阳性培养结果（与治疗前样品中分离培养出的细菌相同），即为治疗失败。
3.金黄色葡萄球菌。
4.无乳链球菌。
5.在给药前分离出一种病原菌而在给药后分离出另一种不同病原菌的病例应予以记录；这种事件的发生率在最终的试验报告表中应给予表述。
注：应在原始数据表中记录给药前和给药后乳汁异常迹象和乳腺炎的临床症状。
表2亚临床型乳腺炎治疗结果
1.对于传染性乳腺炎病原菌（金葡菌和无乳链球菌），只要有一份样品出现阳性培养结果动物即可入选试验中，对于其他病原菌，给药前的两份样品连续培养均必须为阳性的动物才可入选试验研究。
2.对于所有病原菌，在治疗后只要有一份样品出现阳性培养结果（与治疗前样品中分离培养出的细菌相同）即为治疗失败；
3.金黄色葡萄球菌；
4.无乳链球菌；
（二）用于干乳期乳腺炎的药物
表3治疗干乳期亚临床型乳腺炎结果
表4预防干乳期亚临床型乳腺炎结果
未出现新感染
出现新感染
1.对于预防适应证，所有给药前的细菌培养结果应为阴性。
注：
1.传染性的亚临床型乳腺炎的预防效果应能使新感染至少应下降50%；
2.应测定一份来自给药前乳样的体细胞定量计数。
附件2
防治奶牛临床子宫内膜炎的抗微生物药靶动物安全性和有效性试验指导原则
为指导研发单位开展抗微生物药防治奶牛临床子宫内膜炎的安全性和有效性研究，特制定本指导原则。
适用于治疗奶牛临床子宫内膜炎的抗微生物药物。
临床子宫内膜炎（Clinicalendometritis）：在产后21天或以后发生，从阴道中排出子宫黏液脓性或脓性分泌物，但无全身症状。
二、防治临床子宫内膜炎产品的靶动物安全性试验
研发单位应证明拟上市的防治奶牛临床子宫内膜炎产品对靶动物的安全性。下述安全性试验用于证明受试药物对靶动物的安全性。另外，在疗效试验期间，药物发生的任何不良反应也应予以报告。
选择10头产后无临床子宫内膜炎的健康奶牛，对每一受试动物的描述应说明年龄、泌乳阶段、生产次数以及日产奶量情况。
拟用于治疗临床奶牛子宫内膜炎的制剂。
（四）药物处理
1.处理前期
在处理前，应采用直肠触诊、阴道检查和/或B超诊断评价奶牛子宫状态，并进行评分（见表1）。
2.药物处理
以推荐剂量和给药方案给药。
3.处理后期
给药后3周（下一个生殖周期）或21～30日（下一个生殖周期不发情奶牛），应采用直肠触诊、阴道检查和/或B超诊断评价奶牛子宫状态，并进行评分（见表1）。
药物处理前、处理期间及处理后期的资料应包括动物身份的识别信息、试验地点、试验动物数、观察日期、试验天数，每头牛的奶产量和体温。
根据收集的上述数据及临床检查结果确定防治奶牛临床子宫内膜炎产品对靶动物的安全性。
三、防治临床子宫内膜炎产品的药物有效性研究
1．对于防治奶牛临床子宫内膜炎的药物，其用药条件是：在产后21日以后，奶牛至少应存在一种入侵子宫的病原体感染和存在奶牛阴道排出非正常的子宫分泌物的症状。
2．在临床研究中，子宫内膜炎致病菌的分布情况将用于确定标签疗效的说明，因此在研究中要有足够数量（不少于2类菌种共计不少于60株）的主要子宫内膜炎的致病菌以证明其疗效，同时对分离的致病菌进行拟申请兽药活性成分的药敏试验。
3．收集的数据应来自具有代表性的牛群。为此，应对靶牛群中所有奶牛进行检查，所有符合条件的奶牛都应包括在试验中。应提交牛群/奶牛的一般性描述数据，包括整个成年牛群的大小、当前泌乳的奶牛数、牛群整体的受孕率，每头奶牛的大致年龄及品种、日产奶量。
4．微生物学分离培养上，治疗前子宫分泌物中分离出的病原体在治疗后的检测样本中应不能再分离到。如果治疗前未分离到某种病原体，则治疗后的样本中同样不应分离到同种病原体。
5．来自III期临床的子宫内膜炎病原体分离情况将被用于确定标签的疗效说明。例如：对化脓隐秘杆菌、大肠杆菌、溶血性链球菌等所致子宫内膜炎有效的抗微生物药物适应证是：“用于治疗由化脓隐秘杆菌、大肠杆菌和链球菌属如溶血性链球菌引起的子宫内膜炎”。
1．子宫内膜炎II期临床试验
初步评价拟申请的治疗奶牛子宫内膜炎的新兽药对奶牛子宫内膜炎的防治作用和安全性，确定合理的给药剂量方案。试验设计内容如下：
（1）试验动物及入选和剔除标准
试验动物选用自然感染病例，均应经执业兽医师临床诊断确证发生子宫内膜炎后方可进行临床试验。试验动物每组不能低于10头。
奶牛入选标准：入选奶牛体况评分应大于2.5分且至少在产后3周以上。
奶牛剔除标准：体况评分小于2.5分；剖腹产、胎衣不下、阴道损伤等有临床可见产科系统疾病和其他严重系统性疾病的奶牛不能入选；入选15日前经全身给药治疗或产后21日之前经子宫注入抗菌药物或生殖激素的奶牛不能入选。
（2）试验材料
③分离菌株：用于测定对受试药物和对照药物的敏感性。
（3）试验分组
临床试验均应采用随机原则分组。具体要求如下：
①根据受试药物的药物的性质和体外抑菌试验结果初步确定给药剂量，一般设高、中、低3个剂量组，并设药物对照组（阳性对照组）。
②如果受试药物是复方制剂，药物对照组应根据组方中各主要成分分别设单方临床推荐剂量对照组。
（4）感染和病例的确诊
通过临床症状、直肠触诊、阴道检查、B超诊断、致病菌的分离和鉴定等确诊为试验所需致病菌感染的发病奶牛才能作为试验病例，各组试验病例的发病严重程度应基本一致。
（5）给药方案
②观察临床症状：应详细观察和记录试验开始后给药前、给药后3周（下一个生殖周期）或21～30日（下一个生殖周期不发情奶牛）后各组奶牛的一般临床症状和特殊症状的表现以及症状的发生、发展、转归和消失情况，并尽量用定量指标来评估。临床症状评分可参考下表进行，也可修改但须进行说明。
表1子宫内膜炎评分标准
诊断
方法
临床症状评价标准
评分
直肠
触诊
子宫有弹性，正常大小
0
子宫肿胀，子宫壁增厚
1
子宫肿胀明显，子宫壁厚薄不均
2
阴道
检查
无黏液或清澈的黏液，子宫无肿胀
黏液含有白色或灰白色絮片样或干酪状物质（脓片）
子宫分泌物中含＜50%呈白色或灰白色黏液/黏脓性物，有异味的分泌物
子宫分泌物中含＞50%呈白色或灰白色黏液/黏脓性物，有严重异味的分泌物
3
子宫
拭子
细菌分离无特定病原菌
细菌分离有特定病原菌
B超
宫腔无回声，子宫颈0～2.5cm
宫腔内有线状无回声，子宫颈0～2.5cm
宫腔内有无回声液性暗区，内膜边缘不规则，子宫颈2.5～5cm
宫腔增大，宫腔内有回声液性暗区，子宫颈>5cm
根据所采用的诊断方法设置的分值范围，将临床子宫内膜炎分类为轻度、中度和重度。若4种诊断方法全部采用，可参考以下分类：
表2子宫内膜炎临床分类
临床分类
0分
子宫内膜正常
1～3分
轻度子宫内膜炎
4～6分
中度子宫内膜炎
7～8分
重度子宫内膜炎
③临床有效率、治愈率计算
试验开始后详细观察和记录各组奶牛给药前和用药后临床症状评分和发病程度，分为恢复正常或症状好转，按如下公式计算各组奶牛的有效率和治愈率，并采用卡方（χ2）检验进行显著性分析。
临床治愈率=恢复正常奶牛数/发病奶牛数；
临床有效率=症状好转奶牛数/发病奶牛数；
必要时，对细菌分离情况进行统计分析。
（7）结果判断
①试验的可靠性：在整个试验中，药物对照组须有效，否则选择其它兽药重做试验。
②可用有效率和治愈率进行判断，并与各对照组进行比较及统计学分析。
③结论：确定受试药物对本适应证的有效剂量和推荐剂量；并提出临床应用该兽药的注意事项、不良反应以及兽药的相互作用等。
2.子宫内膜炎III期临床试验
试验动物选用自然感染病例，均应经执业兽医师临床诊断确证发生子宫内膜炎后方可进行临床试验。试验动物每组不能低于30头。
奶牛剔除标准：体况评分小于2.5分；有剖腹产、胎衣不下、阴道损伤等有临床可见产科系统疾病和其他严重系统性疾病的奶牛不能入选；入选15日前经全身给药治疗或产后21日之前经子宫注入抗菌药物或生殖激素的奶牛不能入选。
临床试验应采用随机原则分组。依据II期临床剂量筛选试验获得的推荐剂量，一般设推荐剂量组和药物对照组（阳性对照组），如确有必要可增设发病空白对照组（安慰剂处理组）。
②观察临床症状：应详细观察和记录试验开始后给药前、给药后3周（下一个生殖周期）或21～30日（下一个生殖周期不发情奶牛）后各组奶牛的一般临床症状和特殊症状的表现以及症状的发生、发展、转归和消失情况，并尽量用定量指标来评估。临床症状评分可参考表1进行，也可修改但须进行说明。
①试验的可靠性：在整个试验中，药物对照组须有效，否则选择其他兽药重做试验。
③结论：确定受试药物推荐剂量给药对本适应证的有效性。
附
临床子宫炎（Clinicalmetritis）：未出现全身性症状，但子宫异常增大，自阴道中排出水样红褐色液体至灰白色脓性子宫分泌物。
产后子宫炎：是一种通常发生在奶牛产后10日内由子宫病原菌感染导致的急性系统性疾病。在产后21日内，主要临床症状包括：奶牛子宫异常增大并排出红褐色恶臭的水样分泌物，严重病例同时伴有全身症状如产奶量下降、精神沉郁、食欲不振或厌食、心率加快和毒血症症状，体温超过39.5℃。产后子宫炎通常伴随胎衣不下、难产、死胎，通常多发生在产后7日内，极少发生在产后7～14日内。
子宫炎：是指奶牛子宫复旧延迟并且恶露排出期延长，但无发热症状。
子宫积脓：奶牛产后存在持久黄体并且宫颈封闭，子宫内存在脓性分泌物积聚的症状。
附件3
兽药残留消除试验指导原则
（一）定义与目的
凡申请在食品动物（如牛、羊、猪、禽等）使用的兽药均需进行残留消除试验确定休药期。
二、分析方法
由于残留消除试验样品一般来自动物可食性组织或蛋、奶等产品，具有取样量少、药物浓度低、内源性物质干扰多（如激素、维生素、胆汁以及可能同服的其他药物）以及个体差异大等特点，因此必须建立灵敏、专一、精确、可靠的生物样品定量分析方法，并对方法进行确证。
分析方法可采用标准方法、非标准方法以及允许偏离的标准方法。
标准方法包括：国家标准、农业部公告、CAC、AOAC、美国FSIS、欧盟等检测方法标准。允许偏离的标准方法包括：超出标准规定范围使用的标准方法；经过扩充或更改的标准方法。
标准方法和允许偏离的标准方法按照方法学验证的要求进行验证。非标准方法需要按照兽药残留检测方法制定要求进行。
分析方法一般采用外标法，当绝对回收率达不到要求或有可能影响定量等其他因素时，建议采用内标法。优先选择待测分析物的同位素替代化合物作为内标，也可以使用不影响残留消除试验结果准确性的其他物质作为内标。
（一）常用分析方法
目前常用的分析方法主要有：
1.色谱法：高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、色谱－质谱联用法（LC-MS、LC-MS-MS，GC-MS，GC-MS-MS）等，可用于大多数药物的检测。从目前发展看，生物样品的分析一般选择色谱法，这类方法灵敏度、特异性、准确性一般都能适应残留消除研究的需要。具体选用何种分析方法应根据药物的化学结构、理化性质、仪器条件以及借鉴文献方法多方面因素来考虑确定。
2.免疫学方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法等，多用于蛋白质多肽类物质的检测。
3.微生物学方法：主要用于抗生素或部分抗寄生虫药的检测，如果抗微生物药的代谢产物仍有抗菌活性，则不宜选用微生物法。
（二）方法学验证
方法学验证是整个残留消除研究的基础。为了保证分析方法可靠，必须对方法进行充分验证，一般应进行以下几方面的考察。
1.特异性
指在样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确、专一地测定分析物的能力。必须证明所测定物质是受试药品的原形药物或特定活性代谢物，生物样品所含内源性物质和相应代谢物、降解产物不得干扰对样品的测定，如果有几个分析物，应保证每个分析物都不被干扰。应确定保证分析方法的最佳检测条件。对于色谱法至少要考察空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图。采用LC-MS、LC-MS/MS法时应考察分析过程中的基质效应，基质效应应不超过LOQ的20%。
2.标准曲线和定量范围
有些分析（如微生物分析）可能需要对数（log）转换才能达到线性，而其他分析[如酶联免疫吸附测定法（ELISA）、放射免疫测定法（RIA）]可能需要更复杂的数学函数以确立浓度与响应值之间的关系。也应通过评价选定函数生成的残差确认使用该函数时的可接受性。
3.检测限和定量限
建立分析方法时，应测定背景信号（噪音）的标准偏差，确定方法的检测限（limitofdetection，LOD）和定量限（limitofquantitation，LOQ）。LOD为噪音均值加3倍标准差，LOQ为噪音均值加10倍标准差。LOQ一般是标准曲线的最低浓度，表示测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。LOQ原则上应低于1/2MRL。
4.准确度与精密度
分析物浓度*
准确度的可接受范围
<1μg/kg
50%～120%（-50%至+20%）
≥1μg/kg、<10μg/kg
60%～120%（-40%至+20%）
≥10μg/kg、<100μg/kg
70%～110%（-30%至+10%）
≥100μg/kg
80%～110%（-20%至+10%）
*μg/kg=ng/g=ppb
精密度是指在确定的分析条件下，相同基质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。通常用质控样品的批内和批间RSD来考察方法的精密度。
分析物浓度
批内，%CV
批间，%CV*
≤30%
≤45%
≤25%
≤32%
≤15%
≤23%
≤10%
≤16%
*按照Horwitz公式计算：CV=2(1-0.5logC)，式中，C=以小数表示的浓度（例如，1μg/kg输入为10-9）。
一般要求选择高、中、低3个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度考察。低浓度选择标准曲线的最低浓度；高浓度接近于标准曲线的上限；中间选一个浓度。在测定批内精密度时，每一浓度至少制备并测定5个样品。为获得批间精密度应至少在不同天连续制备并测定3个分析批，至少45个样品。
5．样品稳定性
（1）基质中稳定性
（2）处理样品的稳定性
6．微生物学分析
上述分析方法确证的很多参数和原则也适用于微生物学或免疫学分析，但在方法确证中应考虑到它们的一些特殊之处。微生物学或免疫学分析的标准曲线本质上是非线性的，所以应采用比化学分析更多的浓度点来建立标准曲线。结果的准确度是关键因素，如果重复测定能够改善准确度，则应在方法确证和未知样品测定中采用同样的步骤。
微生物学或免疫学分析方法确证实验应包括在几天内进行的6个分析批，每个分析批包括4个浓度（LOQ，低、中、高浓度）的质控双样本。
7．质量控制
应在生物样本分析方法确证完成以后开始测定未知样品。在测定生物样品中的药物浓度时应进行质量控制，以保证所建立的方法在实际应用中的可靠性。推荐由独立的分析人员配制不同浓度的质控样品对分析方法进行考核。
每个未知样品一般测定一次，必要时可进行复测。来自同一个体的生物样品最好在同一批中测定。每个分析批生物样品测定时应建立新的标准曲线，并随行测定高、中、低3个浓度的质控样品。每个浓度至少双样本，并应均匀分布在未知样品测试序列中。当一个分析批中未知样品数目较多时，应增加各浓度质控样品数，使质控样品数大于未知样品总数的5%。质控样品测定结果的偏差一般应小于15%，低浓度点偏差一般应小于20%。如质控样品测定结果不符合上述要求，则该分析批样品测试结果不可采用。
标准曲线的范围不能外延，任何浓度高于定量上限的样品，应采用相应的空白基质稀释后重新测定。对于浓度低于定量限的样品，在进行休药期分析时，应以无法定量（Notdetectable，ND）计算。
整个分析过程应当遵从预先制订的实验室SOP以及GLP、GCP原则。
三、试验设计
（一）受试药物
（二）动物及饲养管理
产品适用的不同靶动物应分别进行消除试验。在肉牛进行的试验结果可以应用于非泌乳奶牛，反之亦可。成年反刍动物牛、羊的数据可以外推到犊牛和羔羊，若有证据表明反刍动物反刍前和成年之间的代谢有明显不同，需要单独进行反刍前犊牛和羔羊的消除试验。
对于泌乳期奶牛/羊需单独进行奶中的残留消除试验，制定弃奶期。
用于乳房内灌注研究的奶牛必须是无乳房炎的健康奶牛。
所有动物在试验前必须有足够的适应期，饲养过程尽可能接近商业正常的方式。动物自由采食和饮水。
（三）动物数量
不同动物的消除试验每个采样点对动物的要求如下：
1．牛、羊及猪体内组织残留消除试验
最少16只动物分4个采样点进行残留消除试验。每个采样点至少4个动物。建议动物体重分别为：牛约250～400kg、羊约30～60kg、猪约40～80kg。
2．奶中残留消除试验
对于泌乳期的动物，高产奶量动物和低产奶量动物每组至少各10头；对于干乳期的动物，至少应有20头动物。
3．禽的残留消除试验
组织残留消除试验必须保证至少4个采样点，每个点6只动物；蛋中残留试验必须保证至少4个采样点，每个采样点收集10枚或以上的蛋。
（四）给药
给药途径和方式必须按照标签、说明书进行，如用于注射的产品，要遵守给药部位和给药方法的规定。对于多次给药的产品，注射给药必须在动物的左右两侧相同部位交替给药。
乳房灌注的药物制剂必须同时给予4个乳区。干乳期给药必须在最后一次泌乳后和下一次分娩前进行。
如果一个产品可以用于多种肠道外途径给药，则要求分别进行残留消除试验。如果休药期是依据注射位点的消除数据制定，这时不需要再进行静注给药的消除试验。
用于全身治疗作用具有多个经皮肤给药途径（如浸渍、喷雾和浇泼）的产品，应选择药物吸收量和程度最佳的皮肤给药途径进行残留消除试验。
动物屠宰采用商业方式，一般采用放血处死。不允许采用化学处死方法。
（五）采样
在停药当天（牛、羊、猪组织8～12小时，家禽组织2～6小时，奶2～12小时）必须有一个采样点，最后一个采样点应低于残留限量。
在每个采样点，要采集足够量的样品。采集的样品不得进行任何洗涤或处理，所取样品应立即均匀分成若干等份、包装并做好标记，保存于-20℃冰箱，对于残留物有可能不稳定的样品应置于相应要求的温度下存放至测定。
推荐的可食性组织采样方式见表1。
表1残留消除试验中推荐的可食性组织采样方式
可食性
组织
样品类型
动物品种
牛/羊
猪
家禽
肌肉
背长肌
胸肌
注射位点
以注射点为中心，取样约0.5kg；肌注：10cm（直径）×6cm（深）；皮下注射：15cm（直径）×2.5cm（深）
收集整个给药部位样品，如整个脖子、整个胸部肌肉、整个腿部。体型较大的取样不超过0.5kg
肝
外缘纵切
全部
肾
双肾各取等量
双肾取全量
脂肪
肾周脂肪（Peri-renal）
—
皮肤/脂肪
带皮的脂肪
奶
蛋
洗净蛋壳，取蛋白和蛋黄混合
肌注和皮下注射给药的产品，必须采集最后一次给药注射位点的肌肉。其他经皮给药的药物也要进行给药位点的药物残留测定，比如浇泼剂要采集给药部位的肌肉、皮下脂肪等。
如果分析的样品为两种或两种以上的复合样品，如带皮的脂肪（猪、禽），则不再单独进行脂肪、皮的测定。牛、羊的脂肪样品仅指肾周脂肪，猪和禽应采集皮脂。
（六）休药期为零天的残留消除试验
（七）样品测定
样品中残留量必须采用经验证的定量检测方法进行检测。每种组织均进行平行双样品测定。
（八）数据汇总与分析
靶动物组织中残留休药期可以采用WT1.4软件（Withdrawal-TimeCalculationProgram）或相当的程序进行计算，奶中残留休药期可以采用WTM1.4软件（Withdrawal-TimeCalculationProgramforMilk）或相当的程序进行计算。确定制定休药期的靶组织和最终推荐的休药期。
四、试验报告
残留检测方法的确认试验可以和残留消除试验合并撰写报告，也可以单独按照《兽药残留检测方法验证指导原则》规定的格式撰写报告。报告应符合GLP和GCP的质量管理要求。
附件4
畜禽用药物靶动物安全性试验指导原则
本指导原则适用于申报用国内外已上市的原料药研发的畜禽用药物新制剂或增加靶动物的已上市制剂等。对局部应用的药物通常不要求进行靶动物安全性试验，但供全身皮肤用药、可能引起全身吸收作用的药物以及通过局部用药发挥全身作用的药物则应进行靶动物安全性试验。对于含全新创制的原料药制成的制剂进行的靶动物安全性试验应参照VICH的《兽药靶动物安全性指导原则》（VICHGL43Guidelineontargetanimalsafetyforveterinarypharmaceuticalproducts）进行。
该指导原则旨在为获得与靶动物安全性评价有关的必要信息而提供一般性指导（说明）。特提出进行合理解释。
二、基本原则
1．靶动物安全性试验应根据养殖业生产实际开展，以保证评价结果的科学性、客观性。
2．靶动物安全性试验原则上应对受试药物所适用的每种靶动物分别进行。
3．靶动物安全性试验应在符合兽药GCP条件下进行。
4．靶动物安全性试验的设计应充分考虑实验动物毒理学研究的结果。
（一）试验动物
1．品种
靶动物安全性试验一般选择受试药物拟用的健康且具有代表性的动物种属和类别。
2．试验阶段
应根据药物的推荐使用阶段慎重选择动物的年龄。如果该制剂预期用于幼龄未成熟动物，则靶动物安全性试验中的动物通常选用拟申请产品适用的最低年龄；否则，应使用成熟健康动物。畜禽靶动物安全性试验阶段可参考下表。
畜禽靶动物安全性试验阶段选择参考表
药物使用阶段
试验阶段
哺乳仔猪
断奶仔猪
哺乳、断奶仔猪
生长、育肥猪
生长猪
猪全程
仔猪或生长猪
泌乳母猪
分娩前两周至断奶
犊牛或羊羔
成年牛、羊
牛、羊全程
繁殖母猪、牛、羊
受精至断奶，至少一个繁殖周期
肉鸡
全程
产蛋鸡
产蛋高峰期
4．饲养环境
（二）受试药物
（三）动物分组与剂量设计
1．剂量与分组
一般设置4个试验组：空白对照组、推荐剂量组、中间剂量组（高于推荐剂量）和估计的药物中毒剂量组。一般选择最大推荐剂量的倍数，分别为1、3、5倍剂量组，另设空白对照组。毒性强的药物可以根据具体情况设计1、2、3倍最大推荐剂量试验组。对安全范围较窄的药物，还可按1、1.5和2倍的最大推荐剂量进行试验。
2．动物数
靶动物安全性试验通常包括相对少量的试验单元，每个试验组大动物（如牛）、繁殖母猪等不少于4头，中动物（育肥猪、羊等）不少于6头，小动物（鸡、鸭、鹅、家兔等）不少于8只。除非产品预期仅用于一种性别，原则上每个剂量组应包含雄性和雌性动物各半。
（四）给药方案
1．给药途径与方法
按标签说明书中推荐的给药途径和方法给药。
2．给药周期
（五）试验周期
每个靶动物安全性试验都要进行一个完整的试验周期，试验周期包括实验环境适应期、给药周期和停药后观察期。一般情况下环境适应期为一周，给药周期按给药方案进行，停药后观察期一般不能少于7天；用于繁殖动物药物的靶动物安全性试验周期应为一个繁殖周期。
（六）观察指标
1．临床观察
对试验中出现死亡的动物应进行尸检，如果可能，最好进行组织学分析，并尽可能明确病因。
2．血液学检查
3．病理学检查
（1）尸体解剖学检查
在试验期间出现与药物有关的临床症状或生理生化指标明显异常的动物均应屠宰并进行尸体解剖学检查；如果未见异常的试验，只对最高剂量组和空白对照组全部动物进行剖检（用于繁殖母畜的药物除外），分别在给药结束时和试验结束时各屠宰50%的动物，详细检查心、肝、脾、肺、肾、胸腺、胰腺、胃、十二指肠、回肠、直肠、淋巴结、脑、骨髓等器官有无异常。
（2）组织病理学检查
尸体解剖学检查时出现异常的器官均应进行系统的组织病理学检查；如果各器官未见异常时，取高剂量组和空白对照组的心、肝、脾、肺、肾等器官进行组织病理学检查。
4．其他特异性观测指标
根据受试药物的作用特点和用途，增加相应的特异性观测指标和敏感性功能指标（如：对在繁殖母畜上使用的药物，应考察受孕情况、产活仔数和哺乳成活数等；对在泌乳母畜上使用的药物，则应考察断奶仔畜的体重和断奶成活率等；对具有免疫调节作用的药物，则应增加免疫学观察指标等）。
（七）数据记录与结果分析
1．在试验实施过程中，试验方案所涉及的内容均应逐一记录。数据记录应真实、准确、完整、规范、清晰，并妥善保管。数据的有效位数以所用仪器的精度为准，采用国家法定计量单位和国家推荐使用的单位。
2．统计分析
选择合适的统计分析程序，对数据进行分析。比较试验组与对照组间各项指标（如血液学和血液生理生化等）的显著性差异，分析药物不良反应产生的原因，并提出注意事项。
为公正、科学地评价药物对靶动物的安全性，对试验报告做如下要求：
（一）试验报告应提供试验获取的所有数据，包括所有试验动物。未纳入统计分析的数据或由于数据缺乏、数据丢失而无法评价的情况也应报告，并说明在各组别中的分布情况。
（二）每个靶动物安全性试验必须单独形成最终报告，报告应符合GLP和GCP的质量管理要求。