中国每年人用狂犬病疫苗批签发数量较大、应用广泛。在国家层面的指导原则和多年的临床实践的基础上，多款安全有效的人用狂犬病疫苗问世，生产厂商对疫苗需求的应对能力也已逐步增强。
近年来，我国狂犬病疫苗开发上取得了突破性进展，在狂犬病防控上成效显著，但距离完全消除狂犬病尚有一段距离。随着疫苗产能释放和扩大，狂犬病疫苗供应的紧张局面已经得到一定的缓解。
自2019年12月开始施行《中华人民共和国疫苗管理法》后，一系列针对疫苗从研发到流通全生命周期的监管要求和细则陆续实施标志着我国疫苗行业进入高质量发展阶段。
同时，由于近年来公众深刻认识疫苗在防治工作中的重要作用，对于高品质疫苗的使用需求强烈，需求端的转变也对疫苗研发不断提出更高的要求，纯度更高、抗原结构更完整的狂犬病疫苗或能满足这种需求。
未来，随着更多高质量狂犬病疫苗产品上市，将为狂犬病疫苗市场带来新的增长动力。本文将从狂犬病毒感染的防治体系进行深入剖析，从实际的临床需求出发，追踪狂犬病疫苗产品的迭代方向，与全行业参与者共同探索人用狂犬病疫苗生产工艺的创新与改良。
一、狂犬病社会危害大，我国潜在的病毒暴露风险始终存在
狂犬病介绍——病毒病原学、传播途径和临床表现
狂犬病毒有多种分型，经过一系列狂犬病毒多样性遗传进化研究，国际病毒分类委员会（ICTV）设立了狂犬病病毒属（lyssavirus）。
人群间的狂犬病病例大多是由于被患狂犬病的动物咬伤所致，少数是由于被抓挠或伤口、粘膜被污染所致。临床上多以特异性恐风、恐水、咽肌痉挛、进行性瘫痪等为表现，一旦感染后发病，可达到近100%的致死率1。
狂犬病的流行病学和疾病负担分析
狂犬病是重要的公共卫生威胁，据WHO统计，每年全球狂犬病死亡例数约59,000例，狂犬病造成的经济损失估计为每年86亿美元2,3。其中，95%的狂犬病死亡人数来自于亚洲和非洲地区，印度为当前狂犬病疫情最为严重的国家，我国人间狂犬病发病数仅次于印度。
尽管国内狂犬病流行情况持续改善，然而我国作为狂犬病流行国家，拥有庞大的暴露人群，据中国疾病预防控制中心的数据显示，我国每年狂犬病暴露人群高达4,000万。
我国绝大多数狂犬病病例是由猫狗咬伤或者抓伤所致，但现阶段从动物切入狂犬病防治的路径在我国实施的情况不甚理想，日益庞大且疏于管理的犬只等动物数量是限制我国“彻底消除狂犬病”目标实现的主要阻碍之一。
随着人们饲养宠物习惯的逐渐兴起，我国正掀起一阵宠物热潮。在养宠群体逐步扩大、宠物数量不断攀升的背景下，猫狗咬伤新发病例数的增长趋势明显，并且宠物注射兽用狂犬病疫苗的接种率仍处于低水平，可见狂犬病传染源将持续存在，病毒暴露的高风险水平提示着增强狂犬病预防的必要性4。
图：中国猫狗咬伤新发例数（2017-2030E）
二、设立完善的狂犬病防控体系需多管齐下，疫苗是暴露前后至关重要的预防手段
在社会公众层面，社会组织积极科普狂犬病预防知识，提高狂犬病预防与动物致伤预防意识，强调对犬只进行科学管理，提升犬主责任养犬意识的重要性。医疗卫生行业层面的措施包括疫情监测、流行病学调查、暴露前后疫苗接种、暴露处置工作等广泛的形式。
对于狂犬病防控体系的重视在一定程度上是由于目前临床上尚无治疗狂犬病的有效方法，部分治疗手段可以延缓临床进程，但很少能影响疾病的结果。
作为可预防的病毒性疾病，在暴露前或在伤口暴露后迅速给予疫苗的注射是最为有效的处置方式。人类防控过程中，人用狂犬病疫苗的开发使用为预防与控制狂犬病提供了必要的技术条件，同时充足供应的高品质疫苗也给暴露风险人群提供了高效安全的防控手段。
回顾人用狂犬病疫苗的发展历程——从神经组织疫苗至细胞培养疫苗
现代生物技术的发展为疫苗研究提供了更多可能性，为了安全、高效、低成本地生产制造疫苗，人们在培养病毒的细胞基质和工艺优化方面不断进行探索和改进。
人类尝试借助人用狂犬病疫苗预防和控制狂犬病的历史已经延绵一百余年，从早期的动物神经组织疫苗、禽胚疫苗、细胞培养的粗制疫苗，逐渐发展为原代地鼠肾细胞、鸡胚细胞、人二倍体细胞和Vero细胞培养的纯化疫苗。
图：狂犬病疫苗发展历程
1885年，法国的巴斯德使用被狂犬病毒感染的兔子的脊髓浆液，研制出用于暴露后预防的第一代减毒狂犬病疫苗，又称巴斯德疫苗5。巴斯德的方法被证明是有效的，然而由于疫苗含有高含量的髓鞘成分，通常伴有神经系统残留而引起的变态反应，包括后续一系列改进和完善之下的其他动物脑组织生产的灭活疫苗。
采用细胞和组织胚胎培养技术制备狂犬病疫苗的方法取得了显著的进展，逐渐替代早期的神经组织疫苗。1965年，日本Kondo将FluryHEP株病毒适应在鸡胚细胞培养，制成灭活疫苗6。加拿大的Fenje等将SAD株病毒在原发性地鼠肾细胞上培养，该技术生产的疫苗于1968年获加拿大批准适用于狂犬病的暴露前和加强免疫7。
以避免使用原代细胞培养在质量控制上所固有的难点，国外开始研制以人二倍体细胞为基质的细胞狂犬病疫苗。1961年，美国Wistar研究所的Haytlick等首创性地选择了人二倍体细胞株WI-38进行病毒繁殖8。
随后，法国Merieux研究采用MRC-5细胞实现了狂犬病毒在人二倍体细胞中的产业化培养，且该疫苗取得了良好的效果，于1978年获得生产许可，在北美、欧洲等国家正式上市至今9。
由于人二倍体细胞疫苗难以规模化生产以满足工业化需求，且价格昂贵限制了该疫苗在发展中国家的使用，通常仅适用于少数的发达国家10。
Vero细胞系的出现为狂犬病疫苗的规模化生产带来了巨大的变革。最初，用Vero细胞系生产人用疫苗的开创性工作是法国的Merieux研究所发起的。
1985年，基于Yasumura和Kawikata于1962年建立的Vero细胞系，法国Merieux研究所使用固定毒种PM1503-3M株，经过超滤浓缩、梯度密度离心纯化、βPL灭活等工序成功研究出纯化的Vero细胞狂犬病疫苗（维尔博）并获得生产许可11，且数项研究证明其在暴露前后具有良好的安全性和免疫原性12。
回顾中国人用狂犬病疫苗发展历程——“量变”先行，“质变”仍在升级
紧跟着西方发达国家的步伐，我国人用狂犬病疫苗的生产技术同步处于快速迭代的进程中。与西方发展路径类似，先后经历了组织疫苗和细胞培养疫苗两个阶段，其中细胞培养疫苗包括未浓缩的原代细胞疫苗、浓缩疫苗和纯化疫苗，经过精制纯化工序处理的疫苗拥有着更高的质量水平和免疫效果。
1980年以前，我国使用和生产经石炭酸灭活的羊脑组织悬液制备的狂犬病疫苗，但频繁出现接种后不良反应严重、免疫效果不佳等现象13。
自1965年，我国开始研制原代地鼠肾细胞培养的原液灭活疫苗。由卫生部武汉生物制品研究所牵头，长春生物制品研究所、兰州生物制品研究所和中国药品生物制品检定所等单位开展合作，使用狂犬病固定毒株aG株，通过原代地鼠肾细胞适应传代出的疫苗于1980正式生产和应用14,15。
彼时，疫苗的总体预防效果良好，但依然出现一些免疫失败的病例，可归因于未经浓缩的疫苗含有的抗原量偏低，疫苗效价未达到WHO规定的标准，即每剂2.5IU。
为了进一步提高疫苗的质量，卫生部于1993年决定采用浓缩或浓缩纯化疫苗，后续研发厂商对疫苗原液进行了3至5倍的浓缩16。实践证明，从“淡苗”发展至“浓苗”，疫苗的免疫性有了明显提高。
然而由于市售的浓缩疫苗多数未经纯化，大规模人体接种后出现明显的副作用，严重不良反应率达到5%~10%17。其原因分析可能是由于生产过程中加入异质蛋白如小牛血清、含病毒的豚鼠脑组织和培养病毒的地鼠肾细胞蛋白16。鉴于安全性考量，国家药品监督管理局要求对浓缩后的狂犬病疫苗进行纯化。
与此同时，为了避免疫苗诱导免疫的时效性受到影响，狂犬病疫苗由佐剂疫苗向无佐剂疫苗转变。2005年起，药监局明确要求狂犬病疫苗产品需要去除氢氧化铝佐剂。从狂犬病疫苗的研发、生产和应用的实践经历来看，品质升级是提高疫苗保护效果、降低疫苗接种者不良反应发生率的本质所在，而质量的不断改进源于生产技术的持续创新，往后至今我国狂苗的生产厂商和研究机构仍在追求“质变”的道路上继续前进。
在细胞培养基质方面，Vero细胞疫苗和人二倍体细胞疫苗随后陆续登陆中国市场，为人群提供多样化的免疫保护选择。1990年以来，我国研制或引进Vero细胞为基质的纯化狂犬病疫苗大量上市。
2002年，辽宁成大引进微载体生物反应器细胞培养技术，利用巴斯德疫苗的PV2061株狂犬病病毒和Vero细胞进行培养生产抗原，采用分子筛柱层析技术纯化狂犬病毒，研发的疫苗（SPEEDAPVRV）于2005年获批使用。
三、细胞基质特点各异，其安全有效、易于标准化、规模化生产为用于疫苗生产的重要考量标准
目前我国广泛使用的细胞基质包括地鼠肾细胞、鸡胚细胞、Vero细胞和人二倍体细胞。从病毒毒株的种类来看，PM株主要用于人二倍体细胞狂犬病疫苗的生产，aG、CTN-1V、PV-2061株主要用于Vero细胞狂犬病疫苗的生产，地鼠肾细胞疫苗和鸡胚细胞疫苗的生产分别采用aG株和Flury-LEP株。
疫苗生产用细胞基质是开发和生产候选病毒疫苗的主要原材料，对疫苗的质量、产量和安全性有着直接影响。在当前完善的疫苗药品监管机制之下，从临床使用经验和观察来看，不同种类狂犬病疫苗的安全性和效力均良好，主要的差异性或集中体现在疫苗生产技术。
图：我国目前上市应用的人用狂犬病疫苗种类
长期以来，以鸡胚细胞和地鼠肾细胞为代表的原代细胞被广泛用于生产人用减毒和灭活疫苗。在体外培养时，原代细胞通常以贴壁形式生长，其主要采用的转瓶工艺较为成熟、细胞培养液相对简单，因此，具有对多种病毒广泛敏感且制备简单的优势。
人二倍体细胞是采用人源细胞（通常为胚胎组织）建立的细胞株，解决了以往原代细胞疫苗的病毒培养中细胞基质源头相对不稳定带来的污染风险，提高了疫苗的质量和安全性。同时，人二倍体细胞能够使用细胞种子库系统生产，利于后续进行充分鉴定和质量控制，为疫苗生产过程带来更稳定和可控的条件。
然而，体外传代培养时，由于通常传代到50多代的有限代次，导致工业化放大受到限制；细胞只能进行二倍增殖，单批产品细胞数量较低；狂犬病毒在人二倍体细胞中的适应性不够理想，导致病毒培养原液的病毒浓度较低。这些影响了其规模化生产，对疫苗培养原液进行深度纯化的工艺难度也将更高，工艺杂蛋白残留和细胞DNA残留可能导致过敏反应的出现，而人源细胞自身的遗传基因缺陷也带来了一定的潜在风险。
狂犬病疫苗发展史中最晚被发现的细胞培养基质是Vero细胞，该细胞作为传代细胞系可在体外进行连续传代，在生产中可安全传代至150代，且增殖倍数可大于4倍增殖，同时能够使用种子细胞库系统生产，这些特性使得Vero细胞成为狂犬病毒适应性较高的培养基质，有助于实现工业化生产、大规模培养以获得大量的病毒。
此外，可通过深度纯化从而去除宿主蛋白和宿主DNA残留，使产品的不良反应发生率进一步降低。
四、人民生活水平及认知不断升级，对于产品质量的追求随之而来
狂犬病疫苗领域过去百年的发展史，也正是人类认知规律的演变史。从首款疫苗产品的诞生，到疫苗生产量能否满足需求，到如今追求疫苗效力和品质。随着新冠疫情的爆发，人们对于疫苗品质和效力的认知逐渐深刻，未来狂犬病疫苗行业的市场竞争或将进一步升级。秉承着“以质制胜”，生产厂商的研发实力和技术迭代速度也将面临更高的挑战。
2017至2021年间，伴随着多起事件，我国人用狂犬病疫苗批签发量出现上下波动。2018年疫苗行业内长春长生事件发生后，中国人用狂犬病疫苗批签发量呈现严重的下滑现象，一度在5,000万支左右徘徊。
期间，狂犬疫苗标准经历了从2015年版《中华人民共和国药典》到2020年版《中华人民共和国药典》的更新。随着新版药典的执行，中国人用狂犬病疫苗又迅速上升至8,000万支左右，近年来趋于稳定。根据批签发量稳定在8,800万支计算，产值规模达到了94亿元。
图：中国人用狂犬病疫苗批签发量，2017-2021
目前，按批签发量统计，我国市场上主流的狂犬病疫苗以Vero细胞培养基质作为生产工艺。
作为狂犬病疫苗产品，无论是哪种培养基质作为生产工艺，其有效成分均为灭活的狂犬病毒。但由于目前产品的纯化程度接近，市场上普遍采用细胞基质作为狂犬病疫苗的分类依据。将我国的疫苗批签发量按培养细胞类型拆分，2021年，88.8%的狂犬病疫苗基于Vero细胞，人二倍体细胞疫苗和地鼠肾细胞疫苗分别占比5.8%和5.4%。
未来，Vero细胞或将持续成为狂犬病毒细胞培养基质的主要类型。从重要狂犬病疫苗生产商的研发动向来看，赛诺菲正在进一步深化Vero细胞疫苗的布局。根据赛诺菲2022年的年报信息披露，赛诺菲正在研发基于Vero细胞培养基、无血清培养技术的下一代人用狂犬病疫苗（VRVg），致力于替代赛诺菲巴斯德旗下两款已经进入商业化阶段的产品（Imovax和Verorab）。
图：中国人用狂犬病疫苗批签发量，按细胞类型拆分，2021
截至2023年6月30日，美国有2款人用狂犬病疫苗在市场上销售，分别是赛诺菲的人二倍体狂犬病疫苗Imovax和诺华的鸡胚细胞疫苗RabAvert。相比之下，中国狂犬病疫苗领域的生产厂商和产品种类较多，获批的人用狂犬病疫苗厂商达到21家。
其中，人用狂犬病疫苗（Vero细胞）有14家，代表性生产厂商包括成大生物、依生生物等；人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）有6家，代表性生产厂商包括亚泰生物、远大生物等；人用狂犬病疫苗（人二倍体细胞）有1家，生产厂商为康华生物。
图：中国已上市人用狂犬病疫苗，按细胞类型拆分
市场新进入者产品同质化程度高，生产工艺和产品品质的升级是差异化竞争的“利器”
研发厂商争相布局狂犬病疫苗领域，截至2023年6月30日，中国正处于临床研究阶段的人用狂犬病疫苗共有20种。按照培养细胞基质分类来看，其中Vero细胞有12种，人二倍体细胞有6种，鸡胚细胞有2种。代表性在研发厂商包括荣盛生物、瑞贝斯、津斯特、金迪克等已进入临床III期阶段。
目前，在多数的生产流程中，病毒培养步骤均采用生物反应器大规模培养技术（鸡胚基质除外），或者改变对于血清的依赖程度，其结果主要表现在病毒单收液的病毒总量大小的差别；市售产品的纯化工艺基本类似，分离原理多数属于分子筛性质，利用分子量大小差异或浮力密度差异将病毒收获液中的有效成分与杂质进行分离。
在21世纪初，辽宁成大凭借率先引进生物反应器技术的先发优势，使得其产品上市后三年开始至今稳坐狂犬病疫苗市场第一把交椅近20年。现阶段，由于狂犬病疫苗技术的突破性研究成果极少，寻找新的技术突破口难度较大。生产厂商之间所采用的生产工艺同质性极高，未来的竞争可能会趋向于价格战。然而，从长远来看，以“品质见长”的产品不易受到价格制约、更易突出重围。
近年来，我国经济水平的巨大跃进扭转着国民的消费观念，这也意味着高品质产品进一步渗透的市场潜力将激发新的增长曲线。
图：临床在研人用狂犬病疫苗分析
创新技术路线带来产品品质的提升，将在激烈的市场竞争中“脱颖而出”
针对狂犬病灭活疫苗来说，有效成分是灭活的狂犬病毒，而获得100%纯度及完整结构的灭活狂犬病毒是生产厂商追求的理想目标。良好的工艺设计、合理的工艺步骤以及完善的生产设施设备是达到理想目标的重要基础。
以Vero细胞疫苗为例，其制备的工艺流程涵盖种子细胞制备、细胞大规模培养、病毒接种、病毒培养、病毒收获、病毒液浓缩、病毒灭活、浓缩液纯化、半成品配制、分装等。其中，培养、纯化以及质量控制等核心工艺步骤的技术升级在持续进行中。
从培养工艺来看，我国使用Vero细胞制备疫苗主要采用的培养工艺是生物反应器微载体培养工艺，其兼具贴壁培养和悬浮培养技术的优点，培养环境稳定，生产过程易于控制，可使气体、热量及营养物质传递均匀，利于实现大规模高密度培养。部分厂商如荣盛生物、津斯特和柏奥特克等选择直接悬浮培养的工艺，通过使Vero细胞在无血清培养基中适应悬浮生长后用于疫苗生产。
基于获得100%纯度及完整结构的灭活狂犬病毒的理想目标，在保证能提供大量的病毒单收液的情况下，良好的分离纯化技术将起到至关重要的作用。对标国际标准，我国对于人用狂犬病疫苗的成品质量要求更高。
据2020年版《中华人民共和国药典》所设立的质量标准，对人用狂犬病疫苗（Vero疫苗）中残余宿主细胞DNA不能超过3ng/剂。FDA的《用于生产和传染病适应症的病毒疫苗的细胞基质和其他生物材料的特性和鉴定》以及CDE的《基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则》中建议，残留的细胞宿主DNA片段不能超过一个功能基因的长度，即约200bp。由于狂犬病毒的浮力密度和分子量，去除宿主DNA和宿主蛋白的纯化工艺步骤以层析纯化技术为主。
目前，许多厂商采用的纯化手段为采用非特异性的分子筛层析方法对病毒收获液进行纯化，其中多数厂商的纯化技术沿用或是基于巴斯德研究所使用的分子筛层析方法，这也是现在国内主要采用的的纯化Vero细胞狂犬病疫苗的技术。此外，亦有部分厂家增加核酸内切酶降解浓缩液中DNA以缩短DNA片段。
在众多的申报项目中，已有部分企业迈出这关键一步，差异化地选择离子交换工艺，能够进一步去除疫苗原液成分中的牛血清、可溶性细胞蛋白和培养过程中的添加物等小结构杂质。通过应用这类工艺，或将会带来狂犬病疫苗产品的迭代升级。
五、总结
然而创新不止，业内的疫苗研发厂商仍致力于利用现代生物技术完善出更为优质的疫苗产品、更为科学适用的生产工艺模式，引领狂犬病疫苗的研发重心从量到质的转换。
从疫苗的细胞培养基质来看，Vero细胞凭借其自有的特性，使得生产厂商践行“量”和“质”并举的愿景成为可能。再到工艺的选择上，现阶段已有部分先进企业采用前沿的生产工艺及技术，在对产品充分研究的基础上进行改进提升，为市场带来高品质“狂苗”产品的同时，进一步提升生产的可控性、稳定性，在产品的制造过程中采用全流程的大规模生产装备连续生产，使得疫苗生产顺应现代制药工业的发展趋势。
同时，这些创新工艺也将促进我国整体疫苗产业的国际竞争力，提升中国在全球疫苗领域的地位与影响力。
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校稿|Gddra
编审|Hide/Bluesea
编辑设计|Alice
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