胡建美1，2，3，马壮1，王宝屯1，2，3，黄伟民1，冯娟2，苏友禄1*
(1.仲恺农业工程学院动物科技学院，健康养殖创新研究院，广东广州510225；2.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东广州510300；3.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海201306)
关键词：石榴皮；花鲈；杀鱼爱德华氏菌；免疫力
花鲈(Lateolabraxmaculatus)是中国重要的水产养殖品种，其隶属于鲈形目(Perciformes)鮨科(Serranidae)花鲈属(Lateolabrax)。花鲈对环境适应能力强，适合海水网箱、海淡水池塘及工厂化养殖[1]，据《2022中国渔业统计年鉴》[2]，2021年其年产量超19.9万t，其中，广东省珠海市花鲈生产量占全国总产量的一半以上。随着养殖规模和密度的不断提高，花鲈养殖过程中的病害问题愈发严重。流行病学调查显示，咸淡水养殖的花鲈病害种类多[3]，其中维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)和杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiellapiscicida)是其养殖过程中的主要致病菌[4-5]。非特异性免疫在鱼类抵御病原微生物的侵染中发挥重要作用。目前，对花鲈养殖中病害防控的有效途径是提高鱼体自身免疫力，减少抗生素及化学药物的使用。《水产养殖用药明白纸2022年1、2号》规定，多种抗生素不允许用于水产养殖过程，抗生素的禁用大大增加了生产中病害防治难度。
中草药是中国传统的医学瑰宝，历史悠久，其活性成分主要包括多糖、生物碱、有机酸和挥发油等，能够促进机体新陈代谢、提高机体免疫力和抗病能力[6]。相较于抗生素和化学药物，中草药不易产生毒副作用，也不易诱导致病菌产生耐药性，且多数中草药价格低廉，因此，其适合在水产养殖中推广应用。
石榴原产中亚地区，在中国种植范围广阔，主要分布在陕西、安徽、四川和云南等地。石榴皮(PunicagranatumL.)中含有丰富的酚类和黄酮类活性成分，据《中华人民共和国药典》[7]记载，其具有抗氧化、抗菌、止血和驱虫等功效。石榴皮提取物具有多种体外抑制病原微生物的作用。罗非鱼(Oreochromisniloticus)源维氏气单胞菌的单方中草药体外抑菌试验结果显示，其对石榴皮高度敏感，抑菌圈平均直径为17cm[8]；马玉和等[9]测定了五倍子(Rhuschinensis)、石榴皮、诃子(Terminaliachebula)、黄芩(Scutellariabaicalensis)和乌梅(Prunusmume)在不同盐度下对迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)和嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)的体外抑菌效果，结果表明，不同盐度下5种中草药对这两种细菌均存在抑制作用[9]；柯文杰等[10]采用琼脂扩散法测定了25种中草药对普通变形杆菌(Proteusvulgaris)的体外抑菌活性，结果显示，石榴皮具有显著的抑菌作用，最小抑菌浓度(MIC)为1mg/mL。
1.1.1菌株及试验动物致病性杀鱼爱德华氏菌(E.piscicida18BJ136)由课题组从患病花鲈中分离保存。健康花鲈购于广东省珠海市斗门区粉洲村某养殖场，体质量为(10.14±2.53)g，体长为(9.07±0.72)cm，暂养15d后开始试验。
1.1.2试剂石榴皮购自广东省珠海市斗门区某药房；海水鱼配合饲料(0.8号)购自珠海市德海生物科技有限公司；脑心浸出液肉汤(BHI)培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。
1.2.1石榴皮水提物的制备将石榴皮在60℃下烘干后粉碎，称取100g的石榴皮粉用纱布包裹，注入500mL纯水，浸泡2h，武火煮沸后，文火熬制30min，用4层纱布过滤，重复过滤两次，收集滤液，将滤液在水浴锅内95～100℃下常压蒸发浓缩至100mL，121℃下灭菌20min，置于4℃下保存。得到终质量浓度为1000mg/mL(相当于生药质量浓度1g/mL)的石榴皮水提物。
1.2.2石榴皮水提物拌饲投喂试验选取360尾健康花鲈，随机分为3组，每组120尾，分别暂养于2m3水池内，连续充气，水温为(31±1)℃，每天换水1次，正式试验的前一天停止喂食。试验中花鲈的日投喂量为鱼体质量的3%，每天早、晚各1次，连续投喂7d。其中，试验组1和试验组2拌饲投喂石榴皮水提物，按每kg配合饲料中分别添加4、8mL终质量浓度为1000mg/mL的石榴皮水提物，配制成4、8g/kg的中草药试验饲料[12]；对照组投喂正常配合饲料。
1.2.4血清生理生化指标的检测将血清样品送至广东省新海医院检验科，采用日本日立全自动生化分析仪(HITACHI7180)检测花鲈血清总胆固醇(TC)、谷丙转氨酶(ALT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、血糖(GLU)、乳酸脱氢酶(LDH)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)共10个指标。
表1qPCR引物Tab.1qPCRprimers
基因gene引物序列(5′-3′)primersequence(5′-3′)18SrRNAF:GGGTCCGAAGCGTTTACTR:TCACCTCTAGCGGCACAANK-lysinF:AAGCTGAAGTCCGTCTGCAAR:AGCTCCTCGACCAATTTACCAIgMF:TGACCTGTACAGCCTCTGGAR:GATGGTAAACCGGCCCTGAALZMF:TCCAAGTGGGAGTCGAGCTAR:AGCGGCTGTTGATCTGGAAGIgDF:GCCAGATCAACGTCTGACCAR:TGCAGGCTGTCTGATCCAAG
1.2.7花鲈浸泡感染杀鱼爱德华氏菌将冻存的杀鱼爱德华氏菌接种于BHI液体培养基中，28℃下以180r/min摇床培养12h后，菌原液以5000r/min离心5min，收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤3次后重悬细菌，制成菌悬液。
用石榴皮水提物拌饲投喂3、5、7d时，分别从各组取30尾花鲈进行浸泡感染试验，每组30尾花鲈再细分为3个平行，即每个平行用10尾花鲈进行浸泡感染，试验期间水温为(32.0±0.5)℃。在盛有8L水的玻璃缸中进行浸泡感染试验，3次浸泡攻毒试验水体中杀鱼爱德华氏菌浓度分别为5.24×105、6.03×105、5.67×105CFU/mL，每次浸泡攻毒时长30min，之后，将花鲈转移到100L的养殖桶中。攻毒后14d内记录花鲈的发病症状和死亡情况。试验过程中，对濒死或死后不久的花鲈取其肝脏、脾脏和头肾进行病原平板划线分离，以及菌落PCR分子鉴定。
试验数据用Excel2022软件进行初步处理，采用GraphPadPrism9软件进行单因素方差分析(one-wayANOVA)，用Tukey法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。
从图1(a)～(j)可见：试验过程中，用石榴皮水提物混合饲料投喂的试验组花鲈，其血清中总胆固醇、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、谷胱甘肽还原酶、总蛋白、甘油三酯、乳酸脱氢酶和高密度脂蛋白含量总体上较对照组显著升高(P<0.05)；试验组花鲈的血糖含量在投喂3、5d时均显著低于对照组(P<0.05)，但在投喂7d时血糖含量显著高于对照组(P<0.05)；试验组谷草转氨酶含量在投喂3、5d时显著高于对照组(P<0.05)，8g/kg试验组谷草转氨酶含量在投喂7d时恢复至对照组水平；4g/kg试验组低密度脂蛋白含量在投喂3d时与对照组含量相当，之后逐渐升高，而8g/kg试验组低密度脂蛋白含量在投喂3d时显著低于对照组(P<0.05)，之后升高，并在投喂7d时达到对照组水平。
从图1(k)、(l)可见，两个试验组花鲈血清中的碱性磷酸酶活性显著高于对照组(P<0.05)，4、8g/kg试验组酸性磷酸酶活性分别在投喂5、3d时酶活性达到峰值，投喂7d时酶活性恢复到对照组水平或低于对照组水平。这表明，石榴皮水提物拌饲投喂后能够显著增加花鲈血清碱性磷酸酶活性，且高剂量投喂7d后，可降低鱼体血清内酸性磷酸酶的活性。
从图3可见：投喂石榴皮水提物3d后的试验组花鲈，在浸泡攻毒后死亡率较空白对照组略有降低(P>0.05)，但投喂石榴皮水提物5d后，两个试验组花鲈累积死亡率降低至50%左右，且不同添加剂量的试验组间无显著性差异(P>0.05)；石榴皮水提物持续投喂7d后，4、8g/kg试验组的累积死亡率分别为70%和90%，明显低于对照组的100%。综上所述，投喂石榴皮水提物5d后，花鲈浸泡感染后的存活率显著提高，表明石榴皮水提物具有较好的免疫力增强效果，其中，4、8g/kg试验组的相对保护率分别为50%和47%。通过对患病花鲈病原菌的分离鉴定，证实其死亡由杀鱼爱德华氏菌导致。
图3花鲈摄食含石榴皮水提物的饲料3、5、7d后感染杀鱼爱德华氏菌的累积死亡率Fig.3CumulativemortalityofLateolabraxmaculatusinfectedwithEdwardsiellapiscicidaafterfeedingdietscontainingwaterextractofpomegranatepeelfor3，5and7d
NK-lysin是一种抗菌肽，具有广谱杀菌活性，主要由T淋巴细胞和自然杀伤细胞合成。免疫球蛋白是体液免疫中B细胞的主要产物，在中和抗原和清除病原中具有重要意义。溶菌酶由非特异性免疫系统中的细胞产生，具有杀菌作用，可水解细菌胞壁上的糖苷键，溶解破裂细菌达到杀菌效果。鳃是鱼类重要的外周黏膜免疫器官之一，鳃中已经发现含有多种天然免疫分子，鳃在抵御病原微生物侵染过程中发挥了重要的免疫屏障作用[21]。
2)与未添加的空白对照组相比较，用石榴皮水提物混合饲料投喂花鲈能够显著提高鱼体感染杀鱼爱德华氏菌后的存活率，改善鱼体的抗病能力，揭示了石榴皮可作为防控花鲈杀鱼爱德华氏菌病的候选中草药。
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Keywords：PunicagranatumL.;Lateolabraxmaculatus;Edwardsiellapiscicida;immunity
DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2022-241
中图分类号：S948
文献标志码：A
收稿日期：2022-08-07
基金项目：广东省教育厅重点科研项目(2019KZDXM043)
作者简介：胡建美(1995—)，女，硕士研究生。E-mail：1091158373@qq.com
通信作者：苏友禄(1981—)，男，博士，研究员。E-mail：youlusu@zhku.edu.cn