2新烟碱类农药的抗性问题：从机制到田间失效
2.1烟粉虱
2.2桃蚜
最初将CYP6CY3与抗药性联系在一起的微阵列研究也显示了一些编码角质层蛋白的ESTs基因在抗药性无性繁殖种群中表达上调，这表明通过增加角质层的渗透性可协同加强解毒作用以确定抗性表型。CYP6CY3过度表达的无性繁殖种群中存在额外机制的进一步证据来自酶抑制剂对抗性的不完全抑制，饲喂和接触生物测定中抗性的差异表达，以及放射性标记吡虫啉的体内渗透测定。然而，基于降低渗透性的抗药机制如果没有一个明确的指标来标记和衡量，就不可能单独或与不同水平的CYP6CY3过度表达一起量化其对抗药机理的重要性和贡献。
受体-放射性配基结合分析和nAChR亚基基因的核苷酸序列分析也被用来研究桃蚜新烟碱类化合物靶点抗性发生的可能性。这些研究尝试结果都是否定的，直到2009在一个新烟碱类化合物明显失去防控效果的桃园中收集到一个桃蚜无性繁殖种群（称为FRC）。FRC的抗性明显高于以前研究的任何一个无性繁殖种群。采用点滴法进行吡虫啉和噻虫嗪的生物测定中，其在可应用的最高剂量下的存活率太高，以至无法量化抗性。CYP6CY3在FRC中的过表达水平与之前研究的抗性种群相似，但另外，nAChR亚基基因的测序发现β1亚基的loopD区域存在位点突变，导致一个精氨酸被苏氨酸替代（R81T）。已知β1的loopD在天然配体乙酰胆碱和合成新烟碱类化合物的结合中发挥作用，并且R81残基已通过同源性模型明确地阐明其调节新烟碱类化合物的结合的作用。事实上，与昆虫中普遍存在的精氨酸相比，在大多数脊椎动物受体中的苏氨酸残基被认为是新烟碱类化合物发挥选择性毒性的主要决定因素。因此，很明显R81T直接导致了靶标对新烟碱类化合物抗药性水平的提升，而这一抗性水平在以前的桃蚜中是没有记录的。这是第一个被证实的因靶点基因突变而导致新烟碱类杀虫剂田间防控失败的案例。
2.3棉蚜
棉蚜与桃蚜一样，具有高度的杂食性和悠久的杀虫剂抗性历史。它的寄主植物（包括瓜类蔬菜、棉花和茄科作物等）经常被密集施用新烟碱类杀虫剂。尽管最近才得到证实，但现在看来棉蚜对这些产品的抗药性地理分布已经很广泛。澳大利亚和美国对棉蚜的系统监测表明，随着种子处理和叶面喷施对新烟碱类杀虫剂依赖程度的增加，棉蚜对烟碱类杀虫剂的敏感度暂时性下降。澳大利亚棉花昆虫的鉴别浓度分析和全剂量反应试验显示，2006年7月至2008年9月昆虫的抗性因子逐渐发生变化。在最近一季中啶虫脒、噻虫嗪和噻虫胺的抗性因子最高分别为6.4倍、22倍和6倍。这一趋势在2009—2010年继续延续，当时96%的样本发现了抗药性个体。为了应对棉蚜抗药性的发展，有人建议避免以叶面喷施新烟碱类杀虫剂的方式防治棉蚜。但由于新烟碱类杀虫剂在控制其他害虫（包括粉虱类和蝽类）方面的持续重要性，这一做法难以奏效。
2008年至2011年对美国南部棉花种植区报告的新烟碱类杀虫剂药效降低的棉蚜种群监测结果显示，4年来噻虫嗪的LC50在48倍左右，对至少一次叶面施用新烟碱类杀虫剂的农田来说抗性偏高。有趣的是，在叶片浸渍法生物测定中暴露48h后的抗性因子比72h后的抗性因子高得多，尽管两者抗性与田间处理历史之间的广泛关联都很明显。
澳大利亚和美国的抗性机制尚待阐明。而在东亚，有越来越多的证据表明R81T靶位存在与桃蚜相同的氨基酸替代。2012年从韩国6个地点采集的棉蚜对吡虫啉、啶虫脒和噻虫胺的最大抗性分别为1,500倍、2,600倍和14,000倍。更值得注意的是，2011年采集的经实验室筛选的吡虫啉抗性品系（IMI-R）对吡虫啉、啶虫脒和噻虫啉的抗性系数分别达到36,000、69,000和285,000。使用增效剂和酶分析进行的生物测定未发现IMI-R中的解毒作用比敏感品系有增强的迹象，而全长克隆显示2012年采集的5个田间种群及IMI-R的β1nAChR亚基中存在R81T。2009年在中国山东省采集的一个原始敏感品系经吡虫啉实验室筛选6代，最终对该化合物产生了66倍的抗性。对6α和β1亚基的克隆再次表明R81T存在于后者中。
这两项研究都表明，R81T是新烟碱类抗药性产生的唯一重要原因，两者之间的一个显著差异就是抗性因子的大小：在韩国，吡虫啉的抗性因子高达36,000倍；而在中国，所选品系的抗性因子仅为66倍。一种解释可能是两者采用的生物测定方法不同：前者将未经处理的蚜虫放在预先用试验溶液浸泡并晾干的叶片上，而后者将叶片和无翅蚜皆用试验溶液处理。使用这两种方法进行的并排试验将有助于揭示暴露途径在影响抗性性状表型表达方面的重要性，正如在比较桃蚜的全身和局部施用方法时已经证实的那样。R81T在桃蚜和棉蚜中的平行出现具有进化意义，并再次强调了靶点突变的有限范围，这些突变在保持正常受体功能的同时对新烟碱类化合物产生了明显的抗性。
2.4褐飞虱
褐飞虱是全亚洲最重要的水稻经济害虫，它通过直接取食后传播水稻病毒危害水稻。对褐飞虱的控制在很大程度上依赖于合成杀虫剂的使用，褐飞虱对所有已用杀虫剂都产生了抗药性。第一个新烟碱类杀虫剂吡虫啉在20世纪90年代初被用于防治褐飞虱，它有很好的防效，且对其他杀虫剂产生抗药性的褐飞虱也有好的防效，故迅速成为防治褐飞虱的主力药剂。经过10年的使用，褐飞虱种群对吡虫啉产生了抗性。目前从亚洲各地收集的褐飞虱种群广泛存在抗性，最近报道的褐飞虱对吡虫啉的抗性因子为600～800倍。
2.5家蝇
家蝇是多种人类和动物疾病的被动传播媒介，也是世界范围内为害畜牧业的一种重要害虫。与本综述中强调的其他有害生物种类一样，对家蝇的有效防治通常依赖于杀虫剂的使用，而家蝇也非常容易产生抗药性，目前已有关于60多种不同的化合物的抗性报告被列入APRD。新烟碱类杀虫剂（主要是吡虫啉和噻虫嗪）对一系列公共卫生害虫有效，多年来作为饵剂和喷雾剂一直被用来防控畜牧业中的家蝇。早期的研究表明吡虫啉对其他杀虫剂的实验室抗药性品系具有良好的防效，并且在引入新烟碱类杀虫剂用于家蝇防治之前，对田间种群的初步监测证实它们的反应只有有限的变化。然而，最近的研究表明，在世界某些地方（包括美国、欧洲、巴基斯坦和中国）田间采集的种群中发现显著抗性。对这些品系的进一步实验室筛选结果显示对吡虫啉的抗性因子高达100倍到2,000倍以上。
对这些品系抗性的潜在机制的研究发现，代谢酶和靶位点修饰可能起到一定的作用，但尚未明确代谢活性与特定酶的关联，也未确定确切的靶点改变。例如，通过细胞色素P450抑制剂PBO的处理，在丹麦田间采集的品系对吡虫啉和噻虫嗪的抗性一定程度上有所增强，这与新烟碱暴露后几个P450基因（CYP6A1、CYP6D1、CYP6D3、CYP6G4）的表达增加有关。然而，到目前为止，这些基因还没有一个在功能上被表达出来，并最终被证明能够代谢这些化合物。在同一抗性品系中，代谢抗性伴随着α2烟碱乙酰胆碱受体亚单位（Mdα2）的表达水平明显降低了60%，并被认为是导致其敏感性降低的一个可能的额外机制。需要指出的是，在这项研究中没有其他烟碱亚基被发现与表达或靶位改变有关。
有趣的是，PBO对从佛罗里达的一个田间样本中筛选出来的抗吡虫啉高抗性（2,300倍）品系并没有协同作用，这表明可能存在与蚜虫中所描述的相似的靶位点改变。这种抗性被映射到常染色体3和4，它们都携带烟碱乙酰胆碱受体亚基基因，因此似乎是一个值得进一步研究的领域。家蝇全基因组序列的公布为更详细地鉴定该品系和其他抗性品系中的nAChR基因提供了新的机会，也将有助于更清楚地了解该物种抗性的分子基础。
2.6马铃薯甲虫
马铃薯甲虫是为害马铃薯和其他茄科作物的一种重要害虫，特别是在北美和欧洲。该物种几乎对所用防治杀虫剂都迅速产生抗药性，是一种较难防治的害虫。1995年，新烟碱类杀虫剂吡虫啉在北美首次被引入防治马铃薯甲虫。1995—1998年间，对北美和欧洲种群吡虫啉敏感性的广泛监测显示，敏感性反应差异高达29倍。这种差异大部分不是由吡虫啉本身的使用导致，因为大多数被检测的种群从未接触过这种化合物，但很可能是由于与先前使用的化学物质产生交互抗性的结果。最新一项研究所描述的最不敏感的品系来自纽约长岛，该地区有密集使用杀虫剂防治马铃薯甲虫的历史。这一发现得到了同年发表的另一份报告的支持，该报告描述了早在1997年从一个吡虫啉处理过的商业马铃薯田中采集的马铃薯甲虫种群的成虫对吡虫啉的抗性水平高达100倍。随后对长岛的样本进行的监测报告显示，其对吡虫啉的抗性进一步增强（309倍），同时对呋虫胺、噻虫胺、啶虫脒、噻虫啉、噻虫嗪和烯啶虫胺也产生水平较低的交互抗性，尽管迄今为止这些药物从未在田间使用过。
马铃薯甲虫对新烟碱类化合物的抗药性的确切机制虽然尚未完全阐明，然而一些研究已经加深了对其可能机制的理解。两项使用杀虫剂增效剂对长岛抗药性品系的研究表明，P450介导的解毒作用在抗性中起着重要作用，其中可能还涉及酯酶；然而，酶抑制剂不能完全消除抗性品系中抗药性的事实表明抗性可能还涉及其他机制。与这些发现相反，其他马铃薯甲虫品系的药代动力学试验表明，放射性标记的吡虫啉在马铃薯甲虫体内的代谢没有显著差异。利用氚标记的吡虫啉结合试验，探讨了靶位修饰在马铃薯甲虫抗新烟碱化合物中的潜在作用。初步结果未能揭示吡虫啉与抗新烟碱类杀虫剂和敏感型的马铃薯甲虫头部膜制剂中的nAChR亲和力的差异。进一步的研究比较了吡虫啉对敏感和抗性甲虫离体中枢神经系统的运动神经的自发活动的神经活性。结果表明尽管抗性和敏感甲虫的中枢神经系统对吡虫啉的刺激没有差异，但观察到抗性品系中吡虫啉抑制中枢神经系统的活性比抑制敏感品系的显著降低，表明至少有一种nAChRs亚组的敏感性可能发生变化。尽管吡虫啉在抗性马铃薯甲虫中抑制神经活性的敏感性降低的原因需要进一步的研究，但其已有很大可能与观察到的吡虫啉抗性有关。
2.7温室白粉虱
温室白粉虱是世界上大多数温带地区保护地蔬菜和观赏作物的重要经济害虫。与本文中详述的许多其他害虫相似，该物种对一系列老的杀虫剂类别如拟除虫菊酯类和有机磷类杀虫剂产生了抗性，这也导致温室白粉虱的防治对新烟碱类杀虫剂的依赖性越来越大。报告的第一例新烟碱类抗药性事例是2004/2005年从英国、荷兰和美国收集的温室白粉虱种群产生的。最近的研究已经描述了来自英国、土耳其、西班牙、中国、德国和希腊的温室白粉虱种群对新烟碱类杀虫剂的抗性，芬兰的温室白粉虱种群也发现了对吡虫啉敏感性降低的情况。综上所述，这些结果表明，温室白粉虱对新烟碱类杀虫剂的抗药性现在可能在全球种群中广泛存在。
2.8其他害虫
除以上所列之外，在其他多种害虫中也报告了新烟碱类杀虫剂的抗药性，本文难以详尽归纳。然而，多份抗药性报告表明某些物种的抗药性问题日益严重，现将这些情况概述如下。
白背飞虱和小褐飞虱是亚洲两种重要的水稻害虫。2006年从东亚和东南亚采集的白背飞虱种群对吡虫啉的抗性筛查结果表明，与褐飞虱相比，大多数种群对该化合物完全敏感。然而，在同一项研究中，在日本的一个种群中首次发现了田间抗性。最近对中国白背飞虱田间种群的监测表明，自那以后，抗性变得更加普遍，2010年至2013年采集的约30%的种群对吡虫啉表现出中度抗性（＜15倍），但所有受试种群仍然对噻虫嗪敏感。对中国小褐飞虱种群敏感性的初步监测发现，江苏省采集的种群对吡虫啉的抗性水平很高，表明当地存在一个抗性热点。然而，最近对中国（包括江苏省）的种群监测发现，从2011年到2013年收集的所有种群都对吡虫啉和噻虫嗪敏感。
柑橘木虱是世界柑橘最重要的经济害虫之一，它是柑橘黄龙病的传播媒介。在佛罗里达州柑橘木虱是柑橘种植的一大问题，2009/2010年对佛罗里达州这一害虫种群的监测显示，某些种群对吡虫啉和噻虫嗪的敏感性降低，抗性最强的种群对这两种化合物的抗性分别达到35倍和13倍。这些发现表明，在佛罗里达州柑橘木虱对新烟碱类杀虫剂抗性可能正成为一个新问题。然而，与其他杀虫剂类别相比，最近的监测显示对新烟碱类的抗性略有下降。在佛罗里达州以外，最近对从墨西哥中西部的柠檬果园采集的柑橘木虱种群的监测显示，对吡虫啉和噻虫嗪的抗性（＜25倍）普遍产生，大多是中抗。然而，从米却肯州的阿帕钦甘采集到的种群对吡虫啉表现出极高的抗性（＞4,000倍），表明该地区出现了更强的抗性。
3意义与小结
交互抗性的发生是抗性管理的主要限制之一。害虫很少只对一种化合物产生抗性；抗性机制通常包含特定作用方式组内的大多数或所有化学物质，并且也会影响其他组，这种影响更不可预测。报道的许多新烟碱类化合物第一个抗性事例是通过生物测定发现的，并扩展到同类其他化合物。不同分子的抗性因子的大小可能有很大的不同，这可能是由于解毒酶的底物特异性不同所致。然而，根据现有情况，尚不可能确定商业化应用的新烟碱类杀虫剂之间一致的和可利用的交互抗性模式。先前提出的建议得到了IRAC作用机理分类（第4A组）的加强，在设计杀虫剂轮换使用策略时，以前提出的建议（经IRAC作用机理分类（第4A组）的加强），即将七种商业化应用的新烟碱类杀虫剂划入同一抗药性管理组仍然是适当的。
随着新分子的引入，交互抗性产生了一些有趣的问题，这些新分子与先前开发的分子靶向位点相同，但被认为具有独特特性从而区别于之前的分子。亚砜亚胺、氟啶虫胺腈和丁烯酸内酯、氟吡呋喃酮是nAChR激动剂，但在结构上不同于新烟碱类化合物，因此在IRAC分类方案中被归入新的亚组（分别为4C和4D）。研究表明对吡虫啉和其他常规新烟碱类具有代谢抗性的蚜虫和白粉虱对氟啶虫胺腈和氟吡呋喃酮敏感。然而，一个仍在地理上受限制的R81T突变桃蚜种群对这些新化合物都表现出明显的抗性（图6）。因此，预测涉及广泛作用机理的新化合物的交互抗性风险需要谨慎，因为这些风险可能具有特殊机制。
与靶位修饰相反，代谢增强（迄今为止）作为新烟碱类化合物抗性发展的一个原因，增加了抗药性扩展到具有相反作用方式的化合物的可能性。代表性的例子是烟粉虱和温室白粉虱对新烟碱类化合物和偶氮甲碱吡蚜酮之间的交互抗性。在新烟碱类化合物引入时，物种对新烟碱的反应的变化可能会引起对先前使用的不同化合物预先选择产生抗性的怀疑，尽管这种交互抗性的确切性质仍有待研究。
自从2005年对新烟碱杀虫剂抗性进行全面介绍后，已经有很多种类害虫对新烟碱类化合物产生了抗药性，并且2005年已经有记录的抗药性事例的范围和严重程度的也发生了变化。最值得注意的是，在鉴定抗性机制的遗传和分子基础方面取得了重大进展，提供了令人兴奋的进化见解以及快速诊断和监测抗性基因类型的技术。这些成就不仅有助于追踪和帮助遏制已知的抗药性事件发展，而且对预测新的抗药性发生风险和产生机制具有指导意义。
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