1、农药登记毒理学细菌回复突变1范围GB/T15670的本局部规定了细菌回复突变试验的根本原那么、方法和要求.本局部适用于为农药登记而进行的细菌回复突变试验.2术语和定义以下术语和定义适用于本文件.2.1回复突变试验reversemutationtest利用一组鼠伤寒沙门氏菌和/或大肠杆菌检测引起细菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的需要某种经基酸的菌株分别为组氨酸或色氨酸成为不需要外源性供给皴基酸的菌株的突变,即是由营养缺陷型回变到野生型.2.2碱基置换型致突变物basepairsubstitutionmutagens引起DNA分子中一个或多个碱基对置换的物质.在回复突变试验,此改变可能发生
3、他详见下述各培养基及溶液说明.1.1营养肉汤培养基牛肉浸膏5g氯化钠5g胰陈10g磷酸氢二钾K2HPO43H2O2.6g加蒸饰水至1000mL加热溶解,调节pH至7.4,分装后0.103Mpa,20min灭菌,保存期不超过6个月,1.2营养肉汤琼脂培养基琼脂粉1.5g加营养肉汤培养基至100mL加热溶解,调节pH至74,0.103Mpa,20min灭菌.1.3底层培养基即最低营养培养基5.3.1Vogel-Bonner(V-B)培养基柠檬酸(C6HQ7H2O)2.0g磷酸氢二钾(K2HPO4)10.0g磷酸氢铉钠(NaNH4HPO4-4H2O)3.5g硫酸镁(MgSOQHq)0.2g加
4、蒸播水至200mL逐个将化学物在少量蒸镭水中单独溶解后,硫酸镁水溶液在最后缓慢参加,加蒸用水至200mLo0.103MPa,20min灭菌,4c保存备用.6.3.220%葡萄糖溶液葡萄糖20.0g加蒸馀水至100mL,0.055MPa,20min灭菌.7.3.31.5%底层琼脂培养基琼脂粉15g加蒸饰水至700mLV-B培养基200mL20%简萄糖溶液100mL配制：首先将前两种成分于0.103MPa下高压灭菌20min后,再参加后两种成分,充分混匀倒底层平板.按每皿25mL相对于90mm平皿制备平板,冷凝固化后倒置于37c培养箱中24h,备用.5.4顶层培养基5.4.1顶层琼脂琼脂粉3.
5、0g氯化钠2.5g加蒸饰水至500mL0.103MPa,20min高压灭菌.D-生物素分子量24412.2mgL-组氨酸分子量1557.8mg或L-盐酸组缄酸分子量1929.6mg加蒸储水至100mL,贮于4c冰箱中.5.4.3顶层培养基制备加热融化顶层琼脂,临用时每100mL顶层琼脂中加10mL0.5mmol/L组经酸-生物素溶液大肠杆菌那么需配制0.5mmol/L色包酸-组级酸-生物素溶液,分装在三角烧瓶中,0.103MPa,20min灭菌.用时融化分装小试管,每管2mL,在45c水浴中保温.5.5S9辅助因子混合液试剂的配制5.5.11盐溶液1.65mol/L氯化钾KC1+0.4mo
6、l/L氯化镁MgCh氯化钾KC16.15g氯化镁MgCb6H2.4.07g蒸镭水50mL0.103MPa,20min高压灭菌或滤菌.5.5.20.2mol/L磷酸盐缓冲液pH7.4磷酸氢二钠NazHPOJ14.2g/500mL440mL磷酸二氢钠NaHzPOHzO13.8g/500mL60mL0.103MPa,20min高压灭菌或滤菌.5.5.3辅酶-H氧化型溶液准确称取辅酶-0,用无菌蒸储水溶解配制成0.025mol/L溶液,低温保存-20C以下.5.5.4葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液称取钢萄糖-6-磷酸钠盐,用无菌蒸储水溶解配制成0.05mol/L,低温保存-20以下.5.610%S9
7、混合液配制每10mL由以下成分组成,临用时配制.磷酸盐缓冲液0.2mol/L,pH7.46.0mLMgCL-KCl盐溶液0.2mL葡萄糖6磷酸钠盐溶液0.05mol/L1.0mL辅酶-II溶液0.025mol/L1.6mL肝S91.0mL无菌蒸馀水0.2mL混匀,置冰浴中待用.5.7活化系统大鼠肝S9的诱导和制备选健康雄性成年SD大鼠或Wistar大鼠,体重200g左右.将多氯联苯Aroclo254或国产PCB-五氯溶于玉米油中,按500mg/kg体重一次腹腔注射,5d后处死动物,处死前12h禁食,但可自由饮水.苯巴比妥钠和.-蔡黄酮结合也可做为诱导剂,健康雄性大鼠体重200g左右,经口或腹
8、腔注射80mg/kg体重苯巴比妥钠和80mg/kg体重0-荼黄酮,连续3d.处死前16h停止饮食,但可自由饮水.由于化学物质经腹腔注射,容易引起肝脏形成外膜,不易剥离,推荐使用经口濯胃的方式.处死动物后取出肝脏称重,用新鲜冰浴的0.15mol/L氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次,以去除抑制微粒体酶活性的血红蛋白.每克肝湿重加0.15mol/L氯化钾溶液3mL,连同烧杯移入冰浴中,用消毒剪刀剪碎肝脏,在玻璃匀浆器低于4000i7n】in,往复1min2min或组织勾浆器20000r/min,1min中制成肝匀浆.以上操作需注意无菌和局部冷环境.将制成的肝匀浆在低温04高速离心机上,以9000g离心10
9、min,吸出上清液为S9组分,分装于无菌冷冻管或安瓶中,每安甑2mL左右,最好用液氮或干冰速冻后置-80C低温保存.上述全部操作均在冰水浴中和无菌条件下进行.制备肝S9所用一切手术器械、器皿等,均经灭菌消毒.S9制备后,其活力需经诊断性诱变剂进行鉴定.S9制成后,经无菌检查,蛋白含量测定Lowry法,每亳升蛋白含量应不超过40mg,因过量蛋白将会抑制回复突变率,并经间接致癌物诱变剂鉴定其生物活性合格后贮存于深低温或冰冻枯燥,保存期不超过一年.5.8特殊试剂和培养基的配制5.8.1氨羊青露素溶液8mg/mL：称取三羟氨芾青霸素80mg,参加0.02mol/L氢氧化钠溶液10mL,无菌配制,保存于
10、4C冰箱.5.8.20.1%结晶紫溶液：称取结晶紫10mg,加10mL无菌水.5.8.3四环素溶液8mg/mL：称取四环素40mg,参加0.02mol/L盐酸溶液5mL,保存于4冰箱,用于四环素抗性试验和氨茉青霉素-四环素平板.5.8.4L-组氨酸溶液和0.5mmol/LD-生物素溶液：称取L-组包酸404.3mg和D-生物素12.2mg,分别溶于100mL蒸储水,0.103Mpa,20min灭菌,保存于4冰箱.5.8.5亚假设青霸素平板用作TA97、TA98、TA100菌株的主平板和疆苇青霉素-四环素平板用作TA102菌株的主平板,每1000mL由以下成分组成：底层培养基980mL组氨酸水溶
11、液10mL0.5mmol/L生物素6mL0.8%氨茉青霉素溶液3.15mL0.8%四环素溶液0.25mL四环素仅在使用对四环素有抗性的TA102时参加c以上成分均已分别灭菌或无菌制备.5.8,6组刎酸-生物素平板组氨酸试验用,每1000mL由以下成分组成：底层培养基984mL组缎酸水溶液10mL0.5mmol/L生物素6mL以上成分均已分别灭菌.5.8.7二甲基亚碉DMSO：0.103Mpa,20min灭菌.6菌株及其鉴定与保存6.1.1推荐使用鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100.TA102作为四株标准测试菌株.TA97和TA98可以检测各种移码型致突变物：TA100可检
12、测碱基置换型致突变物：TA102能检测出其他测试菌株不能检出或极少检出的某些诱变剂,如甲醛、各种过氧化氢化合物和丝裂蠹素C等交联剂.一般用来测试受试物诱变性时,应通过上述四个菌株的检测.必要时可增加TA1535、TA1537、TA97a、大肠杆菌WP2uvrA或大肠杆菌WP2uvrAPKM101任一菌株.试验菌株的基因型和检测类型见附录A.lo6.1.2也可采用以下的菌株组合：鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100.TA102和TA1535,洪中TA97可用TA97a或TA1537替换,TA102可用大肠杆菌WP2uvrAPKM101或WP2uvrA替换.6.2菌株的鉴定6.2.1应
13、进行菌株鉴定的情况菌株特性应符合细菌回复突变试验的要求,见附录A.2.突变型菌株的某些特性易丧失或变异,遇到以下情况应鉴定菌株的基因型：a在收到培养菌株后；b当制备一套新的冷冻保存株或冷冻枯燥菌株时；c当每皿自发回变数不在正常范围时；d当对标准诱变剂丧失敏感性时；e初次投入使用前.7.2.2增菌培养在营养肉汤培养基中接种贮存菌株培养物,于37振荡100次/min培养10h或静置培养16h备用.8.2.3组氨酸缺陷型和色氨酸缺陷型的鉴定6.2.3.1加热融化底层培养基两瓶一瓶不加组疑酸,一瓶加组经酸,不加组氨酸者每100mL培养基中加0.5nunol/LD-生物素0.6niL：加组氨酸者每1
15、KM101的顶层培养基,再加极微量的结晶-L色氨酸,置37c培养12h241】后观察结果.在加色氨酸的区域生长,可见一白色圆形菌苔,说明其对色叁酸的依赖.6.2.4脂多糖屏障缺陷型的鉴定6.2.4.1加热营养肉汤琼脂培养基.6.2,4.2接种：取菌液0.1mL移入平皿,迅速将营养肉汤琼脂培养基50适量倒入平皿,混匀,平放凝固.将无菌滤纸一片放入已凝固的培养基平皿中央,用移液器在滤纸片上滴加0.1%结晶紫溶液10pL,37c培养24h,每菌做一个平皿.6.2.4.3结果：阳性者在滤纸周围出现一个透明的抑制带,说明存在rfa深粗型突变.这种变化引起某些大分子物质进入细菌体内并抑制其生长.TA97、
16、TA97a>TA98、TA100、TA102.TA1535和TA1537均有抑制带,野生型鼠伤寒沙门氏菌没有抑制带.6.2.5.1加热营养肉汤琼脂培养基,冷却至50C左右,适量倒入平皿中,平放凝固,用移液器吸0.8%氨茉青蠹素10UL,在凝固的培养基外表沿中线涂成一条带,待纨芾青霉素溶液干后,用接种环与额假设青街素带相交叉划线接种要鉴定的菌株,并且接种一个不具有R因子的菌株作为氨苇青露素抗性的对照一个平皿可同时鉴定几个菌株,37培养24h.6.2.5.2结果：菌株TA97、TA97a.TA98、TA100.TA102和大肠杆菌WP2uvrAPKM101经过24h培养,在皴茉青零素带的周围
17、依然生长不受抑制,即有抗氨羊青蠹素效应,证实它们带有R因子.6.2.6四环素抗性的鉴定6.2.6.1用移液器各吸5HL10hLO.8%四环素溶液和0.8%氨芾青霉素溶液,在营养肉汤琼脂培养基平皿外表依中线涂成一条带,待四环素和亚羊青露素干后,用接种环与四环素和缎茉青霉素带相交叉划线接种TA102和一种有R因子的菌株作四环素抗性的对照,37c培养241】.6.2,6.2结果：TA102菌株生长不受抑制,对照菌株有一段生长抑制区,说明TA102菌株有抗四环素效应,其他菌株均无四环素抗性.6.2.7uvrB修复缺陷型的鉴定6.2.7.1在营养肉汤琼脂培养基外表用接种环划线接种需要的菌株.6.2,7.
19、37培养48h计数菌落数.6.2.8.4结果：每一株的自发回变率应落在正常范围内.6.3菌株保存鉴定合格的菌种应保存在深低温如-80C或参加9%色谱级二甲基亚碉作为冷冻保护剂,液氮条件下-196C,或者冷冻枯燥制成干粉,4保存.除液氮条件外,一般不超过两年,主平板贮存在4,二个月后丢弃,TA102主平板两周应该丢弃.7试验方法7.1受试物配制受试物的溶剂首选无菌双蒸水,不溶于水的或水溶性低的受试物,首选二甲基亚飒每平皿参加二甲基亚碉的量不得超过0.4mL,选用其他溶剂须说明理由.7.2剂量与分组对可溶性无细菌毒性的受试物,推荐的最高试验剂量是5mg/皿或5卜工/皿：否那么,受试物最高剂量应为
20、细菌毒性的剂量或出现沉淀,沉淀不应干扰菌落计数c最低剂量可考虑为0Ng/皿.评价含有潜在致突变杂质的受试物时,试验剂量可高于5mg/皿或5HL/皿.每一受试物至少设5个剂量组,可按0.55000卜电/皿剂量设定,也可根据预试验结果按等比组距设定需要的浓度范围.7.2.2对照组设定7.2.2.1每次试验都应包括同时进行的有或无代谢活化的菌株特异性阳性对照和阴性溶剂对照组.阳性对照应选择适当的剂量,以证实每次试验的有效性.7.2.2,2阳性对照物根据菌株的类型选择,见附录B.7.2.2.3试验应包括阴性溶剂对照组,阴性对照组的处理方法除无受试物外其他处理与剂量组相同.试验也应包括空白对照组
21、,除非历史资料证实所选择的溶剂无毒性或无致突变作用.7.3试验方法7.3.1平板掺入法增菌培养：将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内,37c振荡100次/min培养10h至对数增长期,每亳升不少于1x109个活菌数,培养瓶可用黑纸包裹,以防光线照射细菌.底层培养基平皿,每个剂量加S9及不加S9均做3皿.融化顶层培养基分装于无菌小试管,每管2mL,在45c水浴中保温.在保温的顶层培养基中依次参加测试菌株新鲜增菌液0.1mL,然后加0.1mL受试物和0.5mL火菌缓冲液需活化时那么参加10%S9混合液0.5mL,再混匀,迅速倾入底层培养基上,转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上,
22、平放固化,37培养48h观察结果.8.3.2预培养平板掺入法预培养对某些受试物可取得较好效果,因此可根据情况确定是否进行预培养.在参加顶层琼脂前,先进行以下预培养步骤：在试验中,将受试物0.1mL需活化时另参加10%S9混合液0.5mL和菌液0.1mL,在37培养20】m11,或在30c中培养30min,然后再加2mL顶层琼脂,其他同上述平板掺入法.9.3.3点试法增菌培养：将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内,37c振荡100次/min培养10h至对数增长期,每亳升不少于1x109个活菌数,培养瓶可用黑纸包裹,以防光线照射细菌.底层培养基平皿,每个剂量加S9及不加S9均做
23、3皿.融化顶层培养基分装于无菌小试管,每管2mL,在45c水浴中保温.在水浴中保温的顶层培养基中参加测试菌株增菌液0.1mL需活化时另参加10%S9混合液0.5mL,混匀,迅速倾入底层培养基上,转动平皿,使顶层培养基在底层上均匀分布.平放固化后取无菌滤纸圆片直径6mm,小心放在已固化的顶层培养基的适当位置上,用移液器取适量受试物如10.L点在纸片上,或将少量固体受试物结晶加到纸片或琼脂表而,37C培养48h观察结果.8试验结果和评价8.1试验结果应报告受试物各剂量组、阳性对照组、阴性溶剂对照组、空白对照组的各个平板回变菌落数,均数及标准差.8.2试验结果的评价8.2.1以直接计数培养基上回变菌落数的多少而定.如在背景生长良好条件下,测试菌株TA1535、TA1537及大肠杆菌的受试物组回变菌落数等于或大于阴性对照组的平均数值的3倍,其他测试菌株的受试物组回变菌落数等于或大于2倍