免疫诱导剂的制作方法

本申请是申请日为2010年9月2日、申请号为201080039032.2、发明名称为“免疫诱导剂”的专利申请的分案申请。

本发明涉及作为癌的治疗剂和/或预防剂等有用的新的免疫诱导剂。

背景技术：

癌是占全部死亡原因的第一位的疾病，现在进行的治疗以手术疗法为主体组合了放射线疗法和化学疗法。尽管近年来开发了新的手术法、发现了新的抗癌剂，但是现状是除了一部分癌以外，癌的治疗成绩没有太大提高。近年来，由于分子生物学、癌免疫学的进步，鉴定出了由与癌反应的细胞毒性t细胞识别的癌抗原、编码癌抗原的基因，对抗原特异性免疫疗法的期待逐步提高。

在免疫疗法中，为了减少副作用，需要被识别为其抗原的肽或蛋白在正常细胞中几乎不存在，而在癌细胞中特异性地存在。1991年，ベルギーludwig研究所的boon等人通过使用了自体癌细胞株和癌反应性t细胞的cdna表达克隆法而分离出了由cd8阳性t细胞识别的人黑素瘤抗原mage1(非专利文献1)。然后，报告了采用基因的表达克隆化的方法来鉴定由在癌患者的生物体内与自体癌反应而产生的抗体识别的肿瘤抗原的serex(重组体表达克隆抗原的血清学鉴定，serologicalidentificationsofantigensbyrecombinantexpressioncloning)法(专利文献1、非专利文献2)，通过该方法，若干癌抗原被分离。进而以其一部分为靶标开始了癌免疫疗法的临床试验。

报告了pds5a(pds5,regulatorofcohesionmaintenance,homologa)是也被称为别名ssc-112的蛋白质，被鉴定为参与染色体的分配时的细胞周期控制因子，与正常组织相比，在鼻咽癌、肾癌、肝癌、乳癌细胞的1种中表达高(专利文献2、非专利文献3～5)。而且报告了，通过使用与针对pds5a基因的反义核酸、核酶、sirna或pds5a蛋白质特异性结合的抗体来抑制癌细胞中的pds5a的表达，可以抑制癌细胞的增殖，此外，通过施用pds5a全长蛋白质或pds5a蛋白质的部分肽，可以诱导癌细胞凋亡(专利文献3)。此外，专利文献3确认了癌细胞中pds5a蛋白质的mrna量的增加。然而还没有报告pds5a蛋白质和该蛋白质的部分肽具有对癌细胞的免疫诱导活性，从而该蛋白质和该蛋白质的部分肽在癌的治疗、预防中是有用的，对pds5a蛋白质是否具有作为能够用于癌的诊断的标志物的功能还未被确认。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:美国专利第5698396号

专利文献2:wo2006/109943

专利文献3:wo2002/081641

非专利文献

非专利文献1:science，254：1643-1647(1991)

非专利文献2:proc.natl.acad.sci.usa，92：11810-11813(1995)

非专利文献3:gene.17；328：187-96(2004)

非专利文献4:j.cell.sci.15；118(pt10)：2133-41(2005)

非专利文献5:j.cancerres.clin.oncol.：134(4)：453-62(2008)

技术实现要素：

发明所要解决的课题

本发明的目的是，发现癌的治疗剂和/或预防剂、或对癌的检测有用的新的多肽，提供该多肽的免疫诱导剂或对癌的检测的应用。

用于解决课题的手段

此外还发现，pds5a的部分肽通过抗原呈递细胞被呈递，具有使对该肽特异性的细胞毒性t细胞活化和增殖的能力(免疫诱导活性)，因此，该肽对癌的治疗和/或预防是有用的，而且，与该肽接触的抗原呈递细胞、与该抗原呈递细胞接触的t细胞对癌的治疗和/或预防是有用的，从而完成了本发明。

因此，本发明具有以下的特征。

(1).一种免疫诱导剂，其中，作为有效成分，含有选自以下(a)～(c)的任一多肽类、并且具有免疫诱导活性的至少1种多肽，或者含有包含编码该多肽的多核苷酸、并能够在生物体内表达该多肽的重组载体，

(a)由序列表的序列号2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中的连续7个以上氨基酸组成的多肽，

(b)与所述(a)的多肽具有90％以上的序列同一性、并且由7个以上氨基酸组成的多肽，

(c)包含所述(a)或(b)的多肽作为部分序列的多肽。

(2).根据(1)所述的免疫诱导剂，所述(b)的多肽是与所述(a)的多肽具有95％以上的序列同一性的多肽。

(3).根据(1)所述的免疫诱导剂，所述具有免疫诱导活性的多肽是：由序列号2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中的连续7个以上氨基酸组成的多肽、或包含该多肽作为部分序列的多肽；或者在由序列号2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中的连续7个以上氨基酸组成的多肽中缺失、取代或添加了1个～数个氨基酸的多肽、或包含该多肽作为部分序列的多肽。

(4).根据(3)所述的免疫诱导剂，所述具有免疫诱导活性的多肽是具有序列表的序列号2、4、6、8、10、12或44的氨基酸序列的多肽。

(5).根据(3)所述的免疫诱导剂，所述具有免疫诱导活性的多肽是：由序列表的序列号2、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中的aa111～140、aa211～240、aa248～278、aa327～357、aa459～522、aa909～972、aa959～1022、aa994～1057或aa1018～1080的区域内的连续7个以上氨基酸组成的多肽、或包含该多肽作为部分序列的多肽；或者在由序列表的序列号2、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中的aa111～140、aa211～240、aa248～278、aa327～357、aa459～522、aa909～972、aa959～1022、aa994～1057或aa1018～1080的区域内的连续7个以上氨基酸组成的多肽中缺失、取代或添加了1个～数个氨基酸的多肽、或包含该多肽作为部分序列的多肽。

(6).根据(5)所述的免疫诱导剂，所述具有免疫诱导活性的多肽是：由序列表的序列号27～35所示的氨基酸序列组成的多肽、或包含该多肽作为部分序列并且氨基酸残基数为10～12的多肽；或者在由序列表的序列号27～35所示的氨基酸序列组成的多肽中缺失、取代或添加了1个～数个氨基酸的多肽、或包含该多肽作为部分序列并且氨基酸残基数为10～12的多肽。

(7).根据(1)～(6)的任一项所述的免疫诱导剂，其用于预防动物的癌。

(8).根据(5)或(6)所述的免疫诱导剂，其用于治疗动物的癌。

(9).根据(7)或(8)所述的免疫诱导剂，所述癌是表达pds5a的癌。

(10).根据(7)～(9)的任一项所述的免疫诱导剂，所述癌是乳癌、脑肿瘤、食道癌、肺癌、肾癌、大肠癌、肛周腺癌、神经母细胞瘤或白血病。

(11).根据(1)～(10)的任一项所述的免疫诱导剂，其还包含免疫增强剂。

(12).一种分离的抗原呈递细胞，其包含所述具有免疫诱导活性的多肽与mhc分子的复合体。

(13).一种分离的t细胞，其选择性结合所述具有免疫诱导活性的多肽与mhc分子的复合体。

(14).一种具有免疫诱导活性的多肽，该多肽是：由序列表的序列号27～35所示的氨基酸序列组成的多肽、或包含该多肽作为部分序列并且氨基酸残基数为10～12的多肽；或者在由序列表的序列号27～35所示的氨基酸序列组成的多肽中缺失、取代或添加了1个～数个氨基酸的多肽、或包含该多肽作为部分序列并且氨基酸残基数为10～12的多肽。

(15).一种癌的检测方法，其包括下述步骤：针对从生物体分离出的试样，测定由序列表的序列号2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列组成的多肽、或与该多肽具有90％以上的序列同一性的多肽的表达。

(16).一种免疫诱导方法，其包括下述步骤：向个体施用选自以下(a)～(c)的多肽类、并且具有免疫诱导活性的至少1种多肽，或者施用包含编码该多肽的多核苷酸、并能够在生物体内表达该多肽的重组载体，

发明的效果

根据本发明，提供对癌的治疗和/或预防等有用的新的免疫诱导剂。如后述的实施例中具体所示，如果对生物体施用本发明中使用的多肽，则可以在生物体内诱导免疫细胞，而且可以使已经产生的癌缩小或萎缩。因此，该多肽对癌的治疗、预防是有用的。

附图说明

图1是显示鉴定出的pds5a基因的、在狗正常组织和肿瘤组织或癌细胞株中的表达模式的图。参照编号1：狗pds5a基因在狗的各组织和细胞株中的表达模式，参照编号2：狗gapdh基因在狗的各组织和细胞株中的表达模式。

图2是显示鉴定出的pds5a基因的、在人正常组织和肿瘤组织或癌细胞株中的表达模式的图。参照编号3：人pds5a基因在人的各组织和细胞株中的表达模式，参照编号4：人gapdh基因在人的各组织和细胞株中的表达模式。

图3是显示鉴定出的pds5a基因的、在小鼠正常组织和肿瘤组织或癌细胞株中的表达模式的图。参照编号5：表示小鼠pds5a基因在小鼠的各组织和细胞株中的表达模式，参照编号6：表示小鼠gapdh基因在小鼠的各组织和细胞株中的表达模式。

图4是显示通过pds5a施用而确认了抗肿瘤效果(治疗模型-神经母细胞瘤细胞株)的图。使用基因枪免疫仅载体、或编码pds5a的质粒，以癌部的面积、生存小鼠的比例来评价。此外，各组使用了10只小鼠。对小鼠1周进行2次观察。数据以平均值±sd表示。参照编号7：表示载体的质粒的施用组，参照编号8：表示编码pds5a的质粒的施用组。

图5是显示通过pds5a施用而确认了抗肿瘤效果(预防模型-神经母细胞瘤细胞株)的图。使用基因枪免疫仅载体、或编码pds5a的质粒，以癌部的面积、生存小鼠的比例来评价。此外，各组使用了10只小鼠。对小鼠1周进行2次观察。数据以平均值±sd表示。参照编号9：表示载体的质粒的施用组，参照编号10：表示编码pds5a的质粒的施用组。

图6显示图4的实验中的小鼠的生存的比例。参照编号11：表示载体的质粒的施用组，参照编号12：表示编码pds5a的质粒的施用组。

图7显示图5的实验中的小鼠的生存的比例。参照编号13：表示载体的质粒的施用组，参照编号14：表示编码pds5a的质粒的施用组。

图8是显示通过pds5a施用而确认了抗肿瘤效果(治疗模型-大肠癌细胞株)的图。使用基因枪免疫仅载体、或编码pds5a的质粒，以癌部的面积、生存小鼠的比例来评价。此外，各组使用了10只小鼠。对小鼠1周进行2次观察。数据以平均值±sd表示。参照编号15：表示载体的质粒的施用组，参照编号16：表示编码pds5a的质粒的施用组。

图9是显示通过pds5a施用而确认了抗肿瘤效果(预防模型-大肠癌细胞株)的图。使用基因枪免疫仅载体、或编码pds5a的质粒，以癌部的面积、生存小鼠的比例来评价。此外，各组使用了10只小鼠。对小鼠1周进行2次观察。数据以平均值±sd表示。参照编号17：表示载体的质粒的施用组，参照编号18：表示编码pds5a的质粒的施用组。

图10显示图8的实验中的小鼠的生存的比例。参照编号19：表示载体的质粒的施用组，参照编号20：表示编码pds5a的质粒的施用组。

图11显示图9的实验中的小鼠的生存的比例。参照编号21：表示载体的质粒的施用组，参照编号22：表示编码pds5a的质粒的施用组。

图12是显示对具有序列表的序列号27～35所示的氨基酸序列的各多肽特异性的cd8阳性t细胞识别该多肽与hla-a0201的复合体而产生ifn-γ的图。图12中，横轴的参照编号25～33分别表示使用序列号27～35的肽刺激t2细胞而得的hla-a0201阳性的cd8阳性t细胞的ifn-γ产生能力。参照编号23显示未添加多肽而进行上述处理的情况的结果，参照编号24显示添加序列号36所示的本发明的范围外的多肽进行上述处理的结果。

图13是显示对具有序列表的序列号27～35所示的氨基酸序列的各肽特异性的cd8阳性t细胞的、对癌细胞的细胞毒活性的图。图13中，横轴的参照编号36～44分别显示使用序列号27～35的肽进行刺激而得的hla-a0201阳性的cd8阳性t细胞对t98g细胞的细胞毒活性。参照编号34显示未添加多肽而进行了诱导的cd8阳性t细胞的细胞毒活性，参照编号35显示使用阴性对照的肽(序列号36)进行了诱导的cd8阳性t细胞的细胞毒活性。

具体实施方式

作为在本发明的免疫诱导剂中作为有效成分而被包含的多肽，可列举以下多肽。另外，在本发明中，“多肽”是指多个氨基酸通过肽键而形成的分子，不仅包含构成的氨基酸数多的多肽分子，而且包含氨基酸数少的低分子量的分子(寡肽)、全长蛋白质，本发明中也包含具有序列号2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列的pds5a的全长蛋白质。

(a)：由具有序列表的序列号2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列的多肽中的连续7个以上氨基酸组成，并具有免疫诱导活性的多肽，

(b)：与(a)的多肽具有90％以上的序列同一性，由7个以上氨基酸组成，并具有免疫诱导活性的多肽，

(c)：包含(a)或(b)的多肽作为部分序列，并具有免疫诱导活性的多肽。

另外，在本发明中，“具有氨基酸序列”是指氨基酸残基以这样的顺序排列。因此，例如，“具有序列号2所示的氨基酸序列的多肽”意味着，具有序列号2所示的metaspphethr……(中间省略)……aspleuglnarg的氨基酸序列的、大小为1337氨基酸残基的多肽。此外，例如，有时将“具有序列号2所示的氨基酸序列的多肽”简写为“序列号2的多肽”。关于“具有碱基序列”这样的表达也是同样的。该情况下，“具有”这样的用语可以以“由……组成”这样的表达替换。

这里，“免疫诱导活性”意味着在生物体内诱导能分泌干扰素等细胞因子的免疫细胞的能力。

上述多肽是否具有免疫诱导活性可以使用例如公知的酶联免疫斑点(elispot)测定法等来确认。具体而言，例如后述的实施例中记载的那样，从施用了要评价免疫诱导活性的多肽的生物体获得外周血单核细胞等细胞，将该细胞与该多肽共培养，使用特异性抗体测定由该细胞产生的细胞因子产生量，从而可以测定该细胞中的免疫细胞数，由此可以评价免疫诱导活性。

此外，如后述的实施例中所记载的那样，如果对荷瘤生物体施用上述(a)～(c)的重组多肽，则也可以通过其免疫诱导活性使肿瘤萎缩。因此，上述免疫诱导活性也可以作为抑制癌细胞增殖或使癌组织(肿瘤)缩小或消失的能力(以下，称为“抗肿瘤活性”)来评价。多肽的抗肿瘤活性例如后述的实施例中具体记载的那样，可以通过实际上对荷瘤生物体施用该多肽来研究肿瘤是否缩小等从而确认。

或者，通过研究用该多肽刺激的t细胞(即，与呈递该多肽的抗原呈递细胞接触的t细胞)是否在生物体外对肿瘤细胞显示细胞毒活性，也可以评价多肽的抗肿瘤活性。t细胞与抗原呈递细胞的接触如后述那样，可以通过将两者在液体培养基中共培养来进行。细胞毒活性的测定可以通过例如int.j.cancer,58:p317,1994中记载的被称为51cr释放测定法的公知方法来进行。在将上述多肽用于癌的治疗和/或预防用途的情况下，没有特别的限制，但优选以抗肿瘤活性作为指标来评价免疫诱导活性。

上述(a)的多肽为由具有序列号2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列的多肽中的连续7个以上、优选为连续8、9或10个以上氨基酸组成的多肽，其具有免疫诱导活性。特别优选该多肽具有序列号2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列。另外，如本领域中公知的那样，只要是约7个氨基酸残基以上的多肽就能够发挥抗原性和免疫原性。因此，只要是序列号2、4、6、8、10、12或44的氨基酸序列中的连续7个氨基酸残基以上的多肽，就能够具有免疫诱导活性，因此可以用于本发明的免疫诱导剂的调制。

此外，作为通过施用癌抗原多肽进行的免疫诱导的原理，已知多肽被抗原呈递细胞摄取，然后在该细胞内受到通过被肽酶分解而变成更小的片段，被呈递至该细胞的表面上，细胞毒性t细胞等识别该片段，选择性杀死呈递该抗原的细胞。被呈递至抗原呈递细胞的表面上的多肽的尺寸比较小，以氨基酸数计为7～30左右。因此，从呈递至抗原呈递细胞上这样的观点出发，作为上述(a)的多肽，优选形态之一为序列号2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中的连续7～30左右，更优选只要是由8～30或9～30左右的氨基酸组成的多肽即是充分的。这些比较小的尺寸的多肽也有时不摄取至抗原呈递细胞内，而直接被呈递至抗原呈递细胞上的细胞表面。

此外，被摄取到抗原呈递细胞的多肽通过该细胞内的肽酶而在任意位置被切割，产生各种多肽片段，这些多肽片段被呈递至抗原呈递细胞表面上，因此如果施用序列号2、4、6、8、10、12或44的全长区域那样的大尺寸的多肽，则由于在抗原呈递细胞内的分解而在介由抗原呈递细胞的免疫诱导中必然产生有效的多肽片段。因此，对于介由抗原呈递细胞的免疫诱导而言，可以优选使用尺寸大的多肽，氨基酸数可以为30以上，更优选为100以上，进一步优选为200以上，进一步优选为250以上，进一步优选为序列号2、4、6、8、10、12或44的全长区域的多肽。

上述(b)的多肽是在上述(a)的多肽中取代、缺失和/或插入了少数(优选为1个或数个)氨基酸残基，与原序列具有90％以上、优选为95％以上、更优选为98％以上、进一步优选为99％以上或99.5％以上的序列同一性，并且具有免疫诱导活性的多肽。一般而言，本领域技术人员公知，在蛋白质抗原中，有时即使在该蛋白质的氨基酸序列中取代、缺失或插入了少数氨基酸残基，也与原蛋白质具有几乎相同的抗原性。因此，上述(b)的多肽也能够发挥免疫诱导活性，因此可以用于本发明的免疫诱导剂的调制。此外，上述(b)的多肽也优选为在序列号2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中取代、缺失和/或插入了1个～数个氨基酸残基的多肽。本说明书中的“数个”表示2～10的整数，优选为2～6的整数，更优选为2～4的整数。

这里，氨基酸序列或碱基序列的“序列同一性”是指，以要比较的2个氨基酸序列(或碱基序列)的氨基酸残基(或碱基)尽量多地一致的方式使两氨基酸序列(或碱基序列)排列，将一致的氨基酸残基数(或一致的碱基数)除以全部氨基酸残基数(或全部碱基数)而得的结果以百比率表示的数值。在上述排列时，根据需要，在进行比较的2个序列的一者或双者中插入适当缺口。这样的序列的排列化可以使用例如blast、fasta、clustalw等公知的程序来进行。在插入了缺口的情况下，上述全部氨基酸残基数为将1个缺口算作1个氨基酸残基后的残基数。这样算出的全部氨基酸残基数在进行比较的2个序列之间不同的情况下，序列同一性(％)是将一致的氨基酸残基数除以较长序列的全氨基酸残基数而算出的。

另外已知，构成天然的蛋白质的20种氨基酸可以如下分组成具有类似性质的氨基酸：具有低极性侧链的中性氨基酸(gly、ile、val、leu、ala、met、pro)、具有亲水性侧链的中性氨基酸(asn、gln、thr、ser、tyr、cys)、酸性氨基酸(asp、glu)、碱性氨基酸(arg、lys、his)、芳香族氨基酸(phe、tyr、trp)，如果在它们之间进行取代，则一般多肽的性质无变化。因此，在取代本发明的上述(a)的多肽中的氨基酸残基的情况下，通过在这些各组之间取代，可以维持免疫诱导活性的可能性较高，因此是优选的。

另外，作为成为上述的表位肽的上述(b)的多肽，优选为在由序列号2、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中的aa111～140、aa211～240、aa248～278、aa327～357、aa459～522、aa909～972、aa959～1022、aa994～1057或aa1018～1080的区域内的连续7个以上氨基酸组成的多肽中缺失、取代或添加了1个～数个氨基酸、并且具有免疫诱导活性的多肽，或者包含该多肽作为部分序列、并且具有免疫诱导活性的多肽，更优选为在序列号4或44的多肽中或者由序列号27～35所示的氨基酸序列组成的多肽中缺失、取代或添加了1个～数个氨基酸、并且具有免疫诱导活性的多肽，或者包含该多肽作为部分序列、并且氨基酸残基数为10～12的多肽。

上述(c)的多肽是包含上述(a)或(b)的多肽作为部分序列，并具有免疫诱导活性的多肽。即，是在(a)或(b)的多肽的一端或两端添加了其它氨基酸或多肽，并具有免疫诱导活性的多肽。这样的多肽也可以用于本发明的免疫诱导剂的调制。

另外，作为成为上述的表位肽的上述(c)的多肽，优选为包含由序列号2、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中的aa111～140、aa211～240、aa248～278、aa327～357、aa459～522、aa909～972、aa959～1022、aa994～1057或aa1018～1080的区域内的连续7个以上氨基酸组成的多肽作为部分序列的多肽，更优选为在序列号4或44的多肽中由序列号27～35所示的氨基酸序列组成的多肽中缺失、取代或添加了1个～数个氨基酸的多肽，或者包含该多肽作为部分序列、并包含氨基酸残基数为10～12的多肽作为部分序列的多肽。

上述的多肽可以按照例如fmoc法(芴基甲氧羰基法)、tboc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法来合成。此外，也可以利用各种市售的肽合成仪通过常规方法来合成。此外，可以通过使用公知的基因工程方法，制备编码上述多肽的多核苷酸，将该多核苷酸整合到表达载体中并导入宿主细胞中，通过在该宿主细胞中生产多肽，从而获得作为目标的多肽。

作为上述宿主细胞，只要是能够表达上述多肽的细胞即可，作为原核细胞的例子，可列举大肠杆菌等，作为真核细胞的例子，可列举猴肾细胞cos1、中国仓鼠卵巢细胞cho等哺乳动物培养细胞、芽殖酵母、裂殖酵母、蚕细胞、爪蟾卵细胞等，但不限于此。

在使用原核细胞作为宿主细胞的情况下，作为表达载体，使用具有能够在原核细胞中复制的复制起点、启动子、核糖体结合部位、dna克隆化部位、终止子等的表达载体。作为大肠杆菌用表达载体，可以例示puc系、pbluescriptii、pet表达系统、pgex表达系统等。如果将编码上述多肽的dna整合到这样的表达载体中，用该载体转化原核宿主细胞，然后培养所得的转化体，则可以使由上述dna所编码的多肽在原核宿主细胞中表达。此时，也可以使该多肽以与其它蛋白质的融合蛋白质的形式表达。

在使用真核细胞作为宿主细胞的情况下，作为表达载体，使用具有启动子、剪接区域、多(a)添加部位等的真核细胞用表达载体。作为那样的表达载体，可以例示pka1、pcdm8、psvk3、pmsg、psvl、pbk-cmv、pbk-rsv、ebv载体、prs、pcdna3、pmsg、pyes2等。与上述同样地，如果将编码上述多肽的dna整合到这样的表达载体中，用该载体转化真核宿主细胞，然后培养所得的转化体，则可以使由上述dna所编码的多肽在真核宿主细胞中表达。在使用pind/v5-his、pflag-cmv-2、pegfp-n1、pegfp-c1等作为表达载体的情况下，可以作为添加了his标签、flag标签、myc标签、ha标签、gfp等各种标签的融合蛋白质来表达上述多肽。

表达载体向宿主细胞的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、deae葡聚糖法等公知的方法。

为了从宿主细胞中分离纯化目的多肽，可以组合公知的分离操作来进行。可列举例如通过尿素等变性剂和/或表面活性剂进行的处理、超声波处理、酶消化、盐析和/或溶剂分级沉淀法、透析、离心分离、超滤、凝胶过滤、sds-page、等电点电泳、离子交换色谱法、疏水色谱法、亲和色谱法、反相色谱法等，但不限于此。

通过以上的方法而获得的多肽中如上所述也包含处于与其它任意的蛋白质的融合蛋白质的形态的多肽。例如，可以例示与谷胱甘肽-s-转移酶(gst)和/或his标签的融合蛋白质等。这样的融合蛋白质形态的多肽也作为上述(c)的多肽而包含在本发明的范围内。此外，有时在转化细胞中被表达的多肽在被翻译之后在细胞内受到各种修饰。这样的经翻译后修饰的多肽只要具有免疫诱导活性也包含在本发明的范围内。作为这样的翻译后修饰，可以例示n末端蛋氨酸的脱离、n末端乙酰化、附加糖链、通过细胞内蛋白酶进行的限制性分解、肉豆蔻酰化、异戊二烯基化、磷酸化等。

如后述的实施例中具体记载的那样，如果对荷瘤生物体施用包含上述具有免疫诱导活性的多肽或编码该多肽的基因的表达载体，则可以使已经产生的肿瘤萎缩。此外，通过对癌发作前的生物体施用上述的具有免疫诱导活性的多肽或编码多肽的基因，可以预防肿瘤的发生。因此，本发明的免疫诱导剂可以作为癌的治疗剂和/或预防剂使用。此外，上述的具有免疫诱导活性的多肽可以用于通过免疫诱导进行的癌的治疗和/或预防方法。

这里，“肿瘤”和“癌”这样的用语意味着恶性赘生物，可互换使用。

在该情况下，作为对象的癌只要是表达pds5a的癌即可，则没有特别的限制，但优选为乳癌、脑肿瘤、食道癌、肺癌、肾癌、大肠癌、肛周腺癌、神经母细胞瘤或白血病。

此外，作为对象的动物优选为哺乳动物，更优选为包含灵长类、宠物、家畜类、竞技用动物等的哺乳动物，特别优选为人、狗或猫。

本发明的免疫诱导剂对生物体的施用途径可以为经口施用也可以为非经口施用，但优选为肌肉内施用、皮下施用、静脉内施用、动脉内施用等非经口施用。在为了癌的治疗而使用该免疫诱导剂的情况下，为了提高抗癌作用，如后述的实施例中记载的那样，也可以施用于作为治疗对象的肿瘤的附近的所属淋巴结。施用量只要是对免疫诱导有效的量即可，例如如果是用于癌的治疗和/或预防，则只要是对癌的治疗和/或预防有效的量即可。对癌的治疗和/或预防有效的量根据肿瘤的大小和/或症状等来适当选择，通常作为相对于对象动物每1天的有效量为0.0001～1000μg，优选为0.001～1000μg，可以1次施用或分成数次施用。优选分成数次，每隔数日～数月地施用。如后述的实施例中具体所示那样，本发明的免疫诱导剂可以使已经形成的肿瘤萎缩。因此，对发生初期的少数癌细胞也能够发挥抗癌作用，因而如果在癌的发作前、癌的治疗后使用，则可以防止癌的发作、复发。即，本发明的免疫诱导剂对癌的治疗和预防两者均有用。

本发明的免疫诱导剂可以仅由多肽构成，也可以适当混合适合各施用方式的药理学上容许的载体、稀释剂、赋形剂等添加剂来制剂。制剂方法和能够使用的添加剂在药物制剂的领域是公知的，可以使用任一方法和添加剂。作为添加剂的具体例，可列举生理缓冲液那样的稀释剂；砂糖、乳糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨糖醇、甘氨酸等那样的赋形剂；糖浆、明胶、阿拉伯树胶、山梨糖醇、聚氯乙烯、黄蓍胶等那样的粘合剂；硬脂酸镁、聚乙二醇、滑石、二氧化硅等润滑剂等，但不限于这些。作为制剂形态，可以列举片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等经口施用剂、吸入剂、注射剂、栓剂、可溶液体制剂等非经口施用剂等。这些制剂可以通过一般已知的制法来制作。

本发明的免疫诱导剂可以与能够强化生物体内的免疫应答的免疫增强剂组合使用。免疫增强剂可以包含在本发明的免疫诱导剂中，也可以作为另一个组合物而与本发明的免疫诱导剂合并对患者施用。

此外，作为上述免疫增强剂，除了上述佐剂以外，也可以使用刺激对象的免疫应答的因子。例如，可以将具有刺激淋巴细胞、抗原呈递细胞的特性的各种细胞因子作为免疫增强剂与本发明的免疫诱导剂组合使用。这样的能够增强免疫应答的多数细胞因子是本领域技术人员公知的，作为其例子，可列举显示强化疫苗的防御作用的白介素-12(il-12)、gm-csf、il-18、干扰素α、干扰素β、干扰素ω、干扰素γ和flt3配体，但不限于这些。这样的因子也可以作为上述免疫增强剂使用，可以包含在本发明的免疫诱导剂中或作为另一个组合物与本发明的免疫诱导剂合并对患者施用。

此外，通过使上述多肽与抗原呈递细胞在体外接触，可以将该多肽呈递至抗原呈递细胞。即，上述(a)～(c)的多肽可以作为抗原呈递细胞的处理剂来利用。这里，作为抗原呈递细胞，可以优选使用带有mhc类i分子的树突细胞或b细胞。已鉴定出各种mhci类分子，是公知的。人中的mhc分子称为hla。作为hlai类分子，可以列举hla-a、hla-b、hla-c，更具体而言，可以列举hla-a1、hla-a0201、hla-a0204、hla-a0205、hla-a0206、hla-a0207、hla-a11、hla-a24、hla-a31、hla-a6801、hla-b7、hla-b8、hla-b2705、hla-b37、hla-cw0401、hla-cw0602等。

使上述多肽与抗原呈递细胞在体外接触的方法本身可以通过公知的方法来进行。例如，可以通过将抗原呈递细胞在包含上述多肽的培养液中培养来进行。对培养基中的肽浓度没有特别的限制，但通常为1～100μg/ml左右，优选为5～20μg/ml左右。对培养时的细胞密度没有特别的限制，通常为103～107个细胞/ml左右，优选为5×104～5×106个细胞/ml左右。培养优选按照常规方法，在37℃、5％co2气氛中进行。另外，抗原呈递细胞可以呈递至表面上的肽的长度通常最大为30氨基酸残基左右。因此，虽然没有特别的限制，但使抗原呈递细胞与多肽在体外接触的情况下，可以将该多肽调制成约30氨基酸残基以下的长度。

通过在上述的多肽共存下培养抗原呈递细胞，肽被抗原呈递细胞的mhc分子摄取，呈递至抗原呈递细胞的表面。因此，可以使用上述多肽来调制包含该多肽与mhc分子的复合体的分离的抗原呈递细胞。这样的抗原呈递细胞可以在生物体内或体外对t细胞呈递该多肽，诱导对该多肽特异性细胞毒性t细胞，使其增殖。

通过上述的共培养，可诱导并增殖对该多肽特异性的细胞毒性t细胞。因此，可以使用上述多肽来调制选择性结合该多肽与mhc分子的复合体的分离的t细胞。

如后述的实施例中记载的那样，编码pds5a的基因分别在乳癌细胞、乳癌组织、脑肿瘤细胞、脑肿瘤组织、食道癌细胞、食道癌组织、肺癌细胞、肺癌组织、肾癌细胞、肾癌组织、大肠癌细胞、大肠癌组织、肛周腺癌组织、肛周腺癌细胞、神经母细胞瘤细胞和白血病细胞中特异性表达。因此认为，在这些癌种类中，与正常细胞相比，pds5a显著多地存在。癌细胞内存在的pds5a的一部分被呈递至癌细胞表面上的mhc分子，如果在生物体内施用以上述方式调制的细胞毒性t细胞，则细胞毒性t细胞可以将该呈递有pds5a的一部分的mhc分子作为标记来抑制癌细胞。此外，呈递上述多肽的抗原呈递细胞也可以在生物体内诱导对该多肽特异性的细胞毒性t细胞，使其增殖，因此也可以通过将该抗原呈递细胞施用于生物体内来抑制癌细胞。即，使用上述多肽而调制的上述细胞毒性t细胞、上述抗原呈递细胞也与本发明的免疫诱导剂同样地作为癌的治疗剂和/或预防剂是有用的。

在将上述的分离的抗原呈递细胞、分离的t细胞施用于生物体的情况下，为了避免将这些细胞作为异物而攻击的生物体内的免疫应答，优选如上所述使用上述(a)～(c)的多肽调制从接受治疗的患者采集的抗原呈递细胞或t细胞。

包含抗原呈递细胞或分离的t细胞作为有效成分的癌的治疗剂和/或预防剂的施用途径优选为静脉内施用、动脉内施用那样的非经口施用。此外，施用量可根据症状、施用目的等来适当选择，但通常为1个～10兆个，优选为100万个～10亿个，优选数天～数月施用1次。制剂可以为例如将细胞悬浮于生理缓冲盐水中而得的制剂等，也可以与其它抗癌剂、细胞因子等合并使用。此外，也可以添加制剂领域中公知的1种或2种以上添加剂。

此外，也可以通过使编码上述(a)～(c)的多肽的多核苷酸在对象动物的体内表达，来在该生物体内进行抗体生产、诱导细胞毒性t细胞，获得与施用多肽同等的效果。即，本发明的免疫诱导剂可以是包含编码上述的(a)～(c)的多肽的多核苷酸、并包含能够在生物体内表达该多肽的重组载体作为有效成分的免疫诱导剂。如后述的实施例所示那样，能够表达这样的抗原多肽的重组载体被称为基因疫苗。

用于制造基因疫苗的载体只要是能够在对象动物细胞内(优选为哺乳动物细胞内)表达的载体即可，没有特别的限定，可以是质粒载体也可以是病毒载体，可以使用在基因疫苗领域公知的任何载体。另外，编码上述多肽的dna、rna等多核苷酸，如上所述，可以通过常规方法容易地调制。此外，该多核苷酸向载体的整合可以通过本领域技术人员公知的方法来进行。

基因疫苗的施用途径优选为肌肉内施用、皮下施用、静脉内施用、动脉内施用等非经口施用途径，施用量可以根据抗原的种类等来适当选择，但通常为每1kg体重，以基因疫苗的重量计为0.1μg～100mg左右，优选为1μg～10mg左右。

作为利用病毒载体的方法，可列举例如在反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德毕斯病毒等rna病毒或dna病毒中整合编码上述多肽的多核苷酸，使对象动物感染该病毒的方法。其中，特别优选使用反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、牛痘病毒等的方法。

作为其它方法，可列举直接在肌肉内施用表达质粒的方法(dna疫苗法)、脂质体法、lipofectin法、显微注射法、磷酸钙法、电穿孔法等，特别优选dna疫苗法、脂质体法。

使编码本发明中使用的上述多肽的基因实际上作为药物起作用时，有将基因直接导入体内的体内(invivo)方法和从对象动物采集某种细胞在体外将基因导入该细胞并将该细胞送回体内的体外(exvivo)方法(日経サイエンス，1994年4月，20-45页，月刊药事，1994年，第36卷，第1号，23-48页，实验医学增刊，1994年，第12卷，第15号，及其引用文献等)。更优选invivo方法。

在通过invivo方法来施用的情况下，可根据治疗目标的疾病、症状等通过适当施用途径来施用。例如，可以施用于静脉、动脉、皮下、肌肉内等。在通过invivo方法来施用的情况下，例如可采用可溶液体制剂等制剂形态，一般而言，采用含有编码作为有效成分的本发明的上述肽的dna的注射剂等，根据需要可以加入惯用的载体。此外，在含有该dna的脂质体或膜融合脂质体(仙台病毒(hvj)-脂质体等)中，可以为悬浮剂、冷冻剂、离心分离浓缩冷冻剂等脂质体制剂的形态。

另外，在本发明中，所说的“序列号1所示的碱基序列”，除了序列号1中实际所示的碱基序列以外，也包含与其互补的序列。因此，所说的“具有序列号1所示的碱基序列的多核苷酸”，包含具有序列号1实际所示的碱基序列的单链多核苷酸、具有其互补的碱基序列的单链多核苷酸和由它们构成的双链多核苷酸。在调制编码本发明中使用的多肽的多核苷酸的情况下，适当选择任一碱基序列，只要是本领域技术人员，就可以容易地进行该选择。

此外，本发明中使用的多肽为癌特异性表达，因此仅与荷瘤生物体中的血清特异性反应，因而本发明的多肽也可用于癌的检测。

作为检测上述癌的方法，使用从生物体分离出的试样，测定由序列号2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列组成的多肽的表达，或者作为其同源因子的与该多肽具有90％以上、优选为95％以上、更优选为98％以上、进一步优选为99％以上或99.5％以上的序列同一性的多肽的表达。作为使用上述试样测定多肽的表达的方法，可列举对试样中所含的针对该多肽的抗体进行免疫测定的方法(第1方法)、对试样中所含的该多肽本身进行免疫测定的方法(第2方法)和对试样中所含的编码该多肽的mrna进行测定的方法(第3方法)。本发明的方法可以以这些方法中的任一方法来测定多肽的表达。另外，在本发明中，“测定”这样的用语包含检测、定量和半定量的任一种。

在本发明的第2方法中，测定能够在由生物体获得的试样中包含的、序列号2、4、6、8、10、12或44的多肽或其同源因子。如上所述，在癌患者中，与序列号2、4、6、8、10、12或44的多肽或其同源因子进行抗原抗体反应的癌特异性抗体的量显著多，这显示在癌患者体内，作为该癌特异性抗体的抗原的这些多肽或其同源因子的产生量显著多。因此，也可以通过测定序列号2、4、6、8、10、12或44的多肽或其同源因子，与上述第1方法同样地，检测生物体内的癌。

试样中的多肽的测定可以通过公知的免疫测定法来容易地进行。具体而言，例如，制作与序列号2、4、6、8、10、12或44所示的多肽或其同源因子进行抗原抗体反应的抗体或其抗原结合性片段，使用其进行免疫测定，从而可以测定能够在试样中存在的由序列号2、4、6、8、10、12或44所示的序列组成的多肽或其同源因子。免疫测定方法本身是如上所述的公知的常规方法。

这里，“抗原结合性片段”意味着抗体分子中所含的fab片段、f(ab’)2片段那样的、具有与抗原的结合能力的抗体片段。抗体可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体，但为了免疫测定等，优选再现性高的单克隆抗体。以多肽为免疫原的多克隆抗体和单克隆抗体的制备方法是公知的，可以通过常规方法来容易地进行。例如，通过将使多肽与钥孔血蓝蛋白(klh)、酪蛋白等载体蛋白质结合成的物质作为免疫原，与佐剂一起对动物免疫，从而可以诱导针对该多肽的抗体。可以使从免疫后的动物采集的脾细胞、淋巴细胞那样的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合来制作杂交瘤细胞，选择产生与序列号2、4、6、8、10、12或44所示的多肽或其同源因子结合的抗体的杂交瘤细胞，使其增殖，从培养上清液得到以上述蛋白质为对应抗原的单克隆抗体。另外，上述的方法是公知的常规方法。

本发明的第3方法测定能够在从生物体获得的试样中包含的、编码pds5a的mrna。如后述的实施例中具体所示那样，编码pds5a的mrna在癌、乳癌、脑肿瘤、食道癌、肺癌、肾癌、大肠癌、肛周腺癌、神经母细胞瘤和白血病的组织或细胞中显著高表达。因此，也可以通过测定试样中的该mrna来检测生物体内的癌。

本发明的检测方法基于如上所述测定的多肽的表达量来判断对象生物体是否为癌等。癌的检测也能够仅测定对象生物体中的多肽的表达，但是从提高检测精度的观点出发，优选研究1～多名健常人试样中的多肽的表达量(抗体量、多肽量或mrna量)来取得健常人基准值，将对象生物体的测定值与该健常人基准值进行比较。此外在想要提高检测精度的情况下，也可以对从已知罹患癌的多名患者得到的试样研究多肽表达量来取得癌患者基准值，将对象生物体的测定值与健常人基准值和癌患者基准值两者进行比较。上述基准值可以通过例如将各试样中的多肽表达量数值化，算出其平均值来确定。另外，健常人基准值与癌患者基准值可以预先对多名健常人和癌患者研究多肽表达量来确定好。因此，在采用本发明的方法进行与基准值的比较的情况下，可以使用预先确定的基准值。

本发明的检测方法中可以组合使用通过其它癌抗原、癌标记进行的检测。由此，可以进一步提高癌的检测精度。

根据本发明的检测方法，可以检测生物体内的癌。根据本发明的方法，连眼睛看不见的小尺寸的肿瘤、体内深部的肿瘤也可以检测，因此对癌的早期发现是有用的。此外，如果对癌的治疗后随访中的患者应用本发明的检测方法，则可以在有癌的复发的情况下早期检测到该癌。

此外，在荷瘤生物体中，如果表达本发明中作为测定对象的上述规定的多肽的癌细胞的数目增加，则相应地该生物体内的该多肽及其mrna的蓄积量增大，血清中大量产生针对上述多肽的抗体。另一方面，如果癌细胞的数目减少，则相应地生物体内的该多肽及其mrna的蓄积量减少，血清中的针对上述多肽的抗体减少。因此，在上述规定的多肽的表达量多的情况下，可以判断为发生肿瘤的增大、癌的转移，即癌的进行度进展。

此外，如后述的实施例所示那样，在同一种类的肿瘤中，恶性型与良性型相比上述抗体量显著多。因此，在上述规定的多肽的表达量多的情况下，可以判断为癌的恶性度更高。即，根据本发明的方法，也可以检测癌的恶性度。

此外，也可以将上述规定的多肽的表达量的增减作为指标来监测癌的治疗效果。因此，关于癌的治疗中、治疗后的个体，通过观察上述多肽的表达量，可获得抗癌剂的治疗效果、肿瘤摘出后的残存肿瘤有无、进而即使在随访中也可迅速获知转移、复发的线索。在进行了适当治疗的情况下，多肽的表达量与治疗前的荷瘤状态相比降低，因此可以判断为对该生物体进行的(正进行的)治疗的效果良好。在多肽表达量上升或维持的情况下，或在观察到暂时降低后再上升的情况下，可以判断为治疗效果不充分，成为向其它治疗方法变更、抗癌剂施用量变更等治疗方法选择的有用判断材料。

作为本发明的癌的检测方法的对象的癌，是表达pds5a的癌，可列举乳癌、脑肿瘤、食道癌、肺癌、肾癌、大肠癌、肛周腺癌、神经母细胞瘤或白血病作为优选例。此外，作为本发明的方法的对象的生物体优选为哺乳动物，更优选为人、狗、猫。

作为供于本发明的方法的试样，可列举血液、血清、血浆、腹水、胸水等体液、组织、细胞。特别是在上述第1方法和第2方法中，可以优选使用血清、血浆、腹水和胸水，此外，在测定mrna的上述第3方法中，优选组织试样和细胞试样。

第1方法中作为免疫测定的抗原使用的上述多肽可以作为癌检测试剂提供。该试剂可以仅由上述多肽构成，此外也可以包含对该多肽的稳定化等有用的各种添加剂等。此外，该试剂也可以以固定化于板、膜等固相的状态提供。

第2方法中对序列号2、4、6、8、10、12或44所示的多肽或其同源因子进行免疫测定时使用的、与该多肽或其同源因子进行抗原抗体反应的抗体或其抗原结合性片段也可以作为癌检测试剂提供。该情况下的癌检测试剂也可以仅由上述抗体或抗原结合性片段构成，此外也可以包含对该抗体或抗原结合性片段的稳定化等有用的各种添加剂等。此外，该抗体或抗原结合性片段可以结合有锰、铁等金属。如果将那样的金属结合抗体或抗原结合性片段施用于体内，则在抗原蛋白质更多存在的部位更多地集聚该抗体或抗原结合性片段，因此如果通过mri等来测定金属，则可以检测产生抗原蛋白质的癌细胞的存在。

此外，第3方法中用于mrna的测定的上述癌检测用多核苷酸也可以作为癌检测试剂来提供。在该情况下，癌检测用试剂也可以仅由该多核苷酸构成，此外也可以包含对该多核苷酸的稳定化等有用的各种添加剂等。该试剂中所含的该癌检测用多核苷酸优选为引物或探针。

实施例

以下，基于实施例更具体地说明本发明。

实施例1：通过serex法获得新的癌抗原蛋白

(1)cdna文库的制作

从荷瘤狗的乳癌组织通过酸-胍盐-酚-氯仿法(acidguanidium-phenol-chloroform法)提取总rna，使用oligotex-dt30mrnapurificationkit(宝酒造社制)按照试剂盒所附的实验方法纯化多聚arna。

使用该获得的mrna(5μg)来合成cdna噬菌体文库。cdna噬菌体文库的制作中使用cdnasynthesiskit、zap-cdnasynthesiskit、zap-cdnagigapackiiigoldcloningkit(stratagene社制)，按照试剂盒所附的实验方法来制作文库。制作的cdna噬菌体文库的大小为1×106pfu/ml。

(2)利用血清来筛选cdna文库

使用上述制作的cdna噬菌体文库进行免疫筛选。具体而言，使其以在φ90×15mm的nzy琼脂糖板上为2340克隆的方式感染宿主大肠杆菌(xl1-bluemrf’)，在42℃培养3～4小时，制作噬斑(plaque)，用浸透了iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)的硝基纤维素膜(hybondcextra:gehealthecarebio-sciece社制)在37℃覆盖板4小时，从而使蛋白质诱导、表达，在膜上转印蛋白质。然后回收膜并浸泡在包含0.5％脱脂奶粉的tbs(10mmtris-hcl，150mmnacl(ph值7.5))中在4℃振荡一晚，从而抑制非特异性反应。使该膜与500倍稀释后的患狗血清在室温反应2～3小时。

将印迹有上述处理血清和上述融合蛋白质的膜用tbs-t(0.05％tween20/tbs)进行洗涤4次后，使作为二抗的用包含0.5％脱脂奶粉的tbs进行了5000倍稀释的山羊抗狗igg(goatantidogigg-h+ihrpconjugated：bethyllaboratories社制)在室温反应1小时，通过使用了nbt/bcip反应液(roche社制)的酶显色反应进行检测，从φ90×15mm的nzy琼脂糖板上采集与显色反应阳性部位一致的菌落，使其溶解在sm缓冲液(100mmnacl，10mmmgclso4，50mmtris-hcl，0.01％明胶(ph值7.5))500μl中。采用与上述同样的方法重复进行二次、三次筛选直到显色反应阳性菌落单一化，对与血清中的igg进行反应的30940个噬菌体克隆进行筛选，分离出1个阳性克隆。

(3)分离的抗原基因的序列同一性检索

为了将通过上述方法分离出的1个阳性克隆供于碱基序列分析，进行从噬菌体载体转换成质粒载体的操作。具体而言，将以使吸光度od600为1.0的方式调制宿主大肠杆菌(xl1-bluemrf’)而得的溶液200μl与纯化后的噬菌体溶液100μl以及exassisthelperphage(stratagene社制)1μl混合后，在37℃反应15分钟后，添加3mllb培养基并在37℃进行培养2.5～3小时，立即在70℃的水浴中保温20分钟后，在4℃以1000×g离心15分钟，回收上清液作为噬粒(phagemid)溶液。接着将以使吸光度od600为1.0的方式调制噬粒宿主大肠杆菌(solr)而得的溶液200μl与纯化后的噬菌体溶液10μl混合，然后在37℃反应15分钟，接种在50μl的含有氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的lb琼脂培养基中在37℃培养一晚。采集转化后的solr的单菌落，在含有氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的lb培养基中在37℃培养后，使用qiagenplasmidminiprepkit(キアゲン社制)纯化具有目标插入片段的质粒dna。

(4)各组织中的表达分析

实施例2：pds5a在生物体内的癌抗原性的分析和药效评价

(1)在生物体内表达pds5a的重组载体的制作

以序列号5的碱基序列为基础，采用以下的方法制作在生物体内表达pds5a的重组载体。pcr通过在实施例1中观察到表达的小鼠癌细胞株n2a(从atcc购入)来调制。如下进行：按照cdna1μl、包含noti和xhoi限制性酶切序列的2种引物(在序列号25和26记载)各0.4μm、0.2mmdntp、1.25u的primestarhs聚合酶(宝酒造社制)的方式加入各试剂和所附缓冲液，使总量为50μl，使用thermalcycler(biorad社制)，将98℃-10秒，55℃-15秒，72℃-4分钟的循环重复进行30次。另外，上述2种引物是扩增编码序列号5的氨基酸序列全长的区域的引物。pcr后，将扩增的dna用1％琼脂糖凝胶进行电泳，使用qiaquickgelextractionkit(qiagen社制)纯化约4000bp的dna片段。

将纯化的dna片段与克隆载体pcr-blunt(invitrogen社制)连接。将其转化至大肠杆菌后回收质粒，由测序确认了扩增后的基因片段与目标序列一致。将与目标序列一致的质粒用noti和xhoi限制性酶处理，用qiaquickgelextractionkit纯化后，将目标基因序列插入到用noti、xhoi限制性酶进行了处理的哺乳类表达载体pcdna3.1(invitrogen社制)中。通过使用该载体在哺乳类的细胞内产生pds5a蛋白。

在由上述制作的质粒dna100μg中添加50μg的金粒子(biorad社制)、亚精胺100μl(sigma社制)、1mcacl2100μl(sigma社制)，通过涡旋混合器进行搅拌，在室温静置10分钟(以后记载为金-dna粒子)。以3000转/分钟离心1分钟后，舍弃上清液，用100％乙醇(wako社制)洗涤3次。在金-dna粒子中加入100％乙醇6ml，通过涡旋混合器充分地搅拌后，将金-dna粒子注入tefzeltubing(biorad社制)中，使其在壁面沉淀。将附着有金-dna粒子的tefzeltubing的乙醇风干，切割成适合基因枪的长度。

(2)通过dna疫苗法制成的pds5a的抗肿瘤效果

在10只a/j小鼠(7周龄，雄，从日本slc社购入)和balb/c小鼠(7周龄，雄，从日本slc社购入)的皮下分别移植1×106个小鼠神经母细胞瘤细胞株n2a、大肠癌细胞株ct26后，将由上述制作的管固定于基因枪，使用纯氦气以400psi的压力对剃毛后的小鼠的腹腔每隔7天透皮施用dna疫苗共计3次(质粒dna接种量为2μg/只)，评价抗肿瘤效果(治疗模型)。此外，同样地操作，每隔7天对10只a/j小鼠和balb/c小鼠透皮施用dna疫苗共计3次后，移植n2a细胞、ct26细胞来评价抗肿瘤效果(预防模型)。另外，作为对照，将未插入pds5a基因的质粒dna在各模型各施用10只。

由以上的结果可知，pds5a质粒施用组与对照组相比确认了显著的抗肿瘤效果，因此表明了，pds5a为具有强的癌抗原性的癌抗原，对癌的治疗和预防是有效的。

实施例3：肽表位反应性cd8阳性t细胞的诱导

从hla-a0201阳性的健常人分离出外周血，叠层在lymphocyteseparationmedium(organonpteknika，durham，nc)上以1,500转/分钟在室温离心分离20分钟。回收含有外周血单核细胞(pbmc)的组分，在冷磷酸盐缓冲液中洗涤3次(或3次以上)，得到了pbmc。将所得的pbmc悬浮在aim-v培养基(lifetechnololgies，inc.，美国纽约州grandisland)20ml中，在培养瓶(falcon)中在37℃、5％co2的条件下使其附着2小时。非附着细胞用于调制t细胞，附着细胞用于调制树突细胞。

另一方面，将附着细胞在aim-v培养基中在il-4(1000u/ml)和gm-csf(1000u/ml)的存在下培养。6天后更换成添加了il-4(1000u/ml)、gm-csf(1000u/ml)、il-6(1000u/ml，genzyme，cambridge，ma)、il-1β(10ng/ml，genzyme，cambridge，ma)和tnf-α(10ng/ml，genzyme，cambridge，ma)的aim-v培养基，再培养2天后，使用所得的非附着细胞群作为树突细胞。

将调制的树突细胞在aim-v培养基中以1×106个细胞/ml的细胞密度悬浮，分别以10μg/ml的浓度添加所选择的多肽，使用96孔板在37℃、5％co2的条件下培养4小时。培养后，进行x射线照射(3000rad)，用aim-v培养基洗涤，在含有10％人ab血清(nabi，miami，fl)、il-6(1000u/ml)和il-12(10ng/ml，genzyme，cambridge，ma)的aim-v培养基中悬浮，在24孔板每1孔中分别添加1×105个细胞。然后，分别以每1孔为1×106个细胞添加调制的t细胞群，在37℃、5％co2的条件下培养。7天后，舍弃各培养上清液，与上述同样地操作，将用所得的各多肽处理后进行了x射线照射的树突细胞在含有10％人ab血清(nabi，miami,fl)、il-7(10u/ml，genzyme，cambridge，ma)和il-2(10u/ml，genzyme，cambridge，ma)的aim-v培养基中悬浮(细胞密度：1×105个细胞/ml)，在24孔板每1孔中分别添加1×105个细胞，再进行培养。每隔7天将同样的操作重复4～6次后，回收被刺激的t细胞，通过流式细胞仪确认诱导了cd8阳性t细胞的诱导。

实施例4：刺激hla-a0201阳性cd8阳性t细胞的pds5a中的细胞毒性t细胞抗原表位的确定

通过显微镜下的细胞数计测确认了在上述诱导后的各孔的t细胞内，被序列号27～35的各多肽刺激了的t细胞增殖了。对于观察到了增殖的各t细胞，为了研究针对用于刺激的各多肽的特异性，对5×104个被多肽刺激后的、表达hla-a0201分子的t2细胞(salterrdetal.，immunogenetics，21：235-246(1985)，从atcc购入)(以10μg/ml的浓度在aim-v培养基中添加各多肽，在37℃、5％co2的条件下培养4小时)添加5×103个t细胞，采用96孔板在包含10％人ab血清的aim-v培养基中培养24小时。取培养后的上清液，通过elisa法测定ifn-γ的产生量。其结果是，与使用了未进行多肽刺激的t2细胞的孔的培养上清液相比，在使用进行了序列号27～35的各多肽刺激的t2细胞的孔的培养上清液中，确认了ifn-γ产生(图12)。因此表明了，序列号27～35的各多肽是具有特异性地刺激hla-a0201阳性cd8阳性t细胞增殖、诱导ifn-γ产生的能力的t细胞表位肽。另一方面，在添加具有序列号36所示的氨基酸序列的本发明的范围外的多肽来进行上述处理的情况下，未发现ifn-γ产生(图12)。

接下来研究了，作为本发明中使用的多肽的序列号27～35的各多肽是否是被呈递至hla-a0201阳性且表达pds5a的肿瘤细胞上的hla-a0201分子上的多肽，以及被本多肽刺激了的cd8阳性t细胞是否能够抑制hla-a0201阳性且表达pds5a的肿瘤细胞。

在105个50ml容量的离心管中收集确认了pds5a的表达的恶性脑肿瘤细胞株、t98g(steinghetal.，j.cellphysiol.，99：43-54(1979)，从atcc购入)，加入100μci的铬51，在37℃温育2小时。然后用包含10％人ab血清的aim-v培养基洗涤3次，在96孔v底板每1孔中各添加103个，然后在其中分别添加被悬浮在包含10％人ab血清的aim-v培养基中的105、5×104、2.5×104和1.25×104个被序列号27～35的各多肽刺激后的hla-a0201阳性的cd8阳性t细胞，在37℃、5％co2的条件下培养4小时。培养后，测定从受到抑制的肿瘤细胞释放的培养上清液中的铬51的量，从而算出被序列号27～35的各多肽刺激后的cd8阳性t细胞的细胞毒活性。

其结果表明了，被序列号27～35的各多肽刺激了的hla-a0201阳性的cd8阳性t细胞具有对t98g的细胞毒活性(图13)。因此明确了，作为本发明中使用的多肽的序列号27～35的各多肽被呈递至hla-a0201阳性且表达pds5a的肿瘤细胞上的hla-a0201分子上，而且这些多肽具有诱导能够抑制这样的肿瘤细胞的cd8阳性细胞毒性t细胞的能力。另一方面，在添加具有序列号36所示的氨基酸序列的本发明的范围外的多肽来进行上述处理的情况下，未见细胞毒活性(图13)。

另外，关于细胞毒活性，是显示将上述那样地用本发明中使用的各多肽刺激诱导后的cd8阳性t细胞105个和摄取了铬51的103个恶性脑肿瘤细胞株t98g混合并培养4小时，培养后测定在培养基中释放的铬51的量，通过以下计算式＊算出的cd8阳性t细胞对t98g的细胞毒活性的结果。

＊式：细胞毒活性(％)＝加入了cd8阳性t细胞时从t98g游离的铬51游离量÷从加入了1n盐酸的靶细胞游离的铬51游离量×100。

实施例5：重组pds5a蛋白质的制作、药效评价和癌的检测和癌诊断

(1)重组pds5a蛋白质的制作

以实施例1中取得的序列号1的基因为基础，采用以下方法制作重组蛋白质。pcr如下进行：按照由实施例1中获得的噬粒溶液调制并供于序列分析的载体1μl、包含noti和xhoi限制性酶切序列的2种引物(在序列号37和38中记载)各0.4μm、0.2mmdntp、1.25u的primestarhs聚合酶(宝酒造社制)的方式加入各试剂和所附缓冲液，使总量为50μl，使用thermalcycler(biorad社制)，将98℃-10秒，55℃-15秒，72℃-4分钟的循环重复进行30次。另外，上述2种引物是扩增编码序列号2的氨基酸序列全长的区域的引物。pcr后，将被扩增的dna用1％琼脂糖凝胶进行电泳，使用qiaquickgelextractionkit(qiagen社制)纯化约4000bp的dna片段。

将纯化后的dna片段与克隆载体pcr-blunt(invitrogen社制)连接。将其转化至大肠杆菌后回收质粒，由测序确认了被扩增的基因片段与目标序列一致。将与目标序列一致的质粒用noti和xhoi限制性酶处理，用qiaquickgelextractionkit纯化后，将目标基因序列插入到用noti、xhoi限制性酶处理后的大肠杆菌用表达载体pet30a(novagen社制)中。通过该载体的使用可以产生his标签融合型的重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌bl21(de3)，通过1mmiptg进行表达诱导来使目标蛋白质在大肠杆菌内表达。

此外，以序列号43的基因为基础，采用以下的方法制作人pds5a的重组蛋白质。pcr如下进行：按照由实施例1制作的各种组织和/或细胞cdna通过rt-pcr法确认了表达的cdna1μl、包含noti和xhoi限制性酶切序列的2种引物(在序列号39和40记载)各0.4μm、0.2mmdntp、1.25u的primestarhs聚合酶(宝酒造社制)的方式加入各试剂和所附缓冲液，使总量为50μl，使用thermalcycler(biorad社制)，将98℃-10秒，55℃-15秒，72℃-4分钟的循环重复进行30次。另外，上述2种引物是扩增编码序列号44的氨基酸序列全长的区域的引物。pcr后，将扩增的dna用1％琼脂糖凝胶进行电泳，使用qiaquickgelextractionkit(qiagen社制)纯化约4000bp的dna片段。

将纯化后的dna片段与克隆载体pcr-blunt(invitrogen社制)连接。将其转化至大肠杆菌后回收质粒，由测序确认了扩增的基因片段与目标序列一致。将与目标序列一致的质粒用noti和xhoi限制性酶处理，用qiaquickgelextractionkit纯化后，将目标基因序列插入到用noti、xhoi限制性酶处理后的大肠杆菌用表达载体pet30a(novagen社制)中。通过使用该载体可以产生his标签融合型的重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌bl21(de3)，通过1mmiptg进行表达诱导来使目标蛋白质在大肠杆菌内表达。

此外，以序列号5的基因为基础，用以下的方法制作小鼠pds5a的重组蛋白质。pcr如下进行，按照由实施例1制作的各种组织和/或细胞cdna通过rt-pcr法确认了表达的cdna1μl、包含noti和xhoi限制性酶切序列的2种引物(在序列号41和42记载)各0.4μm、0.2mmdntp、1.25u的primestarhs聚合酶(宝酒造社制)的方式加入各试剂和所附缓冲液，使总量为50μl，使用thermalcycler(biorad社制)，将98℃-10秒，55℃-15秒，72℃-4分钟的循环重复30次。另外，上述2种引物是扩增编码序列号6的氨基酸序列全长的区域的引物。pcr后，将扩增的dna用1％琼脂糖凝胶进行电泳，使用qiaquickgelextractionkit(qiagen社制)纯化约4000bp的dna片段。

将纯化后的dna片段与克隆载体pcr-blunt(invitrogen社制)连接。将其转化至大肠杆菌后回收质粒，由测序确认了被扩增了的基因片段与目标序列一致。将与目标序列一致的质粒用noti和xhoi限制性酶处理，用qiaquickgelextractionkit纯化后，将目标基因序列插入到用noti、xhoi限制性酶处理后的大肠杆菌用表达载体pet30a(novagen社制)中。通过使用该载体可以产生his标签融合型的重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌bl21(de3)，通过1mmiptg进行表达诱导来使目标蛋白质在大肠杆菌内表达。

(2)重组pds5a蛋白质的纯化

将由上述获得的表达序列号2、序列号44或序列号6的各个重组大肠杆菌在含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中在37℃培养直到600nm的吸光度为0.7左右，然后添加异丙基-β-d-1-硫代半乳糖苷使终浓度为1mm，再在37℃培养4小时。然后以4800转/分钟离心10分钟并收集菌体。将该菌体颗粒悬浮在磷酸缓冲化生理盐水中，再以4800转/分钟离心10分钟并进行菌体的洗涤。

将该菌体悬浮在50mmtris-盐酸缓冲液(ph值8.0)中，在冰上进行超声波破碎。将大肠杆菌超声波破碎液以6000转/分钟离心分离20分钟，将所得的上清液作为可溶性级分，将沉淀物作为不溶性级分。

将不溶性级分在50mmtris-盐酸缓冲液(ph8.0)中悬浮，以6000转/分钟离心15分钟。将本操作重复2次，进行脱蛋白酶操作。

将该残渣悬浮在含有6m盐酸胍、0.15m氯化钠的50mmtris-盐酸缓冲液(ph值8.0)中，在4℃静置20小时使蛋白质变性。该变性操作后，将以6000转/分钟离心30分钟而得的可溶性级分添加至按照常规方法调制的镍螯合柱(载体：chelateingsepharose(商标)fastflow(gehealthcare社)，柱容量5ml，平衡化缓冲液：含有6m盐酸胍、0.15m氯化钠50mmtris-盐酸缓冲液(ph值8.0))中，再在4℃静置一晚并进行对镍螯合化后的载体的吸附。将该柱载体以1500转/分钟离心5分钟来回收上清液，对于柱载体，在磷酸缓冲化生理盐水中悬浮后，再填充于柱中。

将柱未吸附级分用柱容量的10倍量的含有0.5m氯化钠的0.1m乙酸缓冲液(ph值4.0)进行洗涤操作后，立即用含有0.5m氯化钠的0.1m乙酸缓冲液(ph值3.0)进行溶出而作为纯化级分，以后将该纯化级分作为施用试验用的材料。另外，各溶出组分中的目标蛋白质通过按照常规方法进行的考马斯染色确认。

将通过上述方法而获得的纯化标品置换到反应用缓冲液(50mmtris-hcl，100mmnacl，5mmcacl2(ph值8.0))中后，使用factorxacleavagecapturekit(novagen社制)按照所附实验方法通过factorxa蛋白酶进行his标签的切割和目标蛋白质的纯化。接下来，将通过上述方法而获得的纯化标品12ml使用超滤nanosep10komega(pall社制)进行生理用磷酸缓冲液(日水制药社制)置换后，用htタフリンアクロディスク0.22μm(pall社制)进行无菌过滤，将其用于实验。

(3)重组小鼠pds5a蛋白质对荷瘤小鼠的抗肿瘤效果

在a/j小鼠(7周龄，雄，从日本slc社购入)的皮下移植1×106个小鼠神经母细胞瘤细胞株n2a，在肿瘤达到平均50～100mm3的时刻(典型地为肿瘤接种后7天)，将小鼠以1组10只的方式随机分组，进行重组小鼠pds5a蛋白质的抗肿瘤效果的评价(治疗模型)。在如上所述纯化后的重组小鼠pds5a蛋白质100μg(0.5ml)中混合50μg的多聚ic来调制癌治疗剂，将其对荷瘤小鼠每一周向皮下施用共计3次。其结果是，从癌治疗剂施用起31天后，肿瘤完全萎缩。另一方面，pbs(-)施用阴性对照组和多聚ic单独施用组(50μg)中，施用后31天后，肿瘤分别为平均1657mm3、平均932mm3。

此外，调制混合有重组小鼠pds5a蛋白质100μg(0.5ml)和50μg的多聚ic的癌治疗剂，将其对a/j小鼠每一周向皮下施用共计3次后，移植1×106个n2a细胞来评价抗肿瘤效果(预防模型)。另外，1组为10只，作为比较对照，分成pbs(-)施用阴性对照组和多聚ic单独施用组(50μg)。其结果是，施用了癌治疗剂的组中，施用癌治疗剂在40天后也观察不到肿瘤发生。另一方面，pbs(-)施用阴性对照组和多聚ic单独施用组(50μg)中，施用后40天后分别为平均1989mm3、平均1843mm3。

用大肠癌模型进行同样的实验。对balb/c小鼠(7周龄，雄，从日本slc社购入)的皮下移植1×106个大肠癌细胞株ct26，在肿瘤达到平均50～100mm3的时刻(典型地为肿瘤接种后7天)，将小鼠以1组10只的方式随机分组，进行重组小鼠pds5a蛋白质的抗肿瘤效果的评价(治疗模型)。在如上所述纯化后的重组小鼠pds5a蛋白质100μg(0.5ml)中混合50μg的多聚ic来调制癌治疗剂，将其对荷瘤小鼠每一周向皮下施用共计3次。其结果是，从癌治疗剂施用起24天后，肿瘤完全萎缩。另一方面，pbs(-)施用阴性对照组和多聚ic单独施用组(50μg)中，施用后24天后，肿瘤分别为平均1449mm3、平均835mm3。

此外，调制混合有重组小鼠pds5a蛋白质100μg(0.5ml)和50μg的多聚ic的癌治疗剂，将其对balb/c小鼠每一周向皮下施用共计3次后，移植1×106个ct26细胞来评价抗肿瘤效果(预防模型)。另外，1组为10只，作为比较对照，分成pbs(-)施用阴性对照组和多聚ic单独施用组(50μg)。其结果是，施用了癌治疗剂的组中，施用癌治疗剂31天后也观察不到肿瘤发生。另一方面，pbs(-)施用阴性对照组和多聚ic单独施用组(50μg)中，施用后31天后分别为平均1781mm3、平均1675mm3。

由以上的结果明确了重组pds5a蛋白质对癌的治疗和预防是有效的。

(4)重组pds5a蛋白质对荷瘤患狗的抗肿瘤效果

对表皮具有肿瘤的荷瘤患狗3只(乳腺肿瘤3只)，进行后述的实施例5中记载的重组蛋白质的抗肿瘤效果的评价。进行施用前，首先，通过后述的实施例5(3)中记载的方法，测定针对各患狗的血清中的重组蛋白质的抗体效价，结果是检测到了高于健常狗的抗体效价。因此暗示出，这些荷瘤患狗的生物体中的肿瘤组织中，具有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质作为癌抗原表达。

此外，对肛门周围发生的腺癌和表皮处发生的扁平上皮癌的患狗各1只，在如后述的实施例5那样在纯化后的重组狗pds5a蛋白质500μg(2.5ml)中混合等量的不完全弗氏佐剂(和光纯药社制)而作为癌治疗剂，将其每一周向肿瘤附近的皮下施用共计4次。其结果是，在癌治疗剂施用时刻癌的大小分别为约370mm3和280mm3的肿瘤，在从癌治疗剂施用起分别35天后和42天后完全萎缩。

(5)使用了重组pds5a蛋白质的癌的检测

对于用于上述癌诊断的共112个样本，使用摘出的肿瘤组织的病理诊断的结果全部确诊为恶性。

具体为受到了下述癌诊断的样本，所述癌是恶性黑素瘤、恶性混合肿瘤、肝细胞癌、基底细胞癌、口腔内肿瘤、肛周腺癌、肛门囊肿瘤、肛门囊顶质分泌腺癌、睾丸支持细胞瘤、阴道前庭癌、皮脂腺癌、皮脂腺上皮瘤、皮脂腺腺瘤、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、大肠癌、支气管腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、复合型乳腺癌、乳腺恶性混合肿瘤、乳管内乳头状腺癌、纤维肉瘤、血管周皮瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、软组织肉瘤、组织细胞肉瘤、粘液肉瘤、未分化肉瘤、肺癌、肥大细胞瘤、皮肤平滑肌瘤、腹腔内平滑肌瘤、平滑肌瘤、扁平上皮癌、慢性型淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、消化道型淋巴瘤、消化器型淋巴瘤、小～中细胞型淋巴瘤、肾上腺髓质肿瘤、颗粒细胞瘤、嗜铬细胞瘤等。

恶性黑素瘤5例，淋巴瘤10例，颗粒细胞瘤1例，肝细胞癌3例，恶性精巢肿瘤3例，口腔内肿瘤3例，肛周腺癌5例，肉瘤9例，乳腺癌35例，肺癌1例，腺管癌4例，皮脂腺癌2例，肥大细胞瘤5例，平滑肌肉瘤1例，扁平上皮癌4例，恶性混合肿瘤2例，血管周皮瘤1例。

此外，使用由上述(2)制作的人pds5a蛋白质(序列号44)与上述同样地操作进行癌诊断，结果得到了同样的结果。

由此表明了，通过使用pds5a蛋白质测定与该蛋白质特异性反应的血清中的抗体效价，可以进行癌的检测和诊断。

产业可利用性

本发明的包含对各种癌发挥抗肿瘤活性的多肽的免疫诱导剂对癌的治疗和/或预防或癌的检测是有用的。

序列表

<110>东丽株式会社

<120>免疫诱导剂

<130>10057

<160>44

<170>patentin版本3.1

<210>1

<211>4396

<212>dna

<213>狗（canisfamiliaris）

<220>

<221>cds

<222>(116)..(4129)

<223>

<400>1

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glyhislysilegluthraspleuproglnileargserthrleuile

710715720

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<210>2

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<212>prt

<400>2

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151015

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65707580

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phelysleulysserasnaspglyglugluargleualavalvalarg

290295300

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ilethralaalalysargaspleualaleuvalasnaspglnleuleu

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glualametmetglyleualaglnleutyrlyslystyrcysleuhis

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<210>4

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<400>4

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1295

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<210>11

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cttgaagttttaatgacaaagaatgagaacaatagccatgccttc3437

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asnserthrgluargglylyslysargthralathralasergly

thrgluasnilehisglnlysalaglugluasnasnalaaspglu

thrglyproserleualaalalysthrargargglyargpropro

lysprogluproglnglythrthralalysasnglugluthrasn

lysproprovalargglyarglysargalaalaalaserglnglu

serproglyserleuglualaglyasnalalysalaprolysgln

glnaspthralalyslysproalaalaalaglnargglnileasp

leuglnarg

<210>13

<211>20

<213>人工序列

<223>t3引物

<400>13

aattaaccctcactaaaggg20

<210>14

<211>19

<223>t7引物

<400>14

taatacgactcactatagg19

<210>15

<211>25

<223>正向引物

<400>15

aatagcatcgatgacaaactgttgg25

<210>16

<211>24

<223>反向引物

<400>16

ggtcaggcaaattctttgctatgg24

<210>17

<211>21

<400>17

gtaaggtggctgttgggtatg21

<210>18

<400>18

ggctagcaggtgaatcatgtatgg24

<210>19

<211>23

<400>19

acttctggtaaggtggctgttgg23

<210>20

<400>20

gggctaggaggtgaatcatgtatgg25

<210>21

<211>18

<223>gapdh引物

<400>21

gggctgcttttaactctg18

<210>22

<400>22

ccaggaaatgagcttgac18

<210>23

<400>23

cttcaccaccatggagaagg20

<210>24

<400>24

tgaagtcgcaggagacaacc20

<210>25

<211>33

<400>25

atggacttcacgcagccgaagcctgccactgcc33

<210>26

<211>40

<400>26

ttacctttgtaaatcaatttgtctctctgctggaactgcc40

<210>27

<211>9

<400>27

asnleuileproalahislysasnleu

<210>28

<211>10

<400>28

lysglucysleutrpphemetleugluval

<210>29

<400>29

pheleuglyargpheasnaspilehisval

<210>30

<400>30

leuleuleuproleuglutyrmetalaile

<210>31

<400>31

serleuaspproasnalavallysalaleu

<210>32

<400>32

lysleulysaspilepheleupheile

<210>33

<400>33

leuleuserleuleuproglutyrvalval

<210>34

<400>34

lysmetalagluasnilelysleuthr

<210>35

<400>35

glnvalleuvalleuglyargserserval

<210>36

<400>36

leuglncyscysseralatyrlysleu

<210>37

<211>34

<400>37

gcggccgcatggacttcaccgcgcagcccaagcc34

<210>38

<211>45

<400>38

ctcgagttacctttgtaagtcaatctgtctctctgctggtactgc45

<210>39

<211>29

<400>39

gcggccgcatggacttcaccgcgcagccc29

<210>40

<400>40

ctcgagttacctttgtaagtcaatttgtc29

<210>41

<211>31

<400>41

gcggccgcatggacttcacgcagccgaagcc31

<210>42

<211>27

<400>42

ctcgagttacctttgtaaatcaatttg27

<210>43

<211>7190

<222>(541)..(4554)

<400>43

ggccggcggaggaaggggagggagcgaggagcgcgcgctgctctcgcgtgctctcgcgcc60

gctcgcgtgaccggccggtgtgtgcgcgaggccccggctcccggggcacggacggccggg120

cgcgcgcctctgcgaggggcgtccgggtccgagtcggcggtccgggccggcgcgaggtgc180

gtgcgggcgggccgcgggggtcccggacggacacaagcgcacacactcccggaggagcct240

tcgaggctgctcttcctcggccagacggagagcggcactgtctccccgcccagcgctcac300

tcgccccgcgtctccccccgcggcggctgctcctcctcggcaccgccagccccagcgccg360

ctcccgggcgggcgggcggcggcggcggcggcggcgggacccgcggagccgctttgtgtg420

cagcccgactaggggcggcggcgcaaccacctgacagaggcccgggcgctcgatgcacct480

tccgcccgcatgaggaggagaggccggtagaggactgtgaaccaaaagttgtcccccagg540

atggacttcaccgcgcagcccaagcctgccactgccctctgtggcgtc588

gtgagtgccgacgggaagatcgcttaccctccgggggtaaaagagatc636

accgacaagatcaccacggacgagatgatcaaacgcctgaagatggta684

gtgaaaacctttatggatatggatcaggactcagaagatgaaaaacag732

cagtatctcccactagccttgcatcttgcatctgaattcttcctcagg780

aaccccaataaagatgtgcgtctccttgtagcatgttgtttggctgat828

atctttcgtatctatgccccagaagctccatatacttcccatgataaa876

cttaaggacatatttttgtttattaccagacaattaaaaggtttggag924

gatacaaagagtccacagtttaatagatacttttatttattagagaat972

ttagcttgggttaaatcatataacatctgctttgaattggaagattgc1020

aatgaaatttttattcagctttttagaactctcttctcagtgatcaac1068

aatagccacaataagaaggtacaaatgcacatgctagatttgatgagt1116

tctatcatcatggaaggtgatggagttactcaagaattattggactcc1164

attcttattaacctcattcctgcacataagaacttaaataaacagtcc1212

tttgaccttgcaaaagtgctattgaaaagaacagtccagactattgag1260

gcatgcattgctaattttttcaatcaagtcctggtgctgggaagatca1308

tcagtaagtgatttgtcagaacatgtatttgatctgattcaggaactt1356

tttgctatagatcctcatttattattatccgtcatgccacagcttgaa1404

ttcaaactaaagagcaatgatggagaagagcgattagctgttgttcga1452

cttctagctaaattgtttggctccaaagattctgatttggcaacacag1500

aatcgtcctctttggcaatgttttcttggacgatttaatgatattcat1548

gttcctgtgagattagaaagtgtgaaatttgccagtcattgtttaatg1596

aatcacccagatttagcgaaggatctcacagaatatttaaaggttaga1644

tcacatgatccagaagaagctattcgtcatgatgtcattgttactata1692

ataacagctgccaagagggacctggccttagtaaatgatcagctgctt1740

ggctttgtaagggaaagaacactggataaacggtggcgagtaagaaaa1788

gaagctatgatgggtctggctcagctttataagaaatactgtcttcat1836

ggtgaagcaggaaaggaagctgcagagaaagtcagctggataaaggac1884

aaacttctgcatatttattatcagaacagcattgacgacaaactgttg1932

gtagagaaaatctttgctcagtatcttgtcccccacaacctggaaaca1980

gaagagagaatgaaatgcttatattacttatatgctagtttggatcca2028

aatgctgtaaaagctctcaacgaaatgtggaagtgtcagaacatgctt2076

cggagccatgtacgcgaactattggatttgcacaagcagcctacatca2124

gaggctaactgttctgccatgtttggaaaactgatgaccatagcaaag2172

aatttgcctgaccccgggaaagcacaagattttgtgaagaaatttaac2220

caggttctcggcgatgatgagaaacttcggtctcagttggagttatta2268

attagcccaacctgttcttgcaaacaagcagatatttgtgtgagagaa2316

ileserprothrcyssercyslysglnalaaspilecysvalargglu

atagcccggaaacttgcaaatcctaagcaaccaacaaatccttttcta2364

gagatggtcaaatttctgttggaaagaatcgcacctgtgcacattgat2412

tcagaagccataagtgcactagtgaaattgatgaataagtcaatagag2460

gggacagcagatgatgaagaggagggtgtaagtccagatacagctatc2508

cgttcaggacttgaacttcttaaggttctgtcttttacacatcctacc2556

tcgttccactctgcagagacatatgagtccttgttacagtgcctaaga2604

atggaggatgacaaggtagcagaagctgctattcaaatttttagaaat2652

acaggtcacaaaatagaaacagaccttccccagatacgatcgacctta2700

attcccattttacatcaaaaagcaaagaggggtactccacaccaagca2748

aaacaggctgtgcactgtatacacgccatattcacaaataaagaagtc2796

cagcttgcacagatttttgagccactcagtaggagtctgaatgctgat2844

gtgccagaacaacttataactccattagtttcattgggccacatttct2892

atgttagcaccagatcagtttgcttccccaatgaaatctgtagtagca2940

aattttattgtgaaagatctgctaatgaatgacaggtcaacaggtgaa2988

aagaatggaaaactgtggtctccagatgaagaggtttcccctgaagta3036

ctagcaaaggtacaggcaattaaacttctggtaaggtggctgttgggt3084

atgaaaaacaaccagtctaaatctgccaattcaacccttcggttatta3132

tcagcgatgttggttagtgagggtgacctgacagagcaaaagaggatc3180

agtaaatctgatatgtctcgcttgcgattagctgctggtagtgccata3228

atgaagcttgctcaggaaccttgttaccatgaaattattaccccagaa3276

cagtttcagctctgtgcacttgttattaatgatgagtgttaccaagta3324

aggcagatatttgctcagaagctgcataaggcacttgtgaagttactg3372

ctcccattggagtatatggcgatctttgccttgtgtgccaaagatcct3420

gtgaaggagagaagagcacacgcacgacaatgtttactgaaaaatatc3468

agtatacgcagggaatacattaagcagaatcctatggctactgagaaa3516

ttattatcactgttgcctgaatatgtagttccatacatgattcacctg3564

ctagcccatgatccagattttacaagatcacaagatgttgatcag3609

cttcgtgatatcaaagagtgcctatggttcatgcttgaagtttta3654

atgacaaagaatgaaaacaatagccatgcctttatgaagaagatg3699

gcagagaacatcaagttaaccagagatgcccagtctccagatgaa3744

alagluasnilelysleuthrargaspalaglnserproaspglu

tccaagacaaatgaaaaactgtatacagtatgtgatgtggctctc3789

tgtgttataaatagtaaaagtgctttgtgcaatgcagattcacca3834

aaggacccagtcctcccaatgaaattttttacacaacctgaaaag3879

gacttctgtaacgataagagttatatttcagaagagacaagagta3924

cttctgttaacaggaaagccaaagcctgctggagtactaggtgca3969

gtaaataagcctttatcagcaacgggaaggaaaccctatgttaga4014

agcactggcactgagactggaagcaatattaatgtaaattcagag4059

serthrglythrgluthrglyserasnileasnvalasnserglu

ctgaacccttcaaccggaaatcgatcaagggaacagagttcagag4104

gcagcagaaactggagttagtgaaaatgaagagaaccctgtgagg4149

attatttcagtcacacctgtaaagaatattgacccagtaaagaat4194

aaggaaattaattctgatcaggctacccagggcaacatcagcagt4239

gaccgaggaaagaaaagaacagtaacagcagctggtgcagagaat4284

aspargglylyslysargthrvalthralaalaglyalagluasn

atccaacaaaaaacagatgagaaagtagatgaatcgggacctccc4329

gccccttccaaacccaggagaggacgtcgacccaagtctgaatct4374

cagggcaatgctaccaaaaatgatgatctaaataaacctattaac4419

glnglyasnalathrlysasnaspaspleuasnlysproileasn

aagggaaggaagagagctgcagtgggtcaggagagccctgggggt4464

lysglyarglysargalaalavalglyglngluserproglygly

ttggaagcaggtaatgccaaagcacccaaactgcaagatttagcc4509

leuglualaglyasnalalysalaprolysleuglnaspleuala

aaaaaggcagcaccagcagaaagacaaattgacttacaaaggtaa4554

aaatgcatttgcaaagggagaaaatgaaggccaaacagaagcaggctccagcttctgcaa4614

aaacttggattcacaaatgtccctgaacagaaaatgaagctcacttcagaacacacactc4674

tctgccttgaaaactaaagagactattacttccttttcacatgaccacaagtcctctgat4734

ggaaatgtacagcagaaactcttgagagagaggctaaaagcaactctgttctcccccttc4794

ccctagacttttcttacgaaaagtcaataattaagcaaattgcttaacacttggttccag4854

ttcctgcctatctggagtttaaatgcgtaatacaccattaatttccacgctgcagttttt4914

attttaaagaaagtaacaagatgtctttacactgacactgaaaattcatccattttagag4974

ccaggaattcccatgttacacaggaaaaaatagaagtctactgaattaattttttaaaag5034

aaaagagatcagattaaatatttctttgtttttccttttggaaacttttatgtataattc5094

tttctgcctgcctacttttctgcaaaaatgagatgtacagatttcggttccctgctatga5154

aaagtgatgtggtagcaattttataaatgttgctttctgatttttatcagagtgagaaaa5214

ttaaaattattgatttgcaagtagtaaacagttcatattttgatttcccctcattttagt5274

ttaatataatttgcaataaatgtacatattgttgtttgtttcataaagcatatcacttta5334

aaatggtttttactcctgtgattatgttggaatatttggaattttaaaggagtaaagact5394

gtccagcatttggttttataatgtttgtcaccagatttttattaatgtaaaaaaaatcaa5454

tttttaaaaaatagttggactttggcagcttttaaggaaagttggaggtgttttaggatt5514

gctatcaattttcagcattgtgctatttggaaataagtgttttgcttttgtctgatggtc5574

tgggctcatttttatgtttattttagaaaactgttgcatcaatatattatgtttcttggc5634

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tgcataaaataaatgcttctagatgtcatggcagtctttttaatctttttatcatatgct5754

ttcttgtgaattttttcatgttaaagagctaaagtcataacatgattacagtcaactctc5814

cattatctatataaaatagtgactaagcctcaggtttttaattttgtgataacaaaataa5874

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gttctatcctgcccccactgtccactgtagggtcatccgcaaagccctagcagaatgtgc5994

tcactccatttccttacacgtttctagcatgggtcagaggaaacaacatttgtgttataa6054

cttcgtcttgataggctgtagtgtacatgggatgtaaaacaaacaagtgtatcaaaggtg6114

gatgattctgttagagtgaagtttgagagtaaatgtcacttacgtttctcatagataatc6174

aagagttggctgtgtattgactgaaagatgggtaattattttaaatatgcatttacacac6234

atttaggtatcagaagatgcttagggaacaatggataccaatgatagaaaatgatacctt6294

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taaaatattgcctccaacatgctgaaaaagagtatctatgcataagtatcagagaagtcc6414

ctcaagcaatcagtaggtgtgttctatttagagagagtttaaagttctcttagcatcaga6474

caacttgattcctaaggtttccagtgtgtcaccaacaaaaagtgcattgatagggacctt6534

tgtctcttcctccctttgattaattgcccggcatcacagtttactagattaccaagtgtt6594

acatcatattaaataaaatgtagcagaaccatctgcatcaatatattcctgtttagattt6654

ttgcaggagagaagttaaaaggatttgctccttgtatgatgtaagtggcccaccccaatt6714

ttgtaacatgatgcaagtgtctggcactaagggaagcaagagtagggttgtggaaagacc6774

aagctgatggggagggacttgtttacgggaatttttttagttttccttttcaaaggaaaa6834

cattaaaatcccttaggaatttggtattcacatctcagagaactacaacacaaaagtgca6894

gacttatatttgagaattaatgttaaccctttgtgtctagtttgaagcttcttgtatttg6954

tctaaaacaacaagccagaattttgtatctcctttgataaaaagtgtgtataatgtaaag7014

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