本发明属于生物技术领域，具体涉及一种使感染沃尔巴克菌(Wolbachia，wPip)白纹伊蚊雌蚊不育的方法。
背景技术：：
沃尔巴克菌(Wolbachia)是一种具有母性垂直遗传的胞内革兰氏阴性共生菌，自然界约有40％的节肢动物携带了该菌群。它们能够调控宿主生殖功能，如诱导宿主发生胞质不亲和(Cytoplasmicincompatibility,CI)。CI是指受精子和卵子的细胞质无法相容，导致胚胎不能正常发育，出现早期死亡。当感染沃尔巴克菌雄虫与没有感染或者感染不同类型雌虫交配后，便会诱导CI。因此，一种基于该共生菌控制害虫和疾病媒介的策略，也叫胞质不相容技术(Incompatibleinsecttechnique,IIT)，已被逐渐认可。IIT是一种经济、环保、有效的生物防控方法，主要通过大量释放携带沃尔巴克雄性昆虫到野外中，与正常雌性昆虫交配，产生的后代无法孵育，降低甚至局部消灭目标昆虫种群数量(也叫种群压制策略)。在1967年，首次利用该技术成功地完全压制住缅甸当地一个村庄的库蚊种群(丝虫病传播媒介)。
对于白纹伊蚊，目前通过胚胎显微注射已经建立起一种新型沃尔巴克菌(wPip)感染蚊株，该株雄蚊与野生雌蚊交配时可以诱导完全CI，被认为是用来控制野生白纹伊蚊种群的蚊种之一。由于目前并没有白纹伊蚊的雌雄分离株，在野外释放之前必须将通过分离器后残留的雌蚊一只只挑选出来，消除种群替代的威胁，然而，人工去雌的效率低下，无法适用于大规模运用。
技术实现要素：：
本发明的目的是提供一种能大大提高生产效率，适于大规模运用的使感染新型沃尔巴克菌白纹伊蚊雌蚊不育的方法。
本发明的使感染新型沃尔巴克菌白纹伊蚊雌蚊不育的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将白纹伊蚊雌蛹或含有白纹伊蚊雌蛹的白纹伊蚊雄蛹置于X射线下照射，使得白纹伊蚊雌蛹不育。
优选，所述的白纹伊蚊雌蛹的蛹龄小于等于24小时，白纹伊蚊雌蛹数目或白纹伊蚊雌蛹和白纹伊蚊雄蛹总数目在一千个以内时，其X射线照射剂量大于等于28Gy，从而使白纹伊蚊雌蛹不育。
优选，所述的白纹伊蚊雌蛹的蛹龄为4-40小时，白纹伊蚊雌蛹数目或白纹伊蚊雌蛹和白纹伊蚊雄蛹总数目在10～30万个时，其X射线照射剂量大于等于60Gy，从而使白纹伊蚊雌蛹不育。
一种使感染新型沃尔巴克菌白纹伊蚊雌蚊不育的方法，其包括人工建立感染沃尔巴克菌白纹伊蚊蚊株、大规模饲养蚊虫、使用分离器初步分离蚊幼虫、雌蛹和雄蛹、使用X射线照射收集到的雄蛹，使混在雄蛹中的雌蛹不育、将辐射后的蚊虫运输至释放点，按照释放策略进行释放并进行效果监测。
本发明采用X射线在白纹伊蚊蛹期进行辐射，从而使雌蚊无法产生后代，消除由意外释放感染新型沃尔巴克菌雌蚊所导致的种群替换威胁。相比传统人工去雌的方法，本发明是一种快速有效地使雌蚊不育的方法，大大提高生产效率，适合于大规模生产运用。
附图说明：
图1是在显微镜下观察的白纹伊蚊雌蛹和雄蛹；
图2是辐射或无辐射感染沃尔巴克菌白纹伊蚊雌蚊入侵野生种群的流程图；
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
一、快速鉴定白纹伊蚊雌、雄蛹包括以下步骤：
(1)在感染沃尔巴克菌白纹伊蚊幼虫发育至蛹期，使用巴氏吸管将蛹挑出放至到培养皿上，将蛹周围的水分吸掉，然后在体式解剖镜下观察蛹的尾部。如图1，尾器短的为雌蛹(图左)，长的则为雄蛹(图右)。
二、辐射后雌蚊的不育评价：
(1)在显微镜下分离出雌蛹后(蛹龄为4-24小时)，将雌蛹放置在辐射盘中间，然后使用X射线辐射仪(RS2400)进行照射(0，23，26，28，32，40Gy)，每次辐射约50头雌蛹。辐射完之后，将辐射过的雌蛹与没有进行辐射的雄蛹按照1:1的比例放置在干净的笼子中。
(2)待所有的蚊蛹全部羽化之后，给成蚊提供10％的葡萄糖溶液。4到5天之后，给予雌蚊提供血餐。
(3)将饱餐后的雌蚊单独挑出，转移到带有少量水跟湿润的产卵纸的透明塑料管中，一只雌蚊一个管，并塞上海绵，防止蚊虫在产卵期间逃逸。
(4)3天之后，将产完卵的雌蚊从产卵管中移出，收集单个雌蚊的产卵纸，干燥，6到7天之后进行孵化。24小时之后，在体式解剖镜下计算单雌的产卵总数和卵破壳数，记录产卵量和卵孵化率。结果如表1所示：
表1小规模照射不同辐射剂量对感染沃尔巴克菌白纹伊蚊雌蚊产卵量和卵孵化率影响(平均数±标准误差)
由表1可以看出，当剂量大于等于28Gy后，雌蚊产卵率为0，完全不育。
三、辐射后雌蚊的种群替代评价步骤：
(1)饲养野生株白纹伊蚊至成蚊，随机挑选出50只4-5日龄的雌、雄野生株成蚊(F0代)，转移至新的笼子中，喂以血餐后，往笼子中添加步骤二的20只辐射过X射线且不产卵的绝育的沃尔巴克菌感染饱血后的雌蚊或无辐射的沃尔巴克菌感染饱血后的雌蚊，2天之后往笼子中放置产卵杯。3天之后将产卵杯取出，卵干燥后，放置7天后，将卵全部孵化。
(2)将上述幼虫饲养至成蛹，随机挑选50只雌、雄蛹重新建立种群(F1代)。待蚊虫羽化4-5天之后，喂予血餐，每周一次，共计四周，每周分别收集F2代卵(第一至四周)。待F1代雌蚊产完卵之后，随机挑选10只成蚊，提取其基因组DNA，设计检测沃尔巴克菌(wPip)的噬菌体WO的locus(orf7)基因引物，序列为：orf7-cf:CCCACATGAGCCAATGACGTCTG；orf7-cr:TTGCTTGCAACACTTACACTT，进行PCR检测沃尔巴克菌是否入侵野生种群，连续监测两代，具体操作见图2。PCR反应体系为(20μL)，PCRMasterMix10μL，上下游引物各1μL(10μM)，DNA模板1μL和水7μL。PCR反应条件为：95℃(5mins)；95℃(30s)，52℃(30s)，72℃(45s)，35个循环；72℃(10mins)。PCR结束后，取6μL产物进行凝胶电泳(1.5％)。
结果如表2所示
表2辐射和无辐射感染沃尔巴克菌白纹伊蚊雌蚊入侵野生种群的评价：
wPip在F1和F2代蚊虫中的感染率(平均数±标准误差)
从表2可以看出，F1和F2代有检测到阳性感染wPip的雌蚊，可以得出没有经过辐射的白纹伊蚊雌蚊可以将沃尔巴克菌(wPip)传播到野生种群中。而经过辐射后，在后代的检测中没有发现阳性，说明辐射后雌蚊无法产卵，从而无法将阳性wPip菌传给野生种群中，消除了种群替换的可能性。
实施例2：
一、辐射后雌蚊的不育评价：
(1)大规模饲养感染沃尔巴克菌白纹伊蚊幼虫至蛹期(4-40小时)，然后使用Fay-Morlan分离器初步分离雌、雄蛹。取雄蛹约6-7万只，混入0.5万只雌蛹，然后将蛹集中在辐射杯中，使用X射线辐射仪(Wolbaki射线仪)进行照射(0，40，50和60Gy)。辐射完之后，重新使用分离器将雌雄蛹分离出来，将辐射过的雌蛹与没有进行辐射的雄蛹按照约1000:400的比例放置在干净的笼子中。
结果如表3所示
表3大规模照射不同辐射剂量对感染沃尔巴克菌白纹伊蚊雌蚊产卵量和卵孵化率影响(平均数±标准误差)
从表3可以看出，在大规模运用中，当辐射剂量为60Gy时候，可以完全使混在雄蛹中的雌蛹完全不育。