本发明涉及制备射血分数保留的心衰（hfpef）的动物模型的方法及所述动物模型的应用。
背景技术：
1、心血管疾病代表着医学挑战的难题之一，心衰更是心血管疾病患者死亡的主要原因，也是临床面临的一大难题，包括收缩功能障碍的心衰和舒张功能障碍的心衰，其中舒张功能障碍的心衰随着医学的发展，也被更广泛的定义为射血分数保留的心衰(hfpef)。
3、特别地，目前已报道的hfpef模型均缺乏房颤表型，然而带有房颤的hfpef是死亡率最高的一种类型，并且占临床hfpef的将近一半。因此，提供带有房颤表型的hfpef模型对于hfpef的基础研究以及药物研发是十分必要的。
技术实现思路
1、本技术的发明人首次发现jun是hfpef发生发展的重要调控因子，由此提供了带有房颤表型的hfpef动物模型，其不仅在心脏生理病理特征符合临床hfpef特征，且转录组特征也符合临床hfpef特征，为hfpef的基础研究以及药物研发提供了有力工具。由此提供了以下发明。
2、动物模型
3、在第一方面，本发明提供了经遗传修饰的非人动物，所述非人动物包含遗传修饰以过表达jun基因。
4、在某些实施方案中，所述经遗传修饰的非人动物为射血分数保留的心衰（hfpef）的非人动物模型。
5、在本文中，“过表达”是指基因表达或基因产物的水平相对于对照(例如不包括该遗传修饰的非人动物)的水平增加。术语“增加”是指与对照相比可检测的增加。过表达可以发生在转录水平和/或翻译水平。过表达可以通过改变表达调控元件（如使用强启动子）实现、增加拷贝数或者引入外源编码序列实现。
6、在某些实施方案中，所述非人动物为哺乳动物。
7、在某些实施方案中，所述非人动物为啮齿动物，例如小鼠或大鼠。
8、在某些实施方案中，所述非人动物为小鼠。在某些实施方案中，所述非人动物为c57bl/6品系。
10、在某些实施方案中，所述外源表达盒整合至所述非人动物的基因组。
11、在某些实施方案中，所述外源表达盒不整合至所述非人动物的基因组，例如是游离的，例如存在于游离型载体。
13、在某些实施方案中，所述外源表达盒进一步包含与所述jun编码序列可操作连接的表达调控元件（例如启动子，如组成型启动子、特异型启动子或诱导型启动子）。
14、在某些实施方案中，所述非人动物的心脏组织过表达jun基因，即心脏特异性过表达jun基因。在某些实施方案中，所述心脏组织至少包括心肌细胞。
15、在某些实施方案中，所述非人动物或其细胞包含第一遗传修饰和第二遗传修饰，其中：
16、所述第一遗传修饰包含整合至安全港基因座的第一表达盒，所述第一表达盒包含loxp-stop-loxp(lsl)序列以及jun编码序列；
17、所述第二遗传修饰包含整合至内源心脏特异性基因的第二表达盒，所述第二表达盒包含cre重组酶编码序列；
18、其中当cre重组酶被表达时，其识别两个loxp并剪切其间的终止子(stop)，使得心脏特异性基因阳性细胞（例如心脏组织细胞，如心肌细胞）持续表达jun，从而以诱导心脏特异性过表达jun基因。
19、在某些实施方案中，所述非人动物对于所述第一遗传修饰是纯合的。在某些实施方案中，所述非人动物对于所述第一遗传修饰是杂合的。
20、在某些实施方案中，所述非人动物对于所述第二遗传修饰是纯合的。在某些实施方案中，所述非人动物对于所述第二遗传修饰是杂合的。
21、在某些实施方案中，所述非人动物对于所述第一遗传修饰和所述第二遗传修饰均是纯合的。
22、在某些实施方案中，所述安全港基因座为rosa26基因座、h11基因座、tigre基因座、或col1a1基因座。在某些实施方案中，所述安全港基因座为rosa26基因座。在某些实施方案中，所述第一遗传修饰整合至内源rosa26基因座的第一内含子处。
23、在某些实施方案中，在所述第一表达盒中，所述jun编码序列位于loxp-stop-loxp(lsl)序列的下游。
24、在某些实施方案中，所述第一表达盒还包括可操作连接的启动子（例如cag启动子）。
25、在某些实施方案中，所述第一表达盒还包括与所述jun编码序列连接的报告基因。在某些实施方案中，所述jun编码序列与所述报告基因之间通过ires连接。
26、在某些实施方案中，所述第一表达盒进一步（例如在其3’端，例如在poly(a)尾之前）包含转录后调控元件（例如wpre），以增加外源片段的表达效率。
27、在某些示例性实施方案中，所述lsl序列包含如seqidno:4所示的序列。在某些示例性实施方案中，所述jun编码序列包含如seqidno:5所示的序列。
28、在某些示例性实施方案中，所述第一表达盒具备如下所示的结构：cag-lsl-jun-ires-egfp-wpre-pa。在某些示例性实施方案中，所述第一表达盒包含seqidno:3所示的序列。
29、在某些实施方案中，所述第一表达盒侧接5’和3’同源臂。
30、在某些示例性实施方案中，所述5’同源臂具有如seqidno:2所示的序列。在某些示例性实施方案中，所述3’同源臂具有如seqidno:6所示的序列。
31、在某些实施方案中，所述心脏特异性基因为心肌细胞特异性基因。在某些实施方案中，所述心脏特异性基因为myh6基因。在某些实施方案中，所述第二遗传修饰整合至内源myh6基因的起始密码子处。
32、在某些实施方案中，所述cre重组酶为诱导型cre重组酶。在某些实施方案中，所述诱导型cre重组酶为启动子激活型或配体诱导型。在某些实施方案中，所述cre重组酶为雌激素诱导型cre重组酶，例如cre-ert2。
33、在某些实施方案中，所述第二表达盒进一步包含与所述cre重组酶编码序列可操作连接的表达调控元件（例如启动子，如组成型启动子、特异型启动子或诱导型启动子）。
34、在某些实施方案中，所述第二表达盒侧接5’和3’同源臂。
35、动物模型的制备
36、在第二方面，本发明提供了一种制备射血分数保留的心衰（hfpef）非人动物模型的方法，所述方法包括在所述非人动物中过表达jun基因。
38、在某些实施方案中，所述方法包括向所述非人动物的细胞中引入包含jun编码序列的外源表达盒。在某些实施方案中，所述方法进一步包括从所述细胞产生所述非人动物。
39、在某些实施方案中，所述非人动物为哺乳动物。在某些实施方案中，所述非人动物为啮齿动物，例如小鼠或大鼠。在某些实施方案中，所述非人动物为小鼠。
40、在某些实施方案中，所述外源表达盒整合至所述非人动物的基因组。
41、在某些实施方案中，所述外源表达盒不整合至所述非人动物的基因组，例如是游离的，例如存在于游离型载体。
43、在某些实施方案中，所述外源表达盒进一步包含与所述jun编码序列可操作连接的表达调控元件（例如启动子，如组成型启动子、特异型启动子或诱导型启动子）。
44、核酸引入
47、可以通过病毒介导的递送(例如aav介导的递送或慢病毒介导的递送)来实现核酸的引入。其它示例性病毒/病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、痘病毒（如痘苗病毒），和单纯疱疹病毒。病毒可以感染分裂细胞、非分裂细胞，或分裂和非分裂细胞两者。病毒可以整合到宿主基因组中，也可以不整合到宿主基因组中。还可以对此类病毒进行工程化，使其免疫力降低。病毒可以是可复制型的，也可以是复制缺陷型的(例如，在另一轮病毒体复制和/或包装中必需的一个或多个基因中有缺陷)。病毒可引起瞬时表达、长期表达(例如至少1周、2周、1个月、2个月，或3个月)，或永久表达。
48、组织特异性表达
49、在某些实施方案中，在所述非人动物的心脏组织中过表达jun基因，即心脏特异性过表达jun基因。在某些实施方案中，所述心脏组织至少包括心肌细胞。
50、实现组织特异性表达的方法是本领域技术人员熟知的，例如使用与jun编码序列可操作地连接的组织特异性表达控制序列，如组织特异性启动子、阻遏物、增强子或其组合；或者，使用cre-loxp重组系统。
51、在某些实施方案中，所述心脏特异性过表达通过cre-loxp重组系统（例如诱导型cre-loxp重组系统）实现。
52、在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
53、（1）提供第一经遗传修饰的非人动物和第二经遗传修饰的非人动物，其中：
54、所述第一经遗传修饰的非人动物包含第一遗传修饰，所述第一遗传修饰包含整合至安全港基因座的第一表达盒，所述第一表达盒包含loxp-stop-loxp(lsl)序列以及jun编码序列；
55、所述第二经遗传修饰的非人动物包含第二遗传修饰，所述第二遗传修饰包含整合至内源心脏特异性基因的第二表达盒，所述第二表达盒包含cre重组酶编码序列；
56、（2）将所述第一非人动物和第二非人动物杂交以获得子代，选择同时包含所述第一遗传修饰和第二遗传修饰的子代，其中当cre重组酶被表达时，其识别两个loxp并剪切其间的终止子(stop)，使得心脏细胞（例如心肌细胞）持续表达jun，从而以诱导心脏特异性过表达jun基因。
57、第一非人动物
58、在某些实施方案中，所述第一非人动物对于所述第一遗传修饰是纯合的。在某些实施方案中，所述第一非人动物对于所述第一遗传修饰是杂合的。
59、在某些实施方案中，所述安全港基因座为rosa26基因座、h11基因座、tigre基因座、或col1a1基因座。在某些实施方案中，所述安全港基因座为rosa26基因座。在某些实施方案中，所述第一遗传修饰整合至内源rosa26基因座的第一内含子处。
60、在某些实施方案中，在所述第一表达盒中，所述jun编码序列位于loxp-stop-loxp(lsl)序列的下游。
61、在某些实施方案中，所述第一表达盒还包括可操作连接的启动子（例如cag启动子）。
62、在某些实施方案中，所述第一表达盒还包括与所述jun编码序列连接的报告基因。在某些实施方案中，所述jun编码序列与所述报告基因之间通过ires连接。
63、在某些实施方案中，所述第一表达盒进一步（例如在其3’端，例如在poly(a)尾之前）包含转录后调控元件（例如wpre），以增加外源片段的表达效率。
64、在某些示例性实施方案中，所述lsl序列包含如seqidno:4所示的序列。在某些示例性实施方案中，所述jun编码序列包含如seqidno:5所示的序列。
65、在某些示例性实施方案中，所述第一表达盒具备如下所示的结构：cag-lsl-jun-ires-egfp-wpre-pa。在某些示例性实施方案中，所述第一表达盒包含seqidno:3所示的序列。
66、在某些实施方案中，所述第一表达盒侧接5’和3’同源臂。在某些示例性实施方案中，所述5’同源臂具有如seqidno:2所示的序列。在某些示例性实施方案中，所述3’同源臂具有如seqidno:6所示的序列。
67、在某些实施方案中，所述第一遗传修饰通过基因编辑系统实现。所述基因编辑系统可以是现在已知的任何位点特异性(序列特异性)基因组编辑系统。在某些实施方案中，所述基因组编辑系统包括至少一种位点特异性核酸酶，例如rna引导的核酸酶（例如cas核酸酶）、锌指核酸酶、兆碱基大范围核酸酶、tale-核酸酶、重组酶、转座酶、以及它们的任何组合。在某些实施方案中，所述位点特异性核酸内切酶靶向安全港基因座，在靶点处诱导dna断裂，通过例如同源重组（hr）完成整合。
68、在某些实施方案中，所述基因编辑系统选自crispr/cas、talen、zfn。
69、在某些实施方案中，所述基因编辑系统包含rna引导的核酸内切酶以及指导rna（grna），grna包含与靶标基因座中的靶序列具有互补性的指导序列。在某些实施方案中，所述基因编辑系统存在于一种或多种载体上。
70、在某些实施方案中，所述基因编辑系统为crispr/cas系统，其包含cas效应蛋白（包括不限于cas9、cas12a(cpf1)、cas12b(c2c1)、cas13a(c2c2)、c2c3、cas13b）以及相应的指导rna(grna)。crispr/cas系统通过指导rna(grna)将cas酶蛋白募集到靶标基因座以完成修饰，grna包含与靶标基因座中的靶序列具有互补性的指导序列。在某些实施方案中，所述grna可以是嵌合指导rna或单一指导rna(sgrna)。在某些实施方案中，grna包含指导序列和tracr配对序列(或直接重复序列)。在某些实施方案中，grna包含指导序列、tracr配对序列(或直接重复序列)和tracr序列。在某些实施方案中，所述crispr-cas系统不包含和/或不依赖于tracr序列的存在（例如，如果cas蛋白是cas12a）。
71、在某些实施方案中，所述第一经遗传修饰可使用本领域中公知的任意一种向非人动物中引入转基因的方法实现。这样的技术包括但不限于：前核显微注射、病毒感染以及胚胎干细胞和ips细胞的转化。
72、在某些实施方案中，所述第一经遗传修饰的非人动物通过以下方法获得：
73、(a)将所述第一表达盒引入（如显微注射）非人动物的受精卵中；
74、(b)将受精卵移植到假孕动物中；
75、(c)使受精卵发育至足月；以及
76、(d)鉴定含有所述第一遗传修饰的后代。
77、在某些实施方案中，步骤(a)包括：将表达crispr/cas9系统以及第一表达盒的一种或多种载体引入受精卵中。在某些实施方案中，步骤(a)包括：将表达cas9mrna及grna的载体以及包含第一表达盒的载体引入受精卵中。在某些示例性实施方案中，所述grna包含如seqidno:1所示的序列。
78、在某些实施方案中，步骤(d)包括使用靶向5’同源臂和/或3’同源臂的引物进行pcr鉴定和/或测序。
79、第二非人动物
80、在某些实施方案中，所述第二非人动物对于所述第二遗传修饰是纯合的。在某些实施方案中，所述第二非人动物对于所述第二遗传修饰是杂合的。
81、在某些实施方案中，所述心脏特异性基因为心肌细胞特异性基因。在某些实施方案中，所述心脏特异性基因为myh6基因。在某些实施方案中，所述第二遗传修饰整合至内源myh6基因的起始密码子处。
82、在某些实施方案中，所述cre重组酶为诱导型cre重组酶，所述方法还包括：给予所述子代啮齿动物诱导剂以诱导心脏特异性过表达jun基因。
83、“诱导型cre重组酶”是指需要通过诱导剂来激活cre重组酶的活性或表达的cre重组酶。诱导型cre重组酶是本领域技术人员公知的，包括但不限于启动子激活型或配体诱导型。
84、“启动子激活型”通过诱导剂来调节驱动cre重组酶的启动子活性，例如四环素诱导型、干扰素诱导型等。
86、在某些实施方案中，所述cre重组酶为雌激素诱导型cre重组酶，例如cre-ert2。
87、在某些实施方案中，所述cre重组酶为cre-ert2，所述方法还包括：给予所述子代人工合成雌激素（如tamoxifen、4-oht）以诱导心脏特异性过表达jun基因。
88、在示例性某些实施方案中，所述第二经遗传修饰的非人动物为myh6-creert2小鼠（南方模式生物，nm-ki-200125），其中将creert2-pa插入到小鼠myf6基因起始密码子处。
89、在某些实施方案中，所述第二表达盒侧接5’和3’同源臂。
90、在某些实施方案中，所述第二遗传修饰通过基因编辑系统实现。所述基因编辑系统可以是现在已知的任何位点特异性(序列特异性)基因组编辑系统。在某些实施方案中，所述基因组编辑系统包括至少一种位点特异性核酸酶，例如rna引导的核酸酶（例如cas核酸酶）、锌指核酸酶、兆碱基大范围核酸酶、tale-核酸酶、重组酶、转座酶、以及它们的任何组合。在某些实施方案中，所述位点特异性核酸内切酶靶向内源心脏特异性基因，在靶点处诱导dna断裂，通过例如同源重组（hr）完成整合。
91、在某些实施方案中，所述基因编辑系统选自crispr/cas、talen、zfn。
92、在某些实施方案中，所述基因编辑系统包含rna引导的核酸内切酶以及指导rna（grna），grna包含与靶标基因座中的靶序列具有互补性的指导序列。在某些实施方案中，所述基因编辑系统存在于一种或多种载体上。
93、在某些实施方案中，所述基因编辑系统为crispr/cas系统，其包含cas效应蛋白（包括不限于cas9、cas12a(cpf1)、cas12b(c2c1)、cas13a(c2c2)、c2c3、cas13b）以及相应的指导rna(grna)。
94、在某些实施方案中，所述第二经遗传修饰可使用本领域中公知的任意一种向非人动物中引入转基因的方法实现。这样的技术包括但不限于：前核显微注射、病毒感染以及胚胎干细胞和ips细胞的转化。
95、在某些实施方案中，所述第二经遗传修饰的非人动物通过以下方法获得：
96、(a)将所述第二表达盒引入（如显微注射）非人动物的受精卵中；
97、(b)将受精卵移植到假孕动物中；
98、(c)使受精卵发育至足月；以及
99、(d)鉴定含有所述第二遗传修饰的后代。
100、在某些实施方案中，步骤(a)包括：将表达crispr/cas9系统以及第二表达盒的一种或多种载体引入受精卵中。在某些实施方案中，步骤(a)包括：将表达cas9mrna及grna的载体以及包含第二表达盒的载体引入受精卵中。
101、在某些实施方案中，步骤(d)包括使用靶向5’同源臂和/或3’同源臂的引物进行pcr鉴定和/或测序。
102、在另一方面，本发明还提供了由第二方面所述的方法产生的非人动物模型。
103、载体及试剂盒
104、在第三方面，本发明提供了一种载体（例如表达载体），其包括包含loxp-stop-loxp(lsl)序列以及jun编码序列的表达盒。
105、在某些实施方案中，所述jun编码序列位于lsl序列的下游。
106、在某些实施方案中，所述表达盒还包括可操作连接的启动子（例如cag启动子）。
107、在某些实施方案中，所述表达盒还包括与所述jun编码序列连接的报告基因。在某些实施方案中，所述jun编码序列与所述报告基因之间通过ires连接。
108、在某些实施方案中，所述表达盒进一步（例如在其3’端，例如在poly(a)尾之前）包含转录后调控元件（例如wpre），以增加外源片段的表达效率。
109、在某些示例性实施方案中，所述lsl序列包含如seqidno:4所示的序列。在某些示例性实施方案中，所述jun编码序列包含如seqidno:5所示的序列。
110、在某些示例性实施方案中，所述表达盒具备如下所示的结构：cag-lsl-jun-ires-egfp-wpre-pa。在某些示例性实施方案中，所述第一表达盒包含seqidno:3所示的序列。
111、在某些实施方案中，所述表达盒侧接5’和3’同源臂，以允许能将所述表达盒整合至基因组中。在某些示例性实施方案中，所述5’同源臂具有如seqidno:2所示的序列。在某些示例性实施方案中，所述3’同源臂具有如seqidno:6所示的序列。
112、在第四方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含如上所述的载体。
113、在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含第二载体，所述第二载体包括包含cre重组酶编码序列的表达盒。
114、在某些实施方案中，所述表达盒侧接5’和3’同源臂，以允许能将所述表达盒整合至基因组中。
115、在某些实施方案中，所述cre重组酶为第二方面中定义的诱导型cre重组酶。
116、在另一方面，本发明还涉及如上所述的载体或试剂盒用于制备射血分数保留的心衰（hfpef）非人动物模型的用途。
117、动物模型的应用
118、在另一方面，本发明提供了本文所述的经遗传修饰的非人动物用作射血分数保留的心衰（hfpef）非人动物模型的用途。
119、在另一方面，本发明提供了本文所述的经遗传修饰的非人动物、或由本文所述的方法产生的hfpef的非人动物模型用于筛选预防和/或治疗射血分数保留的心衰（hfpef）的药物的用途，或者作为用于筛选预防和/或治疗射血分数保留的心衰（hfpef）的药物的动物模型的用途。
120、在另一方面，本发明提供了本文所述的经遗传修饰的非人动物、或由本文所述的方法产生的hfpef的非人动物模型用于研究射血分数保留的心衰（hfpef）的用途，或者作为用于研究射血分数保留的心衰（hfpef）的动物模型的用途。
121、在另一方面，本发明提供了筛选预防和/或治疗射血分数保留的心衰（hfpef）的药物的方法，所述方法包括：向本文所述的经遗传修饰的非人动物、或由本文所述的方法产生的hfpef的非人动物模型施用候选药物；评价所述候选药物是否能够（i）改善舒张功能，例如降低舒张功能参数e/e’和/或e/a；和/或（ii）抑制jun基因表达。
122、在某些实施方案中，所述抑制jun基因表达包括在rna或蛋白质水平上抑制jun的表达，例如敲除jun基因，降低或抑制基因的转录，和/或，降低或抑制该基因的mrna产物的翻译。在某些实施方案中，表达水平的测定可以在核酸水平或蛋白水平实施。在核酸水平测定表达的方法包括但不限于northern印迹、pcr、rt-pcr或实时(real)rt-pcr。在蛋白水平测定表达的方法包括但不限于western印迹或聚丙烯酰胺凝胶电泳联合蛋白染色技术如考马斯亮蓝或银染、质谱、elisa等。
123、术语定义
125、如本文中所使用的，术语“射血分数保留的心衰（hfpef）”是指在心室收缩功能正常或轻度减低的情况下，心室舒张功能受损和顺应性减低使心室充盈减少和充盈压升高，从而导致肺循环和体循环淤血的一类临床综合征。hfpef典型地是指舒张功能障碍的心衰。在某些实施方案中，hfpef的临床诊断标准主要包括：（1）存在心衰的症状和（或）体征；（2）心脏影像学检查（主要指tte检查）提示lvef≥50%；（3）存在与左心室舒张功能不全和（或）左心室充盈压升高一致的心脏结构和（或）功能异常的客观证据，其中左心室舒张功能不全和(或)心室充盈压升高的结构和(或)功能异常指标主要包括：（a）平均e/e'比值>15；（b）左心房容积指数＞40ml/m2(心房颤动)。
126、如本文中所使用的，术语“jun”是指jun原癌基因,ap-1转录因子亚基（junproto-oncogene,ap-1transcriptionfactorsubunit），也称为ap1、ap-1、cjun或c-jun。jun可以是是人源的，也可以是来自其它物种（例如，非人哺乳动物、鱼、爬行动物或鸟，例如啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、狗、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊、灵长类等）的同源基因。jun的序列是本领域技术人员熟知的，可参见各种公共数据库，例如人jun的示例性基因序列可参见genbank:nm_002228.4，示例性蛋白序列可参见ncbi:np_002219.1；小鼠jun的示例性基因序列可参见ensembl：ensmusg00000052684，ncbigeneid:16476，示例性蛋白序列可参见uniprotkb:p05627，ncbi:np_034721.1。
127、如本文中所使用的，术语“安全港基因座”是指转基因或其它外源核酸插入物可以在所有目的组织中稳定、可靠地表达，而不会明显改变细胞行为或表型(即，对宿主细胞没有任何有害作用)的染色体基因座。参见，例如，sadelainetal.(2012)nat.rev.cancer12:51-58，出于所有目的通过引用整体并入本文。例如，安全港基因座可以是其中插入的基因序列的表达不受邻近基因的任何通读表达干扰的基因。例如，安全港基因座可以包括染色体基因座，其中外源dna可以以可预测的方式整合和发挥功能，而不会不利地影响内源基因的结构或表达。安全港基因座可包括基因外区域或基因内区域，例如，非必需、可省去，或可被破坏而无明显表型后果的基因内的基因座。例如，rosa26基因座及其在人类中的等同物在所有组织中提供开放的染色质构型，并在胚胎发育期间和成体中普遍表达。参见，例如，zambrowiczetal.(1997)proc.natl.acad.sci.usa94:3789-3794，出于所有目的通过引用整体并入本文。此外，可以高效地靶向rosa26基因座，并且rosa26基因的破坏不会产生明显的表型。安全港基因座的其它示例包括h11、tigre、col1a1。
129、“组成型启动子”是在所有发育阶段的所有组织或特定组织中都有活性的启动子。组成型启动子的实例包括人即早期(immediateearly)巨细胞病毒(hcmv)启动子、小鼠即早期巨细胞病毒(mcmv)启动子、人延伸因子1α(hef1α)启动子、小鼠延伸因子1α(mef1α)启动子、小鼠磷酸甘油酸酯激酶(pgk)启动子、鸡β肌动蛋白杂种(cag或cbh)启动子、sv40早期启动子，和β2微管蛋白启动子。
130、“诱导型启动子”的实例包括，例如，化学调节的启动子和物理调节的启动子。化学调节的启动子包括，例如，醇调节的启动子(例如，醇脱氢酶(alca)基因启动子)、四环素调节的启动子(例如四环素响应性启动子、四环素操纵子序列(teto)、tet-on启动子，或tet-off启动子)、类固醇调节的启动子(例如大鼠糖皮质激素受体、雌激素受体的启动子，或蜕皮素受体的启动子)，或金属调节的启动子(例如金属蛋白启动子)。物理调节的启动子包括，例如，温度调节的启动子(例如热激启动子)和光调节的启动子(例如光诱导型启动子或光抑制型启动子(light-repressiblepromoter))。
131、“组织特异性启动子”可以是，例如，神经元特异性启动子、胶质细胞特异性启动子、肌肉细胞特异性启动子、心脏细胞特异性启动子、肾细胞特异性启动子、骨细胞特异性启动子、内皮细胞特异性启动子，或免疫细胞特异性启动子(例如，b细胞启动子或t细胞启动子)。在某些实施方案中，所述组织特异性启动子优选为心脏细胞特异性启动子。
132、如本文中所使用的，术语“可操作地连接”是指两个或更多个成分(例如启动子和另一个序列元件)的并置，使得两个成分均正常起作用，并允许至少一个成分可以介导施加在至少一个其它成分上的功能。例如，如果启动子响应一种或多种转录调节因子的存在或不存在而控制编码序列的转录水平，则该启动子可以可操作地连接至该编码序列。可操作的连接可以包括这样的序列，所述序列彼此连续或反式作用(例如，调节序列可以在一定距离处起作用以控制编码序列的转录)。
133、如本文中所使用的，术语“表达盒”是指重组核酸，其包含所需编码序列，该所需编码序列可操作地连接至在特定宿主细胞或生物中表达所必需的核酸序列。在原核生物中的表达所需的核酸序列通常包括启动子、操纵子(可选)和核糖体结合位点，以及其它序列。真核细胞通常利用启动子、增强子，以及终止和多腺苷酸化信号，尽管可以在不牺牲必要表达的情况下删除一些元素并添加其它元素。
134、如本文中所使用的，术语“内源”是指天然存在于细胞或非人动物体内的核酸序列。例如，非人动物的内源rosa26序列是指天然存在于非人动物的rosa26基因座处的天然rosa26序列。
135、如本文中所使用的，术语“外源”分子或序列包括通常不以该形式存在于细胞中的分子或序列。通常的存在包括在细胞的特定发育阶段和环境条件的存在。例如，外源分子或序列可以包括细胞内相应内源序列的突变形式(例如内源序列的人源化版本)，或者可以包括与细胞内的内源序列相对应但形式不同(即不在染色体内)的序列。与此相对，内源分子或序列包括在特定环条件下，在特定发育阶段的特定细胞中通常以该形式存在的分子或序列。
137、有益效果
138、本技术的发明人首次提供了带有房颤表型的hfpef动物模型，其不仅在心脏生理病理特征符合临床hfpef特征，且转录组特征也符合临床hfpef特征。特别地，带有房颤的hfpef是死亡率最高的一种类型，并且占临床hfpef的将近一半。因此，本发明的带有房颤表型的hfpef模型对于hfpef的基础研究以及药物研发具备重要意义及应用价值。
139、下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。