目的:建立流式微球载体技术（FMA）检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清抗HFRS病毒特异性抗体IgM和IgG及细胞因子含量的新方法。方法:选择28例临床确诊的HFRS患者及20例健康人血清标本，FMA定量检测抗HFRS病毒IgM和IgG;定量检测细胞因子IL6和TNFα。检测结果与ELISA法进行比较。结果:FMA检测HFRS患者抗HFRS病毒IgM和IgG的阳性率分别为92.85%和71.43%，健康对照组的抗体阳性率（假阳性率）为0;HFRS患者血清IL6和TNFα的含量分别为(532.62±397.19)ng/L和(392.68±177.68)ng/L，明显高于健康对照组（38.77±20.32）ng/L（P
【关键词】肾综合征出血热;IL6;TNFα;流式细胞术;免疫酶技术
［Abstract］AIM:Toestablishaflowmicrobeadsassay(FMA)toexaminethelevelofhemorrhagicfeverwithrenalsyndromevirus(HFRSV.)specificIgM，IgGandcytokinesinHFRSpatients.METHODS:Serumsamplesfrom28casesofHFRSand20healthycontrolswerestudied.SerumlevelsofantiHFRSV.antibodieswerequalifiedandinflammatorycytokinesIL6andTNFαwerequantifiedbyFMA.TheresultswerecomparedwiththeresultsbyELISA.RESULTS:FMAshowedthatthepositivityratesforantiHFRSV.IgMandIgGwere92.85%and71.43%，respectively.Nonewasdetectedpositiveinhealthycontrolgroup.TheserumlevelofIL6andTNFαinHFRSgroupwere(532.62±397.19)ng/Land(392.68±177.68)ng/L，respectively，whichweresignificantlyhigherthanthatinhealthycontrolgroup(38.77±20.32ng/Land15.91±6.91ng/L，P
［Keywords］hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome;IL6;TNFα;Flowcytometry;immunoenzymetechnology
1材料和方法
1.1材料
陕西省疾病预防控制中心病毒研究室提供的HFRS患者血清28例，其中男18例，女10例，年龄17～52岁，平均年龄30.6岁。FACSCalibur流式细胞仪、荧光校准微球（Flowcheck）购自美国BD公司。FMA试剂盒由比利时鲁汶大学医学院馈赠。HFRS病毒抗体定性检测试剂盒主要成分包括:基因工程重组汉滩病毒抗原包被聚苯乙烯微球，荧光素（FITC）标记羊抗人IgM和IgG，阴性对照血清和阳性对照血清。人IL6和TNFα试剂盒主要成分包括:鼠抗人IL6或TNFα抗体包被聚苯乙烯微球，荧光素（FITC）标记鼠抗人IL6和TNFα抗体，不同浓度梯度的IL6和TNFα标准品。肾综合征出血热病毒IgM、IgG检测试剂盒购自北方生物技术研究所，IL6、TNFα生物素亲和素酶联免疫技术法检测试剂盒购自晶美生物工程有限公司。
1.2方法
1.2.1FMA检测血清特异性抗体
（1）血样采集:空腹抽取HFRS病人和健康人静脉血2mL，分离血清，-20℃保存。（2）检验方法:①管1空白对照:只加微球载体。管2零标准管:加微球载体和标记抗体。管3阴性对照。管4阳性对照。管5此管开始为待测样本管。②加微球载体:各管加样本稀释液100μL。所有管加微球载体10μL/管，轻柔震荡混匀。③加待测样本:管3加阴性对照10μL、管4加阳性对照10μL。待测样本管加待侧样本10μL，轻柔震荡混匀，置2～8℃孵育20min。④清洗离心:加PBS4mL/管，3000g离心6min。弃上清，存留管底微球沉淀约100μL。⑤标记从管2开始，各管加标记抗体10μL，震荡混匀，置2～8℃、避光20min。⑥分析每管加PBS0.4mL，轻柔震荡混匀后上流式细胞仪分析:上机检测前，用荧光校准微球校正流式细胞仪光路和流路，使变异系数值（CV）在2.0之内。依次上样，计数>500，得到每个测定样本荧光强度。（3）结果判定:①临界值（cutoff值）计算:临界值=阴性对照荧光强度值×2.1。②阳/阴性结果判定:测定样本荧光强度值≥临界值为抗体阳性。测定样本荧光强度值
1.2.2FMA检测血清IL6和TNFα的含量
设置空白对照:只加微球载体。零标准管:加微球载体和标记抗体和标准品管。标准品管最终浓度分别为800、400、200、100、50ng/L，用Weitongcount制作标准曲线。操作步骤详见产品说明书。
1.2.3ELISA法检测血清特异性抗体及IL6和TNFα的含量
按照试剂盒说明操作。血清IgM和IgG检测结果判断采用目测法，根据显色深浅判阳性或阴性。IL6和TNFα检测结果:在酶标仪上检测吸光度值，用CurveExpert1.3统计软件，绘制标准曲线，并计算标本中细胞因子含量，其IL6和TNFα浓度以ng/L表示。
1.2.4统计学分析
2结果
2.1FMA与ELISA方法检测血清特异性抗体
2.2FMA与ELISA方法检测血清IL6和TNFα的含量
3讨论
研究表明，人群感染HFRS病毒后仅少数人发病，大部分人呈隐性感染状态，患者感染后抗体出现早，发热1～2d即可检测出lgM抗体，第7～10天达高峰;第5～7天可检测出lgG抗体，第14～20天达高峰。
在不同的抗体成份中，对机体起免疫保护作用的主要是由汉滩病毒G1和G2糖蛋白刺激产生的中和抗体和血凝抑制抗体。细胞免疫在对HFRS病毒感染的免疫保护中同样起重要作用。一些细胞因子的水平在HFRS的不同病期也有明显变化［1］。
我们将FMA应用到HFRS患者血清异性IgM、IgG及细胞因子含量的检测，采用间接免疫荧光FMA定量检测人血清中HFRS病毒抗体IgM和IgG;采用双抗体夹心免疫荧光FMA定量检测人IL6和TNFα，检测结果与ELISA法进行比较，FMA检测HFRS患者抗HFRS病毒IgM和IgG的阳性率分别为92.85%和71.43%，健康对照组的抗体阳性率（假阳性率）为0;HFRS患者血清IL6和TNFα的含量分别为（532.62±397.19）ng/L和（392.68±177.68）ng/L，明显高于健康对照组（38.77±20.32）ng/L（P
综上所述，利用FMA对HFRS病人血清异性IgM、IgG及细胞因子含量的检测，克服了以往ELISA法检测技术的缺陷，提高了HFRS检测的准确度和重复性，该方法可以更好的用于临床，推动HFRS检测的研究与应用。并在HFRS发病机制的探讨、诊断及预后评价中有一定意义。
参考文献
［1］CaugheyMc，hartCA.Hantavirus［J］.JMedMicrobiol，2000，49:587.
［2］吴煦，王建中，李传保，等.流式免疫微球芯片技术分析特异性血小板自身抗体［J］.中华检验医学杂志，2008，31（1）:32-38.
［3］江敏，陶德定，肖徽，等.细胞可溶性蛋白质的流式微球技术定量检测［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2007，16（5）:617-618.