虽然对粪便样本中的寄生虫生命阶段（例如卵、包囊、卵囊）进行形态学评估通常可以帮助识别分类水平（例如种、属、科），但经典的寄生虫学工具在明确识别某些寄生虫方面存在局限性物种。
分子技术可以提供急需的诊断解决方案，这对于有效的寄生虫病管理至关重要。许多血清学和分子检测，例如聚合酶链反应(PCR)，目前正用于特定的寄生虫检测。这些测试在研究/学术环境中更常见，但也可通过商业诊断实验室获得。
寄生虫检测的基本PCR方法
当形态学检测具有挑战性时，PCR越来越多地用于确认寄生虫种类（方框1）。有两种基本方法：物种特异性检测和一般检测。
Box1聚合酶链式反应概述
01,是什么？
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于选择性扩增（复制）两侧为已知序列的双链DNA的特定部分的过程。
02,它是如何工作的？
基本PCR包括3个步骤：
1。模板DNA两条链的变性
2.将引物退火到模板DNA的每条链上
3。引物延伸以合成新的DNA链
物种特异性PCR检测
何时使用PCR
在诊断寄生虫学实验室中，PCR战略性地用于补充传统技术，主要是为了解决后者的诊断局限性。适当使用分子技术进行最终寄生虫检测取决于区分形态相似物种的需要。
例如在猫粪样本的硫酸锌粪便浮选试验中观察到的9-13×7-9um囊肿（图1），从形态学上可以鉴定为贾第鞭毛虫属。由于难以区分的贾第鞭毛虫包囊，无法进一步鉴定A到G的物种或组合。猫可能感染十二指肠贾第鞭毛虫组合F和/或组合A，这是一种人畜共患疾病。1基于为β-贾第鞭毛虫基因座可变区侧翼的2个保守区域设计的引物的PCR检测（即通用检测）通常用于区分贾第鞭毛虫组合。
图。1
图。2
相比之下，犬复孔虫（跳蚤绦虫；图2）的卵囊形态不同，只有一种复孔虫感染狗。因此，通过对狗的粪便样本进行显微镜检查来鉴定这种卵囊应该可以确认是否感染了犬吸虫，而无需进一步的分子分析/确认。
何时使用物种特异性PCR检测
图3
使用特异性PCR的其他示例包括识别狗血样本中的恶丝虫（心丝虫）和猫粪便中的弓形虫。针对DimmitisCO1基因区域的物种特异性PCR检测无需专业知识即可从视觉上区分心丝虫微丝蚴与其他寄生虫。类似地，猫粪便中脱落的人畜共患原生动物弓形虫卵囊（图4）与鲜为人知的猫原生动物寄生虫弓形虫卵囊相似。基于独特的529碱基对重复元素的特定PCR测定用于明确检测弓形虫。
图4
物种特异性PCR的缺点是它无法检测到感兴趣的寄生虫感染。尽管有此限制，诊断实验室更喜欢物种特异性PCR以满足特定要求。
何时使用通用PCR测试
如果目标是更全面的寄生虫检测而不是快速周转，则通用测试可以派上用场。在上述多房绦虫的情况下，如果所有者对检测多房绦虫科物种的诊断优势有信心，则可以进行基于CO1基因的绦虫通用检测。该测定是从CO1的进化保守区域设计的，该区域位于一个可变区域的两侧，该可变区域提供区分棘球蚴属（包括细粒棘球蚴和加拿大桉树）和绦虫的所有成员所需的分辨率。同样，通用PCR（基于18S基因）用于鉴定犬血样中的犬巴贝斯虫和巴贝斯虫。血涂片无法区分这两种大型巴贝斯虫，通用PCR检测更具决定性。
寄生虫学研究
尽管缺乏许多具有兽医重要性的寄生虫的完整DNA序列信息，但通用PCR方法已经为常见寄生虫生成了急需的DNA标记信息，这些信息可通过从序列数据库中公开访问获得。这反过来又促进了通用PCR作为诊断寄生虫学研究的主要工具的使用。
通常，寄生虫学家使用经典技术将寄生虫鉴定缩小到尽可能低的分类水平，并在需要时使用通用PCR进行物种特异性鉴定。例如，5到6微米的卵囊（图5）属于隐孢子虫属。然而，该属有超过26个有效物种，大多数卵囊在形态上无法区分。浮选试验和可用的隐孢子虫酶联免疫吸附测定(ELISA)均无助于物种鉴定。狗可能会感染犬梭状芽孢杆菌和/或细小梭状芽孢杆菌，这两者都具有人畜共患病的可能性。偶尔，来自其他隐孢子虫属物种的卵囊可能作为假寄生虫通过狗的肠道。如果无法确定物种，就无法解决隐孢子虫向狗主人/饲养者传播的真正问题。在这种情况下，基于18S基因座的通用PCR检测可以提供必要的分辨率来区分每个隐孢子虫物种。
图5
假寄生虫
未能识别假寄生虫可能会导致不必要的治疗。例如，在狗粪便中观察到大约60×40um类圆线虫类卵（图6）通常被解释为犬嗜血杆菌感染。事实上，如果狗吃猫粪并将钩虫作为假寄生虫传播，就不可能在微观上区分物种。从这些卵中提取的DNA经通用PCR扩增和测序ITS-1标记将确定寄生虫身份。同样，使用ITS-2PCR将确定假类圆线虫类型的卵是反刍动物还是马科动物。
图6A
图6B
PCR检测的其他应用
PCR也可用于识别/确认从粪便中排出或从宿主身上移除的大体寄生虫标本。例如，从狗的眼前房取出的蠕虫通常被怀疑是吸食线虫、心丝虫或盘尾丝虫病。如果样品不适合形态学，则使用基于NADH脱氢酶亚基5基因(ND5)的通用PCR测定可能有助于在单次PCR运行中识别这些物种中的任何一种。
尸检时收集的样本也可以使用PCR进行检测。在这些情况下，病理学家经常寻求分子辅助来鉴定组织切片中的寄生虫，通常是为了确认肉孢子虫属、弓形虫属、新孢子虫属和哈蒙德属等属中的原生动物种类，它们的组织阶段很难区分。如果通过组织学获得关于更广泛的寄生虫分类学的线索，则PCR可用于识别许多常见的寄生虫（包括蠕虫和节肢动物）。
PCR检测的样品制备
寄生虫检测PCR的成功取决于多种因素，其中最重要的是用于初始DNA提取的样品。使用福尔马林等固定剂会损害DNA链的解离，而这是PCR扩增的必要步骤。因此，对于PCR检测，提交粪便样本作为新鲜/冷藏和大体寄生虫在70%乙醇防腐剂中至关重要。福尔马林固定的寄生虫标本，包括石蜡包埋的组织体积，需要特殊的DNA提取方案，这可能会限制成功PCR所需的DNA质量。