主管：中华人民共和国教育部主办：四川大学主编：刘伦旭刊期：月刊ISSN：1007-4848CN：51-1492/R
引用本文：李杰,李政,李斌,余琦瑶,毛文杰,孟于琪,朱多杰,冯海明,尹泚,肖翠.敲减DUS4L对人A549肺腺癌细胞基因表达调控的影响及差异基因分析.中国胸心血管外科临床杂志,2022,29(6):761-769.doi:10.7507/1007-4848.202102059复制
主要试剂包括人肺腺癌A549细胞（中国科学院细胞库）、胎牛血清（Ausbian）、1640培养基（Invitrogen）、shRNA序列（上海吉凯基因化学技术有限公司合成）、T4DNA连接酶（ThermoScientific）、GV115慢病毒载体（GnenChem）、RIPA裂解液（上海鼎国生物技术有限公司）、M-MLV试剂盒（Promega）、BCA蛋白分析试剂盒（碧云天生物技术有限公司）、EDU试剂盒（锐博）、DUS4L抗体（Abcam）、GAPDH抗体（Santa-Cruz）和ECLWesternblottingSubstrate试剂盒（ThermoScientific）等，主要仪器（耗材）包括SDS-PAGE蛋白电泳仪（上海天能）、PVDF膜（Millipore）、荧光显微镜（Olympus）和RT-PCR仪（Roche）等。
KD组shRNA序列为5’-ACATCAGCAATCATAGATT-3’，NC组shRNA序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’，通过T4DNA连接酶将双酶切线性化的载体和退火双链DNA连接，慢病毒载体转染293T细胞，48h后收集上清液，离心浓缩去除杂质，进行慢病毒质量检测。
分别用DUS4LshRNA与阴性对照shRNA慢病毒载体感染肺腺癌A549细胞，感染12h后更换常规培养液继续培养。感染72h后，于荧光显微镜下观察荧光蛋白GFP表达情况，荧光率达70%，细胞汇合度达80%，收集细胞进行下游实验。
将KD组和NC组细胞接种于6孔板，各设置3个生物学重复，待细胞汇合度达80%，用Trizol试剂盒提取总RNA。按照说明书，利用M-MLV逆转录试剂盒得到c-DNA，再进行PCR扩增。PCR引物序列如下：DUS4L上游引物序列5’-GCCCATTGATTGTTCAGTTTGC-3’，下游引物序列5’-AACTCCTGTTGCTTCAGCCTTT-3’；GAPDH上游引物序列5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物序列5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’。目的基因相对定量分析采用2△△Ct法。
收集目的细胞，用RIPA裂解，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，将蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移到PVDF膜上，TBST溶液室温封闭1h或4℃过夜，然后分别与一抗和二抗孵育，最后按照ECLWesternblottingSubstrate说明书显影。
取对数生长期细胞，以每孔2000接种于96孔板，培养至正常生长阶段。每孔加入100μL50μmol/LEDU溶液孵育2h后进行细胞固定、Apollo染色、清洗、Hoechst复染，染色完成后于荧光显微镜下采集图像（×100）。利用ImageProPlus5.0软件分析结果，计算EDU阳性率（EDU阳性率=EDU阳性细胞数/总细胞数×100%）。
用Trizol试剂盒提取总RNA，后续建库及测序由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。测序完成后使用FastQC对原始测序数据进行质量控制，包括原始数据过滤、测序错误率检查、GC含量分布检查。用hisat2软件分别将KD组和NC组RNA-seq数据对比到人类参考基因组上，对比完成后，再采用subread软件中的featureCounts（1.5.0-p3版本）工具进行基因水平定量和标准化处理。
a：非配对肿瘤组织与癌旁正常组织DUS4L表达差异图；b：配对肿瘤组织与癌旁正常组织DUS4L差异表达图
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a：DUS4L敲减结果的qPCR验证；b：DUS4L敲减结果的Westernblotting验证
a：EDU染色图片；b：EDU染色阳性率统计结果
综上所述，DUS4LmRNA在肺腺癌肿瘤组织中的表达显著升高，敲减DUS4L基因后能够抑制肺腺癌A549细胞的增殖能力；DUS4L能广泛调控肺腺癌A549细胞基因表达，差异基因主要富集在IL-8的产生、血管生成、血管内皮细胞增殖等信号通路，提示DUS4L可能参与IL-8生成的调控，并对肺腺癌血管发育产生影响，从而在肿瘤发展、侵袭、远处转移中起着潜在作用。但DUS4L是如何调控IL-8的产生及血管发育还不明确，要了解其具体机制，还需要做进一步研究。总之，本研究为进一步探索DUS4L在肺腺癌中的作用机制、寻找肿瘤标志物及治疗靶点提供了线索。
利益冲突：无。
表1DUS4L基因表达与疾病分期的关系（例）
表2数据质量控制后各样本cleanreads
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引用本文：李杰,李政,李斌,余琦瑶,毛文杰,孟于琪,朱多杰,冯海明,尹泚,肖翠.敲减DUS4L对人A549肺腺癌细胞基因表达调控的影响及差异基因分析.中国胸心血管外科临床杂志,2022,29(6):761-769.doi:10.7507/1007-4848.202102059