本申请要求由tarekfahmy,jungseoklee和donginkim于2015年9月4日提交的名称为“靶向胰腺和结肠的聚合胆汁酸纳米组合物(polymericbileacidnanocompositionstargetingthepancreasandcolon)”的u.s.s.n.62/214,648的优先权。
本发明大体上涉及聚合胆汁酸纳米组合物，其经口施用以将药剂靶向递送至胰腺、肝脏和结肠。
本发明是根据由国家科学基金会授予tarekfahmey的协议0747577和国立卫生研究院授予的ai056363在政府支持下进行的。政府享有本发明的某些权利。
背景技术：
由于胃肠道中存在许多障碍，肽和药物的口服递送是药物递送的最大挑战之一。这些障碍包括：(1)胃中的酸度和消化酶的存在，其被优化以降解许多分子；(2)由于上皮内层的紧密连接而导致肠腔对治疗剂的低吸收；(3)许多药物在上皮内层的失活或挤出；和(4)肠内膜暴露于毒性水平的药物导致剂量限制性副作用(samstein等人,biomaterials,29:703-708(2008))。这些障碍显著降低了口服的药物和肽的生物利用度，同时限制了最大可耐受剂量，从而迫使静脉内施用治疗剂。然而，口服递送仍然是最具吸引力的药物递送途径，因为它的简易性和方便性，导致患者生活质量的改善和管理成本的降低。
然而，微粒的吸收效率通常非常低，口服后仅吸收1％的估计值。另外，plga颗粒通过酸催化的酯水解而降解，因此在胃的低ph下释放其大部分内含物。
由于胃固有的苛刻的生物化学环境，特别是强酸性ph和蛋白水解酶的存在，使许多治疗剂降解并使其失活，所以口服施用后活性剂和/或成像剂靶向递送至内部器官仍然是一个挑战。仍然需要改进的口服递送系统，其增加靶器官对口服递送药物的生物利用度，优选由通常被认为是安全且不需要昂贵制造的材料形成的那些递送系统，并且其广泛适用于没有使用靶向剂的递送。
因此，本发明的一个目的是提供一种高效的口服递送系统，其在不使用靶向剂的情况下将活性剂和/或成像剂递送至内脏器官，特别是胰腺和结肠。
本发明的另一个目的是提供制造高效口服递送系统的方法。
本发明的另一个目的是提供使用高效口服递送系统的方法。
本发明的另一个目的是提供由如肝脏和脾脏的器官选择性吸收的制剂。
本发明的另一个目的是提供用于诱导耐受性的制剂，特别是可以口服施用的制剂，甚至随后显示肝脏和脾脏的选择性吸收的制剂。
技术实现要素：
本文描述了含有聚(胆汁酸)(pba)聚合物的纳米颗粒的药物组合物，以及其制备和使用方法。pba纳米颗粒通常由聚合胆汁酸链形成并且不包含其它聚合物或聚合物的掺合物。pba纳米颗粒可以包封一种或多种药剂。药物组合物可以含有赋形剂，包括但不限于乳化剂、表面活性剂、悬浮剂、抗氧化剂、螯合剂、湿润剂和防腐剂。
通常，pba纳米颗粒由分子量为500da至50,000da的pba聚合物形成。纳米颗粒的尺寸在1和1000nm之间，优选在60和600nm之间，更优选在100和400nm之间。
pba纳米颗粒不必包含靶向剂(部分)，因为它们在口服施用后在不存在靶向部分的情况下优先定位于胰腺、肝脏或结肠。因此，pba纳米颗粒被目标组织如胰腺、肝脏或结肠选择性吸收，而不需要针对这些组织的靶向部分。然而，可能需要包含靶向部分以靶向特定细胞类型，如树突细胞，其存在于表现出选择性或增强吸收的组织中。例如，在纳米颗粒用于诱导耐受性的情况下，pba纳米颗粒包含如雷帕霉素(rapamycin)和有待诱导耐受性的抗原的药剂，并且pba纳米颗粒已经结合了特异性针对树突细胞的靶向分子。
通常，纳米颗粒包封一种或多种治疗剂、预防剂、诊断剂和/或成像剂。该制剂提供了口服递送通常仅通过注射施用的许多药剂的手段。在一些实施例中，所述药剂是用于治疗1型糖尿病(t1d)、2型糖尿病(t2d)的治疗剂。在其它实施例中，所述药剂是用于抑制或消除胰腺、肝脏或结肠中的炎症，例如炎症性肠病(ibd)中的炎症的治疗剂。在其它实施例中，所述药剂是用于抑制或治疗胰腺、肝脏或结肠肿瘤的治疗剂。在另一个实施例中，所述药剂是免疫调节剂，如用于诱导耐受性的雷帕霉素、tgf-β、雷帕霉素(类似物包括依维莫司(everolimus)、地磷莫司(ridaforolimus)、雷莫西莫司(remsirolimus)、优米莫司(umirolimus)、佐他莫司(zotarolimus))、视黄酸、tlr激动剂、环孢霉素(cyclosporin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、类固醇、硫唑嘌呤和他克莫司(tacrolimus)或用于引起免疫刺激的佐剂如cpg引起，其与抗原组合。治疗剂的任何组合可以被包封，任选地与成像剂组合。
口服药物组合物后，非靶向pba纳米颗粒通常比由聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)形成的非靶向纳米颗粒更有效地将药剂递送至靶组织。例如，当与由相同数量的包封相同量的药剂的口服递送的非靶向plga纳米颗粒递送至胰腺、肝脏或结肠的相同药剂的量相比时，口服递送的pba纳米颗粒可以将至少两倍量的一种或多种药剂递送至这些器官。当与以游离形式或包封在plga纳米颗粒中的相同剂量口服递送的相同药物的生物利用度相比时，pba纳米颗粒增加口服递送药物在胰腺、肝脏和结肠中的生物利用度。
已经开发了使用自组装和聚集胆汁酸制备np的方法。制备胆汁酸组装体的两种方法包括制造支化聚合胆汁酸单元(与线性链相反)，并通过客体/主体相互作用在与这种支化结构单元形成的空腔中进行封装；和通过氟化胆汁酸单元的超分子自组装。氟化引入了“疏氟效应”。这与疏水性或亲水性相互作用明显不同，并且导致自组装成复杂的较大结构而不需要特殊配制。
预防、抑制或治疗病症、疾病或病况的一种或多种症状的方法可包括向有需要的受试者施用含有包封一种或多种药剂的pba纳米颗粒的药物组合物的口服剂量单位。这些药物组合物可以被递送至靶组织，如胰腺、肝脏或结肠，或细胞，如树突细胞；其中一种或多种药剂被释放。在优选实施例中，所述方法涉及预防、抑制或治疗1型或2型糖尿病(“t1d”、“t2d”)、肠易激疾病(“ibd”)、胰腺炎、肝炎、结肠炎和胰腺、肝脏或结肠肿瘤的症状。
所述制剂还可以用作针对蛋白质、小分子、糖、核酸或其组合的口服疫苗，或用于诱导对一种或多种抗原如自身免疫抗原(例如糖尿病、狼疮、重症肌无力、多发性硬化症、牛皮癣、痛风)、过敏原抗原(例如食物、昆虫、药物)的耐受性。
实例证明蛋白质如胰岛素的有效口服药物递送。口服给药的可溶性胰岛素(相同的频率和途径)具有极小的效果。以聚丙交酯-共-乙交酯颗粒(“plga”)施用的胰岛素没有效果。在pudca中的胰岛素是糖水平保持在糖尿病线以下持续21天的唯一组(即治愈性)。空白pudca(无胰岛素)会导致血糖开始下降，但随后上升。这部分是因为胆汁酸具有固有的免疫抑制、消炎作用。
实例显示i型糖尿病的治疗或治愈。图5d和5e显示负载抗原(胰岛素)的胆汁酸颗粒(聚熊脱氧胆酸)(“pudca”)的口服施用。颗粒在糖尿病动物中口服施用7次(每天一次，持续一周)，并在21天内监测血糖水平。在对照盐水组(pbs)中，血糖水平回升超过250mg/dl)，即糖尿病范围。图5e确定了糖尿病小鼠的存活。图5g-j建立了对毒性细胞(图5g)、调节性细胞(5h)、动物安乐死后刺激的细胞的ifn释放(5j)以及已经用pudca和卵清蛋白作为抗原处理的细胞的抗原特异性ifn释放的作用机制。图5j显示了耐受性的诱导。
总之，实例证明了诱导两种不同抗原(胰岛素)(图5d-h)和卵清蛋白(图5j)的耐受性。图4显示在环磷酰胺诱导的糖尿病中负载雷帕霉素的pudca的免疫抑制作用。
在其它实施例中，使用药物组合物的方法可以包括单独或与疗法组合对作为整体的靶器官或靶器官内的不同微环境(如炎症袋、渗漏的血管结构或肿瘤)进行非侵入性成像的方法。
附图说明
图1是显示聚(胆汁酸)(pba)纳米颗粒的尺寸分布作为强度(％)对直径(nm)的直方图。
图3a和3b是条形图，其显示如参照图2所述，当在具有由plga(l)、聚(胆酸)(c)、聚(石胆酸)(lc)、聚(脱氧胆酸)(dc)、聚(鹅脱氧胆酸)(cdc)或聚(熊脱氧胆酸)(udc)形成的纳米颗粒的培养物中培育24小时时，caco-2、巨噬细胞(图3a)和nih-3t3(图3b)细胞活力(％)。
图4a是条形图，其显示在口服施用由plga(l)、聚(胆酸)(c)、聚(石胆酸)(lc)、聚(脱氧胆酸)(dc)、聚(鹅脱氧胆酸)(cdc)或聚(熊脱氧胆酸)(udc)形成的负载dir的纳米颗粒后4小时，每克胃、大肠或小肠组织的荧光强度。以5mg/ml的浓度施用300μl体积的纳米颗粒。图4b是条形图，其显示在口服施用5mg/ml由plga(2)、聚(胆酸)(pca，3)、聚(石胆酸)(plca，4)、聚(脱氧胆酸)(pdca，5)、聚(鹅脱氧胆酸)(pcdca，6)或聚(熊脱氧胆酸)(pudca，7)形成的纳米颗粒或游离dir染料(1)后四小时，胰腺、肝脏、肺、脾脏、肾脏和心脏的荧光强度。图4c是以每克胰腺、肝脏、肺、脾脏、肾脏和心脏标准化的图4b中数据的条形图。图4d是显示经口管饲后4小时pbanp在器官中的生物分布(％初始剂量/克组织)的条形图。图4e是显示取决于颗粒组成的np在胰腺中的吸收动力学(％初始剂量/克胰腺(口服))的条形图。图4f是显示负载香豆素6的np的胰腺吸收(胰腺中的香豆素6强度(×107))的条形图。
图5a是条形图，其显示在经口管饲游离dir染料或由plga、plga和pudca掺合物(50:50)或单独的pudca形成的负载dir的纳米颗粒后4、8、12和24小时后每克胰腺的荧光强度。图5b是显示在口服施用在pbs中、在中或负载在plga或pudca纳米颗粒中的香豆素6染料后的荧光强度的条形图。图5c是显示在口服施用plga或pudca纳米颗粒后四小时胰腺、肝脏、肺、脾脏、肾脏和心脏的荧光强度的堆叠条形图。图5d显示肠道吸收后器官中累积的np吸收。图5e是显示在口服施用后四小时负载dir的plga和pudca纳米颗粒的百分比生物分布的饼形图。尽管两种聚合物颗粒之间的生物分布没有变化，但是图4c和5a中的数据表明pudca纳米颗粒比plga纳米颗粒向胰腺递送的染料量多至少3.5倍。图5f是通过总检测荧光的百分比显示np的生物分布的饼形图。
图9a是显示活化(cd44+)cd8细胞百分比的条形图，图9b显示了处理后胰腺淋巴结中cd4+cd25+foxp3+treg的百分比。图9c显示了直接用pudcanp处理并用抗cd3和抗cd28刺激的cd4+t细胞的ifn-γ产量，图9d代表了与经lps和卵清蛋白刺激的用pudca处理的dc共培养后的ot-iicd4+t细胞。图9e是条形图，其显示由用抗cd28和抗cd3抗体刺激并与pudcanp培育3天以测量il-2的纯化的cd4+t细胞(c57bl/6，1.0·105个细胞/孔，96孔板)分泌的il-2的浓度。图9f是显示由bmdc分泌的il-2浓度的条形图。将骨髓源性树突细胞(bmdc)(2.5·104)用pudcanp预处理24小时，洗涤，然后用lps(10ng/ml)和卵清蛋白(ova，20μg/ml)刺激24小时，然后与ova特异性ot-iicd4+t细胞(50·103)共培养3天，随后通过elisa定量il-2(图9g、9h和9i)。使用lps和ova刺激bmdc(1.0·105个细胞/孔)24小时。然后洗涤细胞并用pudca处理3天，然后对bmdc的表面标记物(mhcii类、cd86和cd40)进行染色以用于流式细胞术。用pudcanp处理不影响il-2产生和dc表面标记物表达。
具体实施方式
i.定义.
如本文所用，术语“纳米颗粒”通常是指具有约10nm直至但不包括约1000nm，优选约60nm至约450nm的直径的颗粒。颗粒可以具有任何形状。典型地，纳米颗粒是球形的，并且尺寸呈现为以nm测量的直径。
如本文所用，术语“包封的”是指包封在纳米颗粒的聚合物基质内，由纳米颗粒的聚合物基质包围和/或分散遍及纳米颗粒的聚合物基质的药剂，例如治疗剂和/或成像剂。可选地或另外地，药剂可以通过疏水性相互作用、电荷相互作用、范德华力等与聚合物基质缔合。
如本文所用，术语“非靶向的”是指由聚合物(如pba或plga)形成的没有额外对特定细胞类型或器官具有增加的亲和力的要素(例如靶向部分)的纳米颗粒。
如本文所用，术语“靶向部分”是指任何分子，如抗体、配体、受体结合部分或其活性片段，或激动剂、拮抗剂或组织或细胞特异性靶向分子，其使纳米颗粒附着到靶器官中的细胞。
如本文所用，术语“活性剂”或“生物活性剂”在本文中可互换使用，是指诱导期望的药理学和/或生理学效果的化学或生物学化合物，其中所述效果可以是预防性的、治疗性的和/或诊断性的。所述术语还涵盖活性剂的药学上可接受的药理活性衍生物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物和类似物。
如本文所用，术语“赋形剂”或“药学上可接受的赋形剂”是指添加到组合物中以进一步促进组合物的施用的药理学惰性物质。
如本文所用，“口服施用”是指通过口服途径将所公开的组合物递送至受试者。口服施用可以通过经口管饲或通过吞服液体或固体形式的组合物来实现。口服施用组合物的液体形式可以是溶液、胶囊或凝胶的形式。口服施用组合物的固体形式包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。
如本文所用，术语“治疗有效量”意指当施用于罹患或易患疾病、病症和/或病况的受试者时足以对疾病、病症和/或病况进行治疗、缓解、改善、减轻症状、预防、延缓发作、抑制进展、降低严重程度及/或降低发病率的治疗剂、预防剂和/或诊断剂的量。
如本文所用，“耐受性”意指免疫系统无法对给定抗原产生适应性(t或b介导)应答。
如此处所用，“致耐受性”意指刺激或增加耐受性的条件或能力。
如本文所用，“treg”包括赋予抑制的任何t细胞。因此，该术语涵盖了传统的cd4、foxp3+treg以及不表达foxp3但可以通过分泌il-10(tr1细胞)等其它信号来调节的其它cd4细胞，和同样被鉴定出来的cd8treg(foxp3+和-)。
如本文所用，术语“预防(prevention)”或“预防(preventing)”是指将组合物施用于处于由疾病或病症引起的一种或多种症状的风险下或具有易患由疾病或病症引起的一种或多种症状的倾向的受试者或系统，以引起疾病或病症的特定症状的停止、疾病或病症的一种或多种症状的减少或预防、疾病或病症的严重程度的减轻、疾病或病症的完全消除、疾病或病症的发展或进展的稳定或延缓。
ii.组合物.
本文所述的组合物包括由聚(胆汁酸)聚合物形成的纳米颗粒，其具有掺入其中或其上的治疗剂、预防剂和/或诊断剂，以及任选的药学上可接受的赋形剂。
a.聚合物
通常，适用于形成聚(胆汁酸)聚合物的胆汁酸单体由式i定义：
其中：
r1、r2和r3独立地是氢或羟基，和
x是低ph(2-5)下的羟基，其在ph高于5.5时去质子化。
在位置x处完全质子化的羟基使单体不溶于水，并且质子的损失改善了单体的水溶性。
胆汁酸单体胆酸(ca)的结构显示在式ii中：
胆汁酸单体石胆酸(lca)的结构显示在式iii中：
胆汁酸单体脱氧胆酸(dca)的结构显示在式iv中：
胆汁酸单体鹅脱氧胆酸(cdca)的结构显示在式v中：
胆汁酸单体熊脱氧胆酸(udca)的结构显示在式vi中：
其它合适的胆汁酸包括但不限于甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、石胆酸、牛磺石胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、牛磺熊脱氧胆酸、甘氨石胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸，以及3-α-7-α-12-α-22-ξ-四羟基-5-β-胆甾-26-烯酸(四羟基甾胆酸)与3-α-12α-22ξ-三羟基-5-β-胆甾-26-烯酸的牛磺酸缀合物。
上面列出的单体被酯化以产生分子量在500和50,000道尔顿之间的聚(胆汁酸)(pba)聚合物。可以使用二异丙基碳化二亚胺(dic)和二甲基氨基吡啶与对甲苯磺酸(dmap/ptsa)的1:1盐的混合物，在温和的反应条件下进行胆汁酸的室温聚合，并且没有显著交联。碳化二亚胺活化导致在碳3和线性聚合物链上优先酯化。应用于udca，聚合的udca可以由式vii定义：
其中n是范围在2-600之间的数值，对应于在1000-240,000范围内的聚合物mw平均值。
支化度可以从第0代(无支化)到更高的无限代数变化。
聚合物可以由相同的单体形成，如udca，形成聚(udca)或pudca。在其它实施例中，聚合物可以由胆汁酸聚合物的混合物形成，形成涂覆聚合物胆汁酸核心的共聚物或单体。在这些实施例中，单体或聚合物可以任何组合并且以任何比例混合，形成分子量在800和250000道尔顿之间的胆汁酸聚合物的聚合物掺合物。典型地，聚合物是线性的，但可以使用聚合物链的其它结构，如支化或叉状或树枝状的。聚胆汁酸树枝状聚合物(例如树枝状pudca)将具有类似于线性链对应物的ph刺激响应。该树突状系统在生理ph或ph高于6.0时会处于膨胀或开放状态。因此，通过与树枝状聚合物非共价缔合或通过截留在支化系统中形成的间隙腔中可以容易地负载药物。低ph会使系统收缩，保护包封物和/或使其缓慢释放。这样，树枝状胆汁酸聚合物本身可以充当纳米颗粒，而无需与线性聚合物一起使用的配制条件。
在一些实施例中，单体或形成的聚合物链可以包括具有一种或多种放射性核素或光学(生物发光、化学荧光、荧光或其它高消光系数或高量子产率光学示踪剂的部分。类似地，非侵入性造影剂，如重金属(钆，镝等)类别中的t1mr剂或t2造影剂(氧化铁、氧化锰等)，用于x射线衰减(ct)和其它模态的碘化剂。这些系统响应7至2范围内ph变化的固有能力对于将治疗剂递送至细胞内的低ph内吞区室和/或以低ph微环境或肿瘤周围环境为特征的炎症部位具有显著影响。这些实施例的聚合物链可以用于形成可追踪的pba纳米颗粒，消除了包封成像/示踪剂的需要，并且由于成像剂局部保留(探针限制)在该区域中而增强了成像模态。
胆汁酸的水溶性随着ph的增加呈指数增长(hoffman等人,j.lipidres.,33:617-626(1992))。pba的聚合物链和由其制备的纳米颗粒也在低ph下聚集并且随着ph增加到5.5以上而变得越来越可溶解/分散。这些聚合物和纳米颗粒特别适用于口服药物递送，因为它们可以保护用纳米颗粒包封的药剂免受胃的破坏性环境。随着聚合物开始溶解释放药剂，药剂可以在肠和靶器官的中性ph下安全释放。
纳米颗粒可以具有小于600nm但大于10nm，更优选在60和450nm之间，或大于50nm但小于500nm的平均几何直径。在一些实施例中，纳米颗粒群的平均几何直径为约60nm、75nm、100nm、125nm、150nm、175nm、200nm、225nm、250nm、275nm、300nm、325nm、350nm、375nm、400nm、425nm、450nm或475nm。在一些实施例中，平均几何直径在100-400nm、100-300nm、100-250nm或100-200nm之间。在一些实施例中，平均几何直径在60-400nm、60-350nm、60-300nm、60-250nm或60-200nm之间。在一些实施例中，平均几何直径在75和250nm之间。在一些实施例中，纳米颗粒群的30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的纳米颗粒具有50至500nm的直径。
下文实例1中的纳米颗粒的示例性结构特性和负载能力呈现在表1中。
b.将被包封的治疗剂、预防剂和诊断剂.
pba纳米颗粒可以包封一种或多种治疗性、营养性、诊断性和预防性化合物。这些可以是蛋白质、肽、碳水化合物、多糖、核酸分子、有机分子和低分子量无机化合物。
治疗剂和预防剂包括抗生素、抗病毒剂、抗寄生虫剂(蠕虫、原生动物)、抗癌剂(本文称为“化学治疗剂”，包括细胞毒性药物，如多柔比星(doxorubicin)、环孢霉素、丝裂霉素c(mitomycinc)、顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)、bcnu、5fu、甲氨蝶呤、阿霉素(adriamycin)、喜树碱(camptothecin)和紫杉醇(taxol))和抗增殖剂、抗体及其生物活性片段(包括人源化、单链和嵌合抗体)、抗原和疫苗制剂、激素和其它肽药物、细胞因子、免疫调节剂(抑制性或刺激性)和消炎剂。分子量为2000道尔顿或更小的小分子包括消炎剂，如类固醇(包括甲基泼尼松(methylprednisone)、地塞米松(dexamethasone))、非类固醇消炎剂(如cox-2抑制剂)、类固醇消炎剂、金化合物消炎剂、抗血管生成剂、水杨酸盐消炎剂、雷珠单抗(ranibizumab)、米诺环素(minocycline)、抗vegf剂(包括阿柏西普(aflibercept)和雷帕霉素)。
与许多其它递送系统不同，制剂还可以用于施用蛋白质，如胰岛素和胰岛素类似物以及其它小蛋白质。如实例所证明，胰岛素可以有效地经口递送以使糖尿病动物的血糖水平正常化。
示例性诊断材料包括顺磁性分子、荧光化合物、磁性分子和放射性核素。
c.致耐受性组合物
提供了用于将致耐受性(耐受性)抗原、免疫抑制剂(例如雷帕霉素)或优选其组合递送至肝脏中的树突细胞或抗原呈递细胞(apc)的组合物。在一些实施例中，共同递送致耐受性抗原和免疫抑制剂，更优选共同负载到同一颗粒中以同时共同递送至同一细胞。然后，apc可变成致耐受性的并迁移到外周淋巴的淋巴结，据信它们在此处活化，诱导treg如cd4+foxp3+细胞的增殖，诱导所述细胞的分化或其组合。然后这些treg可以抑制特异性针对致耐受性抗原的b细胞的活化和抗体产生。理想的是抗原和免疫抑制药物在空间上定位于相同的肝树突细胞或肝内皮细胞以启动耐受性程序。因此，在最优选的实施例中，抗原和免疫抑制药物被负载、分散、缀合或以其它方式呈现在同一颗粒上或同一颗粒中。免疫抑制剂与抗原在同一颗粒中共同递送可以具有两种作用：1)将抗原和药物剂量集中在相同的细胞中，和2)确保相同的抗原呈递细胞被抑制。该策略可以减少或防止广泛的免疫抑制或抗原特异性免疫原性。
免疫抑制剂与抗原一起递送至相同的抗原呈递细胞以改善药物的免疫抑制作用(例如耐受性诱导)。在一些实施例中，共同递送两种免疫抑制剂，如霉酚酸(mycophenolicacid)和雷帕霉素。优选地，颗粒积聚在肝中。在一些实施例中，颗粒包含靶向部分，例如增加(或进一步增加)颗粒在肝中的积聚或将颗粒引导至特定细胞(如肝中的树突细胞)的靶向部分。
在替代实施例中，抗原和免疫抑制药物被负载、分散、缀合或以其它方式呈现在单独的颗粒上或单独的颗粒中。
a.抗原
颗粒可以包含一种或多种抗原，优选致耐受性抗原。基于期望的治疗结果和所治疗的疾病、病症或病况来选择合适的抗原。示例性抗原是本领域已知的。参见例如美国公开申请号2014/0356384，其讨论：
致耐受性抗原可以是自体抗原，针对该自体抗原，患者已出现自身免疫应答或可能出现自身免疫应答。实例是胰岛素原(糖尿病)、胶原(类风湿性关节炎)、髓磷脂碱性蛋白(多发性硬化症)。
例如，1型糖尿病(t1d)是一种自身免疫疾病，其中识别胰岛蛋白的t细胞已经被破坏而不受免疫调节并且发信号通知免疫系统破坏胰腺组织。已经发现了许多作为这种致糖尿病t细胞靶标的蛋白质抗原，包括胰岛素、gad65、嗜铬粒蛋白-a等等。在治疗或预防t1d时，诱导针对限定的致糖尿病抗原的抗原特异性免疫耐受以使致糖尿病t细胞克隆功能性失活或缺失将是有用的。
对于作为人类自身免疫蛋白质的许多不同蛋白质，可以实现对自身免疫疾病的发作或进展的耐受性和/或延迟，该术语是指各种自身免疫疾病，其中引起疾病的一种或多种蛋白质是已知的或可以通过常规测试确立。
致耐受性抗原可以是外来抗原，针对该外来抗原患者已经产生不需要的免疫应答。实例是食物抗原。实施例包括测试患者以鉴定外来抗原，产生包含该抗原的分子融合物并治疗患者以对抗原或食物产生免疫耐受性。提供了这样的食物和/或抗原的实例。实例来自花生：伴花生球蛋白(arah1)、过敏原ii(arah2)、花生凝集素、蓝豆蛋白(arah6)；来自苹果：31kda主要过敏原/疾病抗性蛋白质同源物(mald2)、脂质转移蛋白前体(mald3)、主要过敏原mald1.03d(mald1)；来自乳汁：α-乳白蛋白(ala)、乳铁传递蛋白；来自猕猴桃：猕猴桃蛋白酶(actc1、actd1)、植物半胱氨酸蛋白酶抑素、索马甜样蛋白(actd2)、kiwellin(actd5)；来自芥子：2s白蛋白(sina1)、11s球蛋白(sina2)、脂质转移蛋白(sina3)、肌动蛋白抑制蛋白(sina4)；来自芹菜：肌动蛋白抑制蛋白(apig4)、高分子量糖蛋白(apig5)；来自虾：pena1过敏原(pena1)、过敏原penm2(penin2)、原肌球蛋白快速同工型；来自小麦和/或其它谷类：高分子量麦谷蛋白、低分子量麦谷蛋白，α-和γ-麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白、黑麦醇溶蛋白、燕麦蛋白；来自草莓：主要草莓过敏fraa1-e(fraa1)，来自香蕉：肌动蛋白抑制蛋白(musxp1)。
b.免疫抑制剂
其它免疫抑制剂包括例如针对其它免疫细胞表面标记物(例如cd40)或针对细胞因子的抗体、其它融合蛋白(例如ctla4ig)或其它免疫抑制药物(例如环孢菌素a、fk506样化合物、雷帕霉素化合物或类固醇)。
如本文所用，术语“雷帕霉素化合物”包括中性三环化合物雷帕霉素、雷帕霉素衍生物、雷帕霉素类似物和被认为与雷帕霉素具有相同作用机制(例如抑制细胞因子功能)的其它大环内酯化合物。语言“雷帕霉素化合物”包括与雷帕霉素具有结构相似性的化合物，例如具有类似大环结构的化合物，其已被修饰以增强其治疗效力。示例性雷帕霉素化合物以及其中施用了雷帕霉素的其它方法在本领域中是已知的(参见例如wo95/22972，wo95/16691，wo95/04738，美国专利号6,015,809；5,989,591；5,567,709；5,559,112；5,530,006；5,484,790；5,385,908；5,202,332；5,162,333；5,780,462；5,120,727)。
雷帕霉素类似物包括例如依维莫司、地磷莫司、雷莫西莫司、优米莫司和佐他莫司。
语言“fk506样化合物”包括fk506以及fk506衍生物和类似物，例如与fk506具有结构相似性的化合物，例如具有类似大环结构的化合物，这些化合物已被修饰以增强其治疗效力。fk506样化合物的实例包括例如在wo00/01385中描述的那些。优选地，本文使用的语言“雷帕霉素化合物”不包括fk506样化合物。
c.其它活性剂
以下是可与抗原和免疫抑制剂如雷帕霉素单独或与不含免疫抑制剂的抗原组合用于免疫调节的药剂。
在一个实施例中，免疫抑制剂是tnf-α阻断剂。在另一个实施例中，免疫抑制剂增加血清中腺苷的量，参见例如wo08/147482。在一个优选实施例中，免疫抑制剂是cd73-ig、重组cd73或增加cd73表达的另一种药剂(例如细胞因子或单克隆抗体或小分子)，参见例如wo04/084933。在另一个实施例中，免疫抑制剂是干扰素-β。
组合物可以与增加treg活性或产量的化合物组合或连续使用。示例性treg增强剂包括但不限于糖皮质激素氟替卡松(fluticasone)、沙美特罗(salmeterol)、针对il-12、ifn-γ和il-4的抗体；维生素d3和地塞米松及其组合。这些化合物可以增加或促进treg的活性，增加treg产生的细胞因子如il-10，增加treg的分化，增加treg的数量或增加treg的存活。也参见美国公开申请号2012/0276095。
也可以使用抗体、小分子和其它降低促炎性细胞因子生物活性的化合物。在一些实施例中，所述化合物降低il-1、il-6、il-8、tnf-α(肿瘤坏死因子α)、tnf-β(淋巴毒素α，lt)或其组合的生物活性。
在一个实施例中，活性剂是用于治疗自身免疫疾病如类风湿性关节炎和狼疮的治疗剂。
生物制剂中的另一个主要类别是肿瘤坏死因子(tnf)阻断剂，其抵消高水平的炎性蛋白质。依那西普(enbrel)、英夫利昔单抗(remicade)和阿达木单抗(humira)是应用最广泛的。另一个有希望的组是白介素-1(il-1)阻断剂，如阿那白滞素(kineret)。
在一些实施例中，药剂是消炎细胞因子或趋化因子，例如转化生长因子-β(tgf-β)、白介素(il)-1受体拮抗剂、il-4、il-6、il-10、il-11和il-13。il-1、肿瘤坏死因子-α和il-18的特定细胞因子受体也充当促炎性细胞因子抑制剂。消炎细胞因子和可溶性细胞因子受体的性质是本领域已知的并且在opal和depalo,chest,117(4):1162-72(2000)中进行了讨论。
视黄酸是可用作消炎剂的另外的治疗性化合物。参见例如capurso等人,self/nonself,1:4,335-340(2010)。
霉酚酸吗啉乙酯(mmf)及其活性代谢物霉酚酸(mpa)都是非常有效的免疫抑制剂。mmf已被用于治疗自身免疫性和炎症性皮肤病。lipsky,lancet,348:l1357-1359(1996)并且已经成为患有自身免疫疾病的儿童的有价值的治疗选择。filler等人,pediatricrheumatol.,8:1(2010)。霉酚酸(mpa)是一种相对较新的佐剂药物，通过抑制嘌呤的从头合成选择性抑制t和b淋巴细胞增殖。其它类固醇减量免疫抑制剂包括硫唑嘌呤、甲氨蝶呤和环磷酰胺。
mpa是霉酚酸吗啉乙酯的活性形式，其目前用作狼疮和其它自身免疫疾病治疗的人用免疫抑制剂(ginzler等人,nengljmed,353(21):2219-28(2005))。mpa对几种免疫细胞类型具有广泛的免疫抑制作用。mpa阻断鸟嘌呤核苷酸的从头合成途径。t和b细胞增殖受到mpa的急剧损害，因为这些细胞缺乏可避免从头鸟嘌呤产生受损的生物合成补救途径(jonsson等人,clinexpimmunol,124(3):486-91(2001)；quemeneur等人,jimmunol,169(5):2747-55(2002)；jonsson等人,intimmunopharmacol,3(1):31-7(2003)；和kamell等人,jimmunol,187(7):3603-12(2011)。此外，mpa可损害树突细胞的激活和刺激同种异体抗原应答的能力(mehling等人,jimmunol,165(5):2374-81(2000)；lagaraine等人,intimmunol,17(4):351-63(2005)；和wadia等人,humimmunol,70(9):692-700(2009))，并促进致耐受性树突细胞的发育(lagaraine等人,jleukocbiol,84(4):1057-64(2008))。与许多免疫抑制剂药物一样，mpa非常疏水，报道的分配系数(logp值)是3.88(elbarbry等人,jchromatogrbanalyttechnolbiomedlifesci,859(2):276-81(2007))。
免疫抑制剂可以是抑制免疫系统功能或增加对传染性疾病易感性的任何小分子。在某些实施例中，免疫抑制剂是t细胞增殖的抑制剂、b细胞增殖的抑制剂或t细胞和b细胞增殖的抑制剂。在某些实施例中，t细胞或b细胞增殖抑制剂抑制或调节鸟嘌呤单磷酸的合成。例如，免疫抑制剂可以是霉酚酸。
或者，免疫抑制剂是霉酚酸的前药，包括但不限于霉酚酸吗啉乙酯(由瑞典公司f.hoffmann-larocheltd.以商品名销售。
还可以使用免疫抑制剂的盐，例如霉酚酸的盐包括但不限于霉酚酸钠(由novartis以商品名销售。在一些实施例中，免疫抑制剂是嘌呤类似物，包括但不限于硫唑嘌呤(以各种商品名销售，包括salix的和glaxosmithkline的)或巯基嘌呤(以商品名((巯基嘌呤销售)。在一些实施例中，免疫抑制剂是抑制嘌呤(如嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂)的使用和/或合成的抗代谢物。
通常施用非类固醇消炎药(nsaid)以帮助缓解如疼痛、肿胀和僵硬等症状。最常用的nsaid是布洛芬和萘普生。缓解疾病的抗风湿药物(dmard)是减缓甚至阻止疾病进展的药剂。该组的主力是甲氨蝶呤。其它dmard包括柳氮磺吡啶(商品名azulfidine)和来氟米特(arava)。
更常用的皮质类固醇包括泼尼松龙、氢化可的松、甲基泼尼龙、地塞米松、可的松、曲安西龙和倍他米松。
d.肝脏或树突细胞靶向部分
可以使用各种技术来工程改造颗粒表面，如分子(配体)与纳米系统(聚合物或脂质)的共价连接(tosi等人,sfnneuroscisandiego(usa),1:84(2010))。
靶向颗粒的特异性程度可以通过选择具有适当亲和力和特异性的靶向分子来调节。举例来说，抗体极具特异性。这些可以是多克隆、单克隆、片段、重组或单链，其中许多是可商购的或容易使用标准技术获得的。靶向分子可以与存在于颗粒表面上的一个或多个peg链的末端缀合。
靶向分子还可以包括神经纤毛蛋白和内皮靶向分子、整联蛋白、选择素、粘附分子、细胞因子和趋化因子。
在一些实施例中，靶向部分是与抗体结合结构域组合的抗体或抗体结合结构域。抗体可以是多克隆、单克隆、线性、人源化、嵌合的或其片段。抗体可以是抗体片段，如fab、fab'、f(ab')、fv双抗体、线性抗体或单链抗体。抗体结合结构域在本领域中是已知的，并且包括例如来自金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的蛋白质如蛋白质a和蛋白质g。已知结合抗体的其它结构域在本领域中是已知的并且可以被取代。
靶向分子可以使用本领域已知的多种方法共价结合至颗粒。在优选的实施例中，通过聚乙二醇化或生物素-抗生物素蛋白桥将靶向部分连接至颗粒。
肝靶向部分是本领域已知的。参见例如美国公开申请号2014/0017329，其讨论甘草次酸(ga)、乳糖酸(la)及其组合是肝靶向剂。
表1：肝靶向受体(改编自mishra等人,见上文)
*r：受体。
在优选的实施例中，使用增强颗粒在肝脏中的积聚的靶向部分将颗粒靶向肝脏。
特别优选的靶标是dec205+。dec205+是分子量为205kda(dec205)的细胞受体(ring等人,j.immuno.,doi:l0.4049/jimmunol.1202592(11页)(2013))。它由上皮细胞和树突细胞(dc)表达并促进抗原呈递。
用于靶向dec205+的组合物是本领域已知的并且包括例如抗dec205+抗体及其片段和融合物(参见例如silva-sanchez,plosone10(4):e0124828.doi:10.1371/joumal.pone.0124828；spiering等人,jimmunol.,194(10):4804-13(2015).doi:10.4049/jimmunol.1400986.电子版2015年4月10日)。据信靶向dec205的纳米颗粒利用dec205介导的内吞作用进入靶细胞，这降低了其活化抗原特异性cd4t细胞的能力。已知通过dec205吸收抗原的dc经由mhci类交叉呈递，其可以促进小鼠自身免疫糖尿病和eae模型中的cd8t细胞缺失耐受性。
在其它实施例中，另一种c型凝集素受体被靶向部分靶向。在一个具体的实例中，c型凝集素是clec9a。
在一些实施例中，调节靶向配体的密度以调节载体的耐受诱导作用。
d.药物组合物
纳米颗粒可以配制成液体或固体形式，以单剂量或多剂量单位口服施用。
1.剂量单位
在某些实施例中，剂量单位含有pba纳米颗粒，其包封的活性剂和/或成像剂的量为每天每kg受试者体重约0.001mg至约100mg、约0.01mg至约50mg、约0.1mg至约40mg、约0.5mg至约30mg、约0.01mg至约10mg、约0.1mg至约10mg或约1mg至约25mg，一天一次或多次，以获得所需的治疗效果。期望的剂量可以一天三次、一天两次、一天一次、每隔一天、每三天、每周、每两周、每三周或每四周递送。在某些实施例中，可以使用多次施用(例如二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或更多次施用)递送期望的剂量。
2.赋形剂
赋形剂和/或载剂可以基于待施用的剂型、递送的活性剂等来选择。合适的赋形剂包括表面活性剂、乳化剂、乳化稳定剂、抗氧化剂、润肤剂、湿润剂、螯合剂、悬浮剂、增稠剂、闭塞剂、防腐剂、稳定剂、ph调节剂、增溶剂、溶剂、调味剂、着色剂和其它赋形剂。如本文所用，“赋形剂”不包括任何胆汁酸或其聚合物。
合适的乳化剂包括但不限于直链或支链脂肪酸、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、丙二醇硬脂酸酯、硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、脂肪醇、聚环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物及其组合。
合适的表面活性剂包括但不限于阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂。
合适的悬浮剂包括但不限于海藻酸、膨润土、卡波姆、羧甲基纤维素及其盐、胶体燕麦片、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、微晶纤维素、胶体二氧化硅、糊精、明胶、瓜尔豆胶、黄原胶、高岭土、硅酸镁铝、麦芽糖醇、甘油三酯、甲基纤维素、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸丙二醇酯、海藻酸钠、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、黄蓍胶及其组合。
合适的抗氧化剂包括但不限于丁羟甲苯、α-生育酚、抗坏血酸、富马酸、苹果酸、丁羟茴醚、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、焦亚硫酸钠、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸乙酸酯、抗坏血酸磷酸酯、维生素a、叶酸酸、黄酮或类黄酮、组氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、类胡萝卜素、胡萝卜素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、尿酸、其药学上可接受的盐、其衍生物及其组合。
合适的螯合剂包括但不限于edta及其组合。
合适的湿润剂包括但不限于甘油、丁二醇、丙二醇、山梨糖醇、三醋精及其组合。
防腐剂可以用于防止真菌和其它微生物的生长。合适的防腐剂包括但不限于苯甲酸、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠、丙酸钠、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硫柳汞及其组合。
赋形剂可以包括悬浮剂，如无菌水、磷酸盐缓冲盐水、盐水或非水溶液如甘油。
颗粒可以在喷雾干燥或冻干后作为干粉提供。
颗粒可以被压制成片剂，然后可以用如的材料包覆以防止颗粒在通过胃之后释放。
颗粒也可以包封在硬或软凝胶中，如明胶和藻酸盐胶囊以及由bannerpharmaceuticals销售的肠溶制剂软凝胶。
颗粒也可以被调配以施用于粘膜表面，如口、鼻腔、口腔、肺部系统、直肠或阴道表面。
颗粒也可以在试剂盒中提供，其中待递送的材料与剂量单位分开提供，然后在使用前以粉末或干燥形式或在溶液中混合。待递送的药剂可以被化学或物理地截留、包封或结合至胆汁盐聚合物。
iii.制造纳米颗粒的方法.
本文所述的pba纳米颗粒可以通过多种方法制备。
1.溶剂蒸发.
在该方法中，将聚合物溶于挥发性有机溶剂如二氯甲烷中。将药物(可溶或分散成细颗粒)加入到溶液中，并将混合物悬浮在含有表面活性剂如聚(乙烯醇)的水溶液中。搅拌所得乳液直到大部分有机溶剂蒸发，留下固体纳米颗粒。所得纳米颗粒用水洗涤并在冻干机中干燥过夜。通过这种方法可以获得具有不同尺寸和形态的纳米颗粒。该方法对于相对稳定的聚合物如pba、聚酯和聚苯乙烯是有用的。
2.界面缩聚
以下列方式使用界面缩聚来包封核心材料。将一种单体和核心材料溶于溶剂中。将第二种单体溶于与第一种溶剂不混溶的第二种溶剂(通常为水溶液)中。通过在第二溶液中搅拌悬浮第一溶液来形成乳液。一旦乳液稳定，将引发剂加入到水相中，在每个乳液液滴的界面处引起界面聚合。
3.溶剂蒸发微包封
在溶剂蒸发微包封中，通常将聚合物溶于与水不混溶的有机溶剂中，并将待包封的材料以在有机溶剂中的悬浮液或溶液形式加入聚合物溶液中。通过将该悬浮液或溶液加入到剧烈搅拌水(通常含有表面活性剂，例如聚乙二醇或聚乙烯醇，以稳定乳液)的烧杯中来形成乳液。在继续搅拌的同时将有机溶剂蒸发。蒸发导致聚合物沉淀，形成含核心材料的固体纳米颗粒。
可以使用溶剂蒸发工艺将液体芯材料截留在聚合物中，如pba、pla、pla/pga共聚物或pla/pcl共聚物微胶囊中。将聚合物或共聚物以非溶剂浓度溶于溶剂和非溶剂的可混溶混合物中，该浓度恰好低于产生相分离的浓度(即浊点)。将液体核心材料加入到溶液中，同时搅拌以形成乳液并将材料分散为液滴。溶剂和非溶剂被汽化，其中溶剂以更快的速率汽化，导致聚合物或共聚物相分离并向核心材料液滴的表面迁移。然后将该相分离的溶液转移到搅拌体积的非溶剂中，使任何剩余的溶解的聚合物或共聚物沉淀，并从形成的膜中提取任何残余溶剂。结果是由具有液体材料核心的聚合物或共聚物壳组成的纳米颗粒。
在放大过程中，不溶性活性剂颗粒在聚合物溶液中的稳定化可能是关键的。通过将悬浮的活性剂颗粒稳定在分散相内，颗粒可以保持均匀分散在整个聚合物溶液以及在微包封过程中形成的所得聚合物基质中。
在溶剂去除微包封中，聚合物通常溶于与油混溶的有机溶剂中，并且待包封的材料以在有机溶剂中的悬浮液或溶液形式加入聚合物溶液中。可添加表面活性剂以改善待包封材料的分散。通过加入该悬浮液或溶液以剧烈搅拌油而形成乳液，其中油是聚合物的非溶剂并且聚合物/溶剂溶液在油中不混溶。在继续搅拌的同时，通过扩散到油相中去除有机溶剂。溶剂去除导致聚合物沉淀，形成含核心材料的固体颗粒。
4.相分离微包封
在相分离微包封中，将要包封的材料在搅拌下分散在聚合物溶液中。在继续搅拌以均匀悬浮材料的同时，将聚合物的非溶剂缓慢加入到溶液中以降低聚合物的溶解度。取决于聚合物在溶剂和非溶剂中的溶解度，聚合物或者沉淀或者相分离成富聚合物和贫聚合物相。在适当的条件下，富聚合物相中的聚合物将迁移至与连续相的界面，将核心材料用外聚合物壳包封在液滴中。
5.自发乳化
自发乳化包括通过改变温度、蒸发溶剂或添加化学交联剂来固化乳化的液体聚合物液滴。包封物和待包封材料的物理和化学性质决定了合适的包封方法。如疏水性、分子量、化学稳定性和热稳定性等因素影响包封。
6.凝聚
使用凝聚技术的各种物质的包封程序已经描述在现有技术中，例如在gb-b-929406；gb-b-929401；美国专利号3,266,987；4,794,000和4,460,563中。凝聚是一种将胶体溶液分离成两个或更多个不混溶液体层的过程(参考dowben,r.generalphysiology,harper&row,newyork,1969,第142-143页.)。通过凝聚过程，可以制备由两个或更多个相组成的并且被称为凝聚层的组合物。构成两相凝聚层系统的成分存在于两相中；然而，富胶体的相具有比贫胶体相更高的组分浓度。
7.喷雾干燥
在这种方法中，将聚合物溶于有机溶剂中。已知量的活性药物在聚合物溶液中悬浮(不溶性药物)或共溶解(可溶性药物)。然后将溶液或分散液喷雾干燥。微型喷雾干燥器(buchi)的典型工艺参数如下：聚合物浓度＝0.04g/ml，入口温度＝-24℃，出口温度＝13-15℃，抽风机设定值＝15，泵设定值＝10ml/min，喷雾流量＝600nl/h，喷嘴直径＝0.5mm。获得1-10微米范围内的微粒，其形态取决于所用聚合物的类型。
8.氟介导的超分子组装：
iv.使用方法.
这些颗粒对口服递送特别有用，并且显示由如胰腺、肝脏或结肠等靶器官增强的吸收。药物组合物可以含有包封治疗和/或诊断/成像剂的非靶向或靶向pba纳米颗粒。
口服施用可以通过经口管饲或通过吞服液体或固体形式的组合物来实现。口服施用组合物的液体形式可以是溶液或液体凝胶的形式。口服施用组合物的固体形式可以是胶囊、软和硬凝胶、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂的形式。
虽然参照口服施用进行了描述，但应该理解，通过递送至粘膜表面如口腔、鼻腔、肺、肺、直肠或阴道可以实现相同的递送。
期望的剂量可以一天一次或一天多次口服递送。例如，期望的剂量可以一天三次、一天两次、一天一次、每隔一天、每三天、每周、每两周、每三周或每四周口服递送。在某些实施例中，可以使用多次每日施用(例如二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或更多次施用)递送期望的剂量。
当ph响应有用时，pba纳米颗粒的口服施用是特别有利的。pba纳米颗粒的靶向递送和包封治疗剂的ph响应性释放使得能够用较低剂量的治疗剂进行治疗以实现与游离药物相同的功效和较低的副作用。包封的试剂被保护免受胃的苛刻酸性环境的影响，并在肠腔内释放，或在巨噬细胞、胰腺或肠道炎症部位的树突或抗原呈递细胞、肝脏、脾脏或胰腺吸收后通过胞吐作用释放。因此，pba纳米颗粒在口服施用后通过保护药剂免于在胃中降解并将药剂递送到作用部位而改善了所包封药剂的生物利用度。当与以游离形式或包封在plga纳米颗粒中的相同剂量口服递送的相同药物的生物利用度相比时，pba纳米颗粒增加口服递送药物在胰腺、肝脏和结肠中的生物利用度。
a.待治疗的病症.
预防、抑制或治疗疾病或病况的方法可以包括向有需要的受试者施用含有包封一种或多种药剂的非靶向pba纳米颗粒的药物组合物的口服剂量单位；递送有效量的一种或多种试剂，任选递送至靶向组织如胰腺、肝脏或结肠；其中药剂从pba纳米颗粒在靶组织处释放，导致预防、抑制或治疗疾病。
制剂对于治疗结肠、肝脏、脾脏、胰腺或邻近区域的肿瘤特别有用。制剂在治疗胃肠道疾病中也是非常有用的，包括溃疡、肠易激疾病(ibd)和结肠癌。制剂可用于治疗炎性疾病和自身免疫和过敏性疾病。制剂在治疗如糖尿病的疾病中也是有效的。
自身免疫和炎性疾病和病况
应理解，本文公开的组合物和方法具有广泛的应用，包括但不限于治疗自身免疫疾病、用于移植排斥的疗法、用于增强免疫抑制功能的佐剂以及涉及treg或致耐受性dc的细胞疗法。
在一些实施例中，所述组合物和方法用于治疗慢性和持续性炎症，其可以是自身免疫疾病或炎性病况的发病机理和进展的主要原因。因此，治疗炎性和自身免疫疾病和病症的方法可以包括向有需要的受试者施用有效量的颗粒制剂或其药物组合物，以减轻或改善疾病或病况的一种或多种症状。下面将更详细地讨论一些应用。
表位扩散的抑制
表位扩散是指b和t细胞免疫应答在特异性水平、从单一决定簇到自身抗原上的许多位点以及在v基因使用水平上多样化的能力(monneaux,f.等人,arthritis&rheumatism,46(6):1430-1438(2002)。表位扩散不限于全身性自身免疫疾病。已经在t细胞依赖性器官特异性疾病如人类中的iddm和多发性硬化以及eae诱导的具有多种髓鞘蛋白的实验动物中描述了它。
因此，在一些实施例中，用于抑制或减少受试者中的表位扩散的方法包括向受试者施用有效量的纳米载体。在一个优选的实施例中，颗粒制剂抑制患有多发性硬化症的个体的表位扩散。
过敏症
过敏症是免疫系统对其它无害物质发生的反应。过敏症是最常见的医学病症之一。估计有6000万美国人，或者每五个人中就有一个以上的人患有某种形式的过敏症，在世界其它大部分地区都有相似的比例。过敏症是学校缺勤的最大原因，也是工作场所生产力损失的主要原因。
过敏症是一种免疫反应。通常，免疫系统通过产生称为抗体的特定蛋白质来对外来微生物或颗粒作出响应。这些抗体能够结合到外来颗粒上的标识分子或抗原。抗体与抗原之间的这种反应引发了一系列旨在保护身体免受感染的化学反应。有时，同样的一系列反应是由无害的日常物质如花粉、粉尘和动物皮屑触发的。发生这种情况时，会对进攻物质(过敏原)产生过敏反应。
肥大细胞是过敏反应的主要参与者之一，它捕获并呈现特定类型的抗体，称为与过敏原结合的e型免疫球蛋白(ige)。肥大细胞内部是小的化学填充包装，称为颗粒。颗粒含有各种有效的化学物质，包括组胺。
免疫学家将过敏反应分为两种主要类型：立即超敏反应，主要是肥大细胞介导的并且在与过敏原接触的几分钟内发生；和由t细胞(一种白血细胞)介导并在暴露后数小时至数天发生的迟发型超敏反应。
吸入或摄入过敏原通常会引起立即超敏反应。过敏原与肥大细胞表面上的ige抗体结合，将其颗粒内容物溢出到邻近的细胞上，包括血管和神经细胞。组胺通过称为组胺受体的特殊蛋白质结合到这些其它细胞的表面。组胺与血管受体的相互作用引起渗漏增加，从而导致流体收集、肿胀和红肿增加。组胺还刺激疼痛受体，使组织更敏感和易受刺激。接触后，症状持续一到几个小时。在上呼吸道和眼睛中，立即的高敏感性反应导致流鼻涕和发痒、过敏性鼻炎典型的带血丝的眼睛。在胃肠道中，这些反应导致肠内膜的肿胀和刺激，这引起食物过敏典型的痉挛和腹泻。进入循环的过敏原可能导致荨麻疹、血管性水肿、过敏反应或特应性皮炎。
这些可以通过施用消炎剂或通过诱导对抗原的耐受性来治疗，如下文更详细地论述。
糖尿病
糖尿病是由于胰腺不能产生足够的胰岛素，或者身体细胞对所产生的胰岛素没有适当反应。有三种主要类型的糖尿病：
1型糖尿病由胰腺未能产生足够的胰岛素或活性胰岛素引起；此形式以前称为“胰岛素依赖性糖尿病”(iddm)或“青少年糖尿病”，
2型糖尿病始于胰岛素抗性，胰岛素抗性是细胞无法正确响应胰岛素的一种病况。随着疾病的进展，也可能出现胰岛素的缺乏；这种形式以前被称为“非胰岛素依赖型糖尿病”(niddm)或“成人发病型糖尿病”；而妊娠糖尿病是第三种主要形式，当没有既往糖尿病史的孕妇出现高血糖水平时就会发生妊娠糖尿病。
1型糖尿病必须通过注射胰岛素进行治疗。2型糖尿病可用含有或不含胰岛素的药品治疗。
妊娠糖尿病通常会在宝宝出生后消失。
患有1型糖尿病的人需要胰岛素治疗才能生存。许多患有2型糖尿病或妊娠糖尿病的人也需要胰岛素治疗。用于治疗t2d的药品包括超过20种类型的可注射胰岛素和口服施用药物，如氯茴苯达酸类(meglitinides)、磺酰脲类、二甲双胍(metformin)、卡格列净(canagliflozin)、达格列净(dapagliflozin)、噻唑烷二酮类、吡格列酮(pioglitazone)、罗格列酮(rosiglitazone)、阿卡波糖(acarbose)、普兰林肽(pramlintide)、艾塞那肽(exenatide)、利拉鲁肽(liraglutide)、长效艾塞那肽、阿必鲁肽(albiglutide)、度拉糖肽(dulaglutide)和二肽基肽酶-4(dpp-iv)抑制剂(西格列汀(sitagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、利格列汀(linagliptin))。这些药剂统称为“抗糖尿病药”。
口服施用pba组合物可以治疗两种形式的胰腺炎，急性和慢性胰腺炎。
慢性胰腺炎是胰腺长期持续炎症。最常发生于急性胰腺炎发作后。重度饮酒是另一大原因。大量饮酒对胰腺造成的损害可能不会导致多年的症状，但是此时受试者可能突然发展为严重的胰腺炎症状。患有急性胰腺炎的受试者在医院接受静脉输液和止痛药品治疗。慢性胰腺炎可能难以治疗。它涉及缓解疼痛和改善营养。受试者一般给予胰酶或胰岛素。
病毒性肝炎是肝脏炎症的最常见原因。
其它原因包括自身免疫疾病和摄入有毒物质(特别是酒精)、某些药物(如扑热息痛)、一些工业有机溶剂和植物。抗逆转录病毒药物如替诺福韦(tenofovir)和恩替卡韦(entecavir)被用于治疗慢性乙型肝炎。
炎症性肠病.
炎症性肠病(ibd)是一个广泛的术语，描述具有慢性或复发性免疫反应和胃肠道炎症的病况。两种最常见的炎症性肠病是溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。炎症影响克罗恩氏病中的整个消化道，并且仅影响溃疡性结肠炎中的大肠。这两种疾病的特征在于对身体免疫系统的反应异常。
克罗恩氏病用被设计成抑制导致症状的免疫系统异常炎症反应的药品治疗。抑制炎症可缓解常见症状，如发热、腹泻和疼痛，并且使肠道组织愈合。组合疗法可以包括向免疫调节剂添加生物制剂。与所有疗法一样，组合疗法也有风险和益处。将药品与免疫调节疗法组合可以提高ibd治疗的有效性。
用于治疗ibd症状的药剂的实例包括但不限于含有5-氨基水杨酸(5-asa)、皮质类固醇、免疫调节剂、抗生素和生物疗法的柳氮磺吡啶、美沙拉嗪(mesalamine)、奥沙拉嗪(olsalazine)和巴柳氮(balsalazide)。
肿瘤.
本文所述的组合物可以用于治疗胰腺、肝脏或结肠的各种肿瘤和胃肠道内或胃肠道附近的其它癌症。胰腺肿瘤包括但不限于原发性胰腺肿瘤，如胰腺导管腺癌、囊性肿瘤、导管内乳头状瘤性肿瘤。内分泌肿瘤包括胰岛素瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素瘤和生长抑素瘤。
肝脏肿瘤包括良性和恶性肿瘤，包括但不限于肝细胞腺瘤、局灶性结节性增生、异型增生性结节、血管瘤、肝细胞癌、癌肉瘤、肝母细胞瘤、血管肉瘤、血管内皮瘤、原发性淋巴瘤。胆管良性和恶性肿瘤包括但不限于胆管囊肿、胆管周围腺管错构瘤、胆管囊腺瘤、胆管囊腺癌和胆管癌(goodman,modernpathology,20:s49-s60(2007))。
约95％的结肠直肠癌来自腺瘤(具有可变恶性肿瘤可能性的良性肿瘤上皮细胞肿瘤)，可分为息肉样、非息肉样或混合型。此外，与一般人群相比，患有长期ibd结肠炎的受试者罹患结直肠癌的风险更高(facciorusso等人,worldj.gastroenterol.,21(17):5149-5157(2015))。
肿瘤的治疗可以包括将包封抗增殖剂、化学治疗剂、免疫调节剂、放射剂或激酶抑制剂的pba纳米颗粒靶向递送至胰腺、肝脏或结肠。因为pba纳米颗粒也能够进入肝脏中的门静脉循环，所以它们特别适合于靶向肝肿瘤。
抗原的递送和耐受性的诱导
携带抗原和/或免疫抑制药物的颗粒优选在空间上定位于相同的肝脏树突细胞或肝脏内皮细胞以启动耐受性。因此，尽管涵盖在一组中携带抗原和在另一组中携带免疫抑制剂并一起注射的不同颗粒，但携带两种试剂并靶向肝脏树突细胞或内皮细胞的纳米颗粒是优选的。
优选的策略通常包括施用包含抗原和免疫抑制剂的颗粒，所述颗粒保留在肝脏中并被肝脏抗原呈递细胞或内皮细胞吸收。然后，致耐受性树突细胞在整个身体内循环以诱导对所包封抗原的耐受性(外周耐受性)。可以充当活抗原呈递细胞的示例性细胞包括肝脏树突细胞(dc)、肝脏内皮细胞、库普弗细胞、肝星状细胞、肝细胞以及将抗原呈递给肝脏的其它细胞。
肝脏dc或ec排泄至局部淋巴结(腹腔)。他们获得诱导抗原特异性调节性t细胞(treg)扩增的致耐受性程序。apc也可以将抗原呈递给窦状隙中的t细胞而不迁出。此外，抗原可能在处于肝脏或淋巴结时，或甚至在它们之间迁移时被dc处理。通常，肝细胞中的载体的细胞内积累、运输或滞留对于耐受性诱导是重要的。
抗原呈递细胞还表达消炎标记物或表示致耐受性表型启动的标记物。treg从淋巴结迁移到循环中并诱导全系统耐受。
一个优选策略可以总结为五个步骤：
1)肝脏归巢；
2)由肝脏中树突细胞和/或apc吸收；
3)排泄到局部淋巴管；
4)调节性t细胞的扩增；
5)迁移到血流中并引发外周耐受性。
通过诱导抗原特异性treg、多克隆treg、tr1细胞、表达pd-l1或ctla-4的其它cd4细胞、cd8细胞缺失/无反应性、甚至breg，可以实现稳健的耐受性。因此，在一些实施例中，组合物以有效量施用以获得致耐受性程序，所述致耐受程序降低或防止针对期望抗原(例如由颗粒递送的抗原)的免疫原性。
施用不限于治疗现有的病况或疾病，而是还可以用于预防或降低个体罹患这种疾病的风险，即用于预防性用途。组合物可以用于预防性疫苗或疗法、或治疗性疫苗或疗法，其可以用于启动或增强受试者对预先存在的抗原或新抗原的免疫耐受性。
根据本领域众所周知的原理，预防、治疗或去敏化的免疫应答的预期结果可以根据疾病而变化。类似地，免疫耐受性可以完全治疗疾病，可以缓解症状，或者可以是针对疾病的总体治疗干预的一个方面。
预防性接种疫苗的潜在候选者包括罹患针对某些自身抗原的自身免疫性的高风险个体，以及接受重组蛋白疗法(fviii或fix)的患者。
b.成像
在其它实施例中，使用药物组合物的方法可以包括对作为整体的靶器官或靶器官内的不同微环境(如炎症袋、渗漏的血管结构或肿瘤)进行非侵入性成像的方法。在这些实施例中，所述方法包括向有需要的受试者施用含有包封有效量的成像剂的非靶向pba纳米颗粒的药物组合物的口服剂量单位；将有效量的成像剂递送至靶组织，如胰腺、肝脏或结肠；任选地从靶组织处的纳米颗粒释放有效量的成像剂；这通过非侵入性成像使得靶组织或靶组织内的不同微环境的检测增强。
适用于检测pba纳米颗粒和/或其中的药剂的成像模式包括正电子发射断层摄影(pet)、计算机断层摄影(ct)、磁共振成像(mri)、超声成像(us)和光学成像。合适的成像剂(示踪剂)包括放射性核素标记的小分子，例如f-18氟脱氧葡萄糖、超顺磁性氧化铁(spio)、钆、铕、二乙烯三胺五乙酸(dtpa)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(dota)及其衍生物、气体和荧光示踪剂。具有相应示踪剂的这种适用模态在本领域中是已知的(baum等人,theranostics,2(5)437-447(2012))。
c.组合疗法和诊断
在其它实施例中，将预防、抑制或治疗疾病或病况的方法与对靶器官或组织进行非侵入性成像的方法进行组合。在这个实施例中，药物组合物含有包封治疗剂和诊断/显像剂的非靶向pba纳米颗粒。所述方法可以包括向需要预防、抑制或治疗靶组织中的疾病和对靶组织进行成像的受试者施用含有非靶向pba纳米颗粒的药物组合物的口服剂量单位，所述非靶向pba纳米颗粒包封有效量的一种或多种活性剂和有效量的成像剂；将pba纳米颗粒递送至靶组织，如胰腺、肝脏或结肠；从靶组织中的pba纳米颗粒释放有效量的一种或多种药剂和任选有效量的成像剂，使得疾病得到预防、抑制或治疗，并且通过非侵入性成像使靶组织或靶组织内的不同微环境的侦测增强。
通过参考以下非限制性实例将进一步理解本发明。
实例
胆汁酸是肠肝循环系统中促进摄入食物吸收和降解的关键组分。从肠到肝脏的胆汁再循环是健康消化和增强口服摄取食品的基础。在实例中，将胆汁酸聚合物配制成纳米颗粒以充当包封治疗剂的有效口服载体，增强它们的生物利用度，其受到由于胃肠道的低ph值和消化酶降解导致吸收不良的限制。由聚合胆汁酸(熊脱氧胆酸)制成的纳米颗粒在消化道中存活并且向胰腺递送几种不同类型的有效载荷，胰腺是非常不易接近的使如1型糖尿病(t1d)等疾病衰弱的部位。聚(胆汁酸)(pba)np口服递送后通过一种机制运输至胰腺，该机制涉及首先在胃微环境中保护有效载荷，然后增强肠道出口，然后有效的巨噬细胞摄取和循环到胰腺微环境。载有免疫抑制雷帕霉素的pbanp预防并治疗非肥胖型糖尿病(nod)小鼠模型中的1型糖尿病(t1d)的发作。与皮下注射胰岛素或包封胰岛素的plga制剂相比，负载胰岛素的pbanp无限期地稳定了血糖水平。一种制剂(熊去氧胆酸)本身具有免疫抑制性质，并且与包封的雷帕霉素协同其免疫抑制作用并增强包封的胰岛素的递送。
实例1.pba纳米颗粒的制备和表征.
材料和方法
胆汁酸的聚合
通过酯化反应将胆汁酸(ba)聚合为pba，通过核磁共振(nmr)和凝胶渗透色谱(gpc)确认聚合。如先前所述(kossena等人,j.pharm.sci.,92:634-638(2002))，使用水/油/水双重乳化技术配制包封探针或治疗剂的pba、plga或复合np。通过扫描电子显微镜(sem)评估np形态，并且通过malvernzetasizer(worcestershire，uk)测量np流体动力学直径和表面电荷。在37℃下，在胃蛋白酶(10mg/ml)存在下，在酸性介质(柠檬酸盐缓冲溶液，ph2.0)中监测np的染料渗漏。更多细节描述在补充信息中。
使用水/油/水(w/o/w)双重乳化技术配制包封染料(1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基吲哚三羰花青碘化物(dir)或香豆素6(c6))或药物(雷帕霉素或胰岛素)的pba或plga(固有粘度0.55-0.75dl/g，羧基端)或混合(50:50)np。将聚合物或混合物(100mg)溶于含有1mgdir或10mgc6或10mg雷帕霉素的2ml氯仿中。将纯pbs(100μl)或含有小鼠胰岛素(10μg)的pbs逐滴添加到氯仿聚合物溶液中，同时使用ikat25digitalultra-turrax进行涡旋和均化。然后将该分散相逐滴加入到5％聚乙烯醇(pva)的连续相中并均化。然后将混合物逐滴加入到200ml的0.2％pva中并搅拌2小时以蒸发溶剂。通过在4℃下以12,000rpm离心20分钟收集np，然后用去离子水洗涤3次。将颗粒冻干并在-20℃下储存。
根据流程1，选择胆汁酸胆酸、石胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸和熊脱氧胆酸，在各种ba聚合之后，通过酯化制备双重乳化型(w/o/w)np。合成和纯化后，聚合物分别通过核磁共振(nmr)和凝胶渗透色谱(gpc)表征以分析聚酯化并测定分子量(表1)。在60ml无水二氯甲烷与无水吡啶的5:1溶剂混合物中加入胆汁酸(ba)(5.4mmol)、对甲苯磺酸(0.652mmol)和4-二甲氨基吡啶(dmap，0.652mmol)并在40℃下搅拌产生澄清溶液。向反应混合物中加入6.92mmol二异丙基碳化二亚胺，并使反应在氮气气氛中进行2小时。将聚酯产物pba沉淀入400ml冷的无水甲醇中，通过离心收集并干燥以保留白色粉末。
使用配备有1515型等度泵、717plus自动取样器和具有串联watersstyragel色谱柱ht6e和ht2的2414折射率(ri)检测器的watershplc系统，使用gpc评估pba(氯仿中10mg/ml)的分子量(mw)。
使用氯仿作为流动相，流速为1ml/min，柱和ri检测器均保持在40℃。mw值是相对于由aldrichchemical的窄多分散性聚苯乙烯标准品产生的校准曲线确定的。empoweriigpc软件用于运行gpc仪器和随后的色谱分析。
使用对甲苯磺酸(ptsa)、4-二甲基氨基吡啶(dmap)和n,n'-二异丙基碳化二亚胺(dic)将胆汁酸单体酯化而产生聚合。使用形成线性聚(胆汁酸)聚合物的熊脱氧胆酸(udca)单体的酯化反应示意图如下：
聚(胆汁酸)纳米颗粒形成
nmr分析
udca和pudca的1h和2d-(cosy、dqfcosy、hsqc和hmbc)nmr光谱数据在agilent(usa)nmr光谱仪上以600mhz用3mm冷探针或400mhz记录，13cnmr数据使用100mhz磁场测量。对于所有nmr实验，使用氯仿-d1(99.96％，cambridgeisotopelaboratories,inc.)作为氘代nmr溶剂和溶剂参考信号(δh7.25,δc76.98)。通过对nmr光谱数据(包括二维cosy、dqfcosy、hsqc和hmbc)nmr的分析明确支持udca单体通过c-24上的羧酸基团与c-3和c-7上的2个独立的仲醇基团偶联的完全聚合。
统计分析
在整个实例中，与多个组的实验比较使用anova分析与邦费罗尼事后检验(bonferroni'sposttest)来进行。双尾学生t检验进行了一些比较，如图中的标题所示。0.05或更小的p值被认为是统计学显著的。
结果
通过分子量、尺寸(平均直径)、多分散指数、ζ电位(mv)和染料负载量来表征形成的聚(胆汁酸)(pba)聚合物及其各自的纳米颗粒(np)。结果总结在下表1中。plga和由plga形成的纳米颗粒用于比较。pba纳米颗粒尺寸分布呈现在图1中。
表2.合成的pba聚合物和它们各自的纳米颗粒的特征.
a数均摩尔质量(凝胶渗透色谱法，gpc)
b重均摩尔质量(gpc)
c多分散指数(gpc)
d多分散指数(动态光散射，dls)
e(染料的重量/纳米颗粒的重量)×100
f复合纳米颗粒(plga:pudca＝50:50，w/w)
通过1h和二维nmr分析明确支持通过将c-24上的羧酸基团与醇基团偶联来完全聚合udca单体。
代表性的pbanp、pudcanp在扫描电子显微照片(sem)中显示球形形态，np直径计算为344.3±4.7nm。为了分离pba特性对np生物利用度的生物效应，优化np制剂以通过影响生物利用度的其它生物物理参数(如粒径和表面电荷)进行标准化。表1总结了这些参数；平均流体动力学直径为331.1±20.3nm，平均ζ电位为-25.3±2.3mv。另外，为了确保np剂量含有相同的荧光强度，将所有np配制成包封相近水平的近红外染料1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基吲哚三羰花青碘化物(dir)。
pbanp与plganp进行了比较，plganp已经在口服递送中广泛研究。聚合物和np的相称材料特性确保了口服施用后生物利用度的差异源于pba的物理和生物化学特性。
实例2.当与plga纳米颗粒相比时，pba纳米颗粒显示出更高的稳定性、增加的细胞渗透性和增强的细胞吸收.
bmm中np的吸收从c57bl/6小鼠收获骨髓细胞，并在具有巨噬细胞集落刺激因子(mcsf，10ng/ml)的罗斯威尔帕克纪念研究所(roswellparkmemorialinstitute，rpmi)培养基中在37℃下具有5％co2的湿润气氛中培养。7天后，将bmm以每孔1×104个细胞的密度接种在96孔板中，并将负载dir的np(dir-np)加入到培养基中。将细胞培育2、4和8小时，并在洗涤后使用平板读取器测量dir-np的吸收。
另外，transwell系统中pba纳米颗粒通过单层caco2细胞的渗透性显著大于plga纳米颗粒(图2d)。具体而言，pudca纳米颗粒显示出比plga纳米颗粒(pudca：50.63×107cm/sec，plga：6.45×107cm/sec，p<0.0001)通过单层的吸收快五倍。为了评估粒子吸收进入肠道层的另一个重要指标，进行了其中负载dir的np通过caco-2单层(一种常见的人类肠模型)的transwell实验。用pudca配制的np显著增强肠渗透性，而游离染料和plganp的运输显著较慢(图2j)。复合np(plga/pudca)显示纯粹由plga或pudca制成的那些之间的动力学。
类似地，pudca纳米颗粒优先被骨髓衍生的巨噬细胞(bmdm)吸收。用1mg/mlpudca纳米颗粒培育4或8小时的bmdm的荧光强度显著大于1mg/mlplga纳米颗粒的荧光强度(图2h)p＝0.023。
实例3.pba纳米颗粒通常是无毒的.
为了评估制剂的细胞毒性，将np(1mg/ml)与caco-2或nih-3t3细胞培育，caco-2或nih-3t3细胞以每孔104个细胞的密度接种在96孔板中并在37℃、含5％co2的潮湿空气培养。将细胞培养24小时，并使用mtt比色测定法测定活细胞的数量。将孔板培养4小时并记录570nm处的吸光度。
结果表明细胞活力取决于纳米颗粒组成以及细胞系(图3a和3b)。通常，pba纳米颗粒是无毒的。具体而言，由pudca或plga形成的纳米颗粒对细胞活力具有相似的作用(图3a和3b)。
实例4.经口管饲后pba纳米颗粒的生物分布.
通过300μl体积的经口管饲施用以5mg/ml浓度由plga、聚(胆酸)(c或pca)、聚(石胆酸)(lc或plca)、聚(脱氧胆酸)(dc或pdca)、聚(丝氨酸-脱氧胆酸)(cdc或pcdca)或udc(或pudca)形成的负载dir的纳米颗粒。给药后4小时，将小鼠处死并定量各器官的dir荧光。结果显示在图4a-4c中。
将c57bl/6小鼠(6-8周龄)饲养在高压灭菌的微型隔离笼中，将其置于正压遏制架中并根据耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准的方案保存。将小鼠随机分配到各3-5只动物的实验组和对照组。将小鼠禁食4小时并通过口服注射(0.5g/kg)用dir或c6包封的np处理。用溶解的游离dir或c6作为对照。
由pba或plga制成的纳米颗粒遍布胃肠(gi)道(图4a)。通常，每克组织的pba纳米颗粒的荧光强度大于检查的三种组织-胃、大肠或小肠中的plga纳米颗粒的荧光强度。在所有的pba纳米颗粒中，pudca纳米颗粒在胃中表现出最低的保留，表明这些可能更适合于口服药物递送(图4a)。
口服递送纳米颗粒后，在胰腺、肝脏、肺、脾脏、肾脏和心脏中检测到来自纳米颗粒的荧光(图4b和4c)。当每克组织的荧光强度被标准化时(图4c)，数据显示pba纳米颗粒在靶向胰腺方面比在plga纳米颗粒方面更有效。此外，与plga纳米颗粒相比，来自pudca纳米颗粒的每克组织的荧光强度在所有组织中都更高。
实例5.pba纳米颗粒在经口管饲后靶向胰腺.
材料和方法如上所述。
pudca和plga纳米颗粒都装有大约等量的dir或香豆素6(表1)。
组织学
将接受载有氧化铁的pudcanp(io-pudcanp)的小鼠胰腺固定在10％中性缓冲福尔马林中，通过苏木精和曙红(h&e)和普鲁士蓝染色进行组织学分析。染色切片由耶鲁大学病理组织学服务(纽黑文，康涅狄格州，美国)制备。用尼康dsfil彩色相机和niselementsar软件(版本2.30)在尼康te-2000u显微镜上使组织成像。
图5a显示了plga、plga和pudca50:50混合物或pudca纳米颗粒对胰腺的吸收动力学，并且表明吸收依赖于纳米颗粒组成。在灌胃后4、8和12小时，pudca纳米颗粒的胰腺吸收明显大于plga纳米颗粒。胰腺优先吸收pudca纳米颗粒取决于纳米颗粒的组成(图5a和5b)。如图5e和5f所示，plga和pudca纳米颗粒的生物分布相似。图5e是颗粒的器官吸收百分比，4b是实际的定量数据，这意味着pudcanp的绝对量在器官中更高。
当每克组织标准化时，pudca纳米颗粒在各个器官中产生更大的荧光强度，表明与plga纳米颗粒的量相比，显著更大量的pudca纳米颗粒到达这些器官(图5c和4c)。
此外，用pbs或超顺磁性氧化铁(spio)负载的pudca纳米颗粒对小鼠口服灌胃显示当用普鲁士蓝染色检测氧化铁时，纳米颗粒在胰腺细胞中的积聚。
检查pba和plganp的胰腺吸收和清除动力学，发现吸收后4小时的峰值吸收，然后是颗粒清除(图4e)。相反，游离染料的胰腺吸收速度较慢。为了确保显著的胰腺吸收不是染料依赖性现象，还使用香豆素6配制np，香豆素6是比dir疏水得多的染料。在改变染料的物理特性后，不论染料性质如何(图4f)，一致的胰腺荧光读数证实pudcanp以比plganp或悬浮染料显著更大的程度向胰腺运输(图4f)。通过给予pudcanp包封氧化铁(10)进一步验证了这种胰潴留，并且h&e染色证实pbanp是无毒的。有趣的是，穿过肠道的plga和pudcanp的比例分布在类似的隔室中；通过肠的np的生物分布百分比之间没有显著差异(图5f)。然而，当给小鼠喂食荧光强度匹配剂量的plga或pudcanp时，在接受pudcanp的小鼠器官中恢复的总荧光显著增加(图5d)，表明更多的pudcanp通过肠道并被运输至器官。
实例6.通过血液运输来介导pba纳米颗粒从胃肠道向胰腺的转运
还通过尾静脉注射(i.v.)向小鼠静脉内施用每种制剂(10mg/ml，100μl注射(总共＝1mg))以评估2小时后的器官的生物分布和荧光强度。
研究了plga、plga和pudca50:50混合物或pudca纳米颗粒在静脉内注射时靶向胰腺，而不是通过口服管饲施用。
静脉注射2小时后，负载dir的plga、plga和pudca50:50混合物或pudca纳米颗粒保留在胰腺中，并且再次比pgaca纳米颗粒滞留更多(图6a和6b)。(plga：13.0×108(p＝0.047)，50/50：58.2×108(p＝0.002)，pudca：86.5×108(p＝0.0008))。
通过静脉内(i.v.)注射np(plga、pudca或复合物)绕过消化道，优越的胃保护和肠渗透完全解释了pudcanp的器官运输增强。在i.v.施用后pudcanp在胰腺(图6b)，肝和肺中的吸收仍高于plga或复合np(图6c和6d)。这一结果表明，高pudcanp口服生物利用度的另一个驱动因素在循环中存在。选择巨噬细胞进行进一步研究，因为这些细胞通常控制体内颗粒的命运，在内化、穿梭和清除血流颗粒方面发挥关键作用。
由于pudca纳米颗粒优先被骨髓巨噬细胞吸收(图2i)，因此测试将负载dir的pudca纳米颗粒静脉注射入健康或缺乏巨噬细胞的小鼠是否会影响纳米颗粒的胰腺保留。如图6e和6f所示，如显著较低的荧光强度(图6e和6f)所示，巨噬细胞去除小鼠的胰腺保留的负载dir的pudca纳米颗粒的量显著低于健康小鼠的胰腺。(健康：2.72×108，巨噬细胞去除：1.45×108，p＝0.017)。
这些数据表明，口服递送的pudca纳米颗粒的运输可以通过血液以游离形式或者吞噬巨噬细胞而被运送到胰脏。
为了证实巨噬细胞在pba纳米颗粒的运输和保留中起作用，检查了pudca纳米颗粒或巨噬细胞在各种器官中的百分比积累。将负载dir的pudca纳米颗粒和dir标记的巨噬细胞静脉注射到野生型小鼠中，两小时后处死小鼠，并在胰腺、肺、肝、脾、肾和心脏中检查百分比积累。结果显示在图6j中，并且证明pudca纳米颗粒和巨噬细胞的百分比积累在所有检查的器官中是相似的。
巨噬细胞吸收和释放pudca、plga/pudca和plga纳米颗粒的动力学见图6k和6l。显示口服给药后到达胰腺的pudcanp的示意图显示在图6m中。
实例7.用雷帕霉素负载的pba纳米颗粒预防1型糖尿病.
nod小鼠(nod/shiltj，杰克逊实验室，7周龄)腹膜内注射环磷酰胺(cy，200mg/kg)诱导t1d。24小时后，然后对小鼠经口管饲负载雷帕霉素的np(rapa-np，40mg/ml，250μl，0.5g/kg，1或2次剂量，0.1mgrapa/mgnp)并监测糖尿。两次读数(间隔两天)高于250mg/dl被认为是t1d发病的指征。dir-np被用于对糖尿病胰腺进行成像。在cy和np处理后使用流式细胞仪获得cd8细胞和cd4+cd25+foxp3+treg的cd44+。收集胰腺引流淋巴结并使用40μm细胞过滤器处理以分离脾细胞。通过在4℃下培育30分钟用cd8(percp-cy5.5；2ug/ml)、cd4(太平洋蓝；2μg/ml)、cd44(alexafluor-700；2ug/ml)和cd25(fitc；1μg/ml)的荧光抗体对细胞表面标记进行染色。然后固定细胞，透化，并使用来自ebiosciences的foxp3染色试剂盒并按照制造商推荐的方案对foxp3(pe；5μg/ml)染色。最后一次洗涤后，立即在bdlsr-ii多色流式细胞仪上运行样品以量化cd44+，cd8+以及cd4+cd25+foxp3+treg细胞的百分比。使用flojofacs分析软件进行后分析。
图7a-7c表明负载雷帕霉素的pudca纳米颗粒而非负载雷帕霉素负载的plga纳米颗粒阻止nod小鼠中t1d的发展。通过腹膜内注射环磷酰胺(cy)在nod小鼠中诱导1型糖尿病(t1d)，导致t1d的快速同步起始(图7a)。在cy注射后一天后，小鼠接受负载雷帕霉素的plga或pudca纳米颗粒的经口管饲一次或两次。cy注射后第2天开始测量血糖水平。
图7b表明虽然用cy治疗的小鼠中有80％在12天后发生了糖尿病，但疾病部分地被包封雷帕霉素的pudcanp减弱30天。然而，plga-雷帕霉素治疗不足以抑制疾病进展，因为60％的小鼠死于t1d(图7b)。如图7b所示，接受雷帕霉素-pudca的小鼠中仅约20％发生t1d，而用雷帕霉素-plga处理时发生约60％。这种效应可归因于负载雷帕霉素的pudca纳米颗粒在t1d小鼠的炎性胰腺中相对于载有雷帕霉素的plga纳米颗粒的更大滞留(图7c)。
此外，在注射环磷酰胺之前或3、5和7天后检查效应记忆cd44+cd8t细胞和cd25+foxp3+cd4调节性t细胞(treg)的百分比。在治疗后数天内在引流淋巴结中追踪调节性t细胞(treg)的百分比，通过cd4+cd25+foxp3+的表达评估(图7d)。虽然plganp治疗减少了cy诱导的treg耗竭，但与未治疗相比，pudcanp治疗能够更显著地抑制treg耗竭。此外，雷帕霉素-pudca纳米颗粒治疗抑制了treg的丧失，因为淋巴细胞群中cd25+foxp3+cd4treg的百分比没有像未处理小鼠那样严重降低。
实例8.用胰岛素负载的pba纳米颗粒逆转1型糖尿病.
将nod小鼠饲养大约2个月以使它们自发发展t1d。当两次随机尾静脉血糖测量(间隔两天)高于200mg/dl时，小鼠每天用游离胰岛素或负载胰岛素的np(胰岛素-np)口服治疗一周并监测糖尿和身体重量。口服灌胃后4、8和24小时，用小鼠超敏感胰岛素elisa测定血浆和胰岛素胰岛素浓度。ins-np处理7天后，收获胰腺淋巴结并通过流式细胞术分析以定量cd44+cd8+细胞以及cd4+cd25+foxp3+treg的百分比。
细胞分离和培养.
对pudca的细胞反应的功能表征
用抗cd28和抗cd3抗体刺激纯化的cd4+t细胞(c57bl/6，1×105个细胞/孔，96孔板)，并与50μg/ml或5μg/mlpudcanp一起培养。在第3天，使用cfse标记测量细胞增殖，并通过elisa测定定量上清液中的细胞因子分泌。对于抗原特异性研究，在otii共培养测定中使用ova特异性cd4+细胞。用pudcanp预处理24小时，洗涤后用lps(10ng/ml)和卵清蛋白(20μg/ml)刺激24h，然后与otiicd4+t细胞共培养5·104)3天。然后定量细胞增殖和细胞因子产生。
流式细胞术
np处理后通过流式细胞术测定cd8+细胞的cd44+群体和cd4+cd25+foxp3+treg的数量。收获胰腺淋巴结并使用40μm细胞过滤器处理。通过在4℃培育30分钟，用cd8(percp-cy5.5)，cd4(太平洋蓝)，cd44(alexafluor-700)和cd25(fitc)的荧光抗体对细胞表面标记进行染色。然后将细胞固定，透化并使用来自ebiosciences的foxp3染色试剂盒并按照制造商推荐的方案对foxp3(pe)染色。最后一次洗涤后，立即在bdlsr-ii多色流式细胞仪上运行样品。使用flowjo分析软件进行数据分析。
cd11c-f4/80+巨噬细胞用负载1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基吲哚二羰花青高氯酸盐(did)的pudcanp用于吸收研究后用流式细胞计量术表征。收获脾脏、胰腺淋巴结、肺和肝脏，并通过使用40μm细胞过滤器和注射器柱塞进行匀浆处理。通过在4℃培育30分钟，用荧光抗体对f4/80(alexafluor-700)和cd11c(pe-cy7)染色细胞表面标记。用facs缓冲液(pbs中2％fbs)洗涤3次后，立即在attunenxt多色流式细胞仪(lifetechnologies,guilford,usa)上运行样品。
培养的bmdc的np处理后，分离细胞，使用facs缓冲液(pbs中的2％fbs)洗涤，然后使用在facs缓冲液中稀释的初级ab在4℃染色30分钟。这些研究中使用的抗体包括cd11c(efluor450)、mhci类(apc)、mhcii类(percp-efluor710)、cd40(fitc)和cd86(pe)。然后将样品固定在2％多聚甲醛中并在lsrii流式细胞仪上运行。对每个样品计数10,000个事件，然后使用flowjo软件进行分析。所有样品最初在前向和侧向分散门上进行门控，随后在cd11c+singlets上进行门控。然后使用用于统计分析的几何平均荧光强度评估这些细胞事件的mhci类、mhcii类、cd40和cd86表面标记物的表达。
建立了糖尿病的小鼠(通过一致的血糖读数超过200mg/dl证实)被给予荧光plga或pudcanp。4小时后，在给予pudca的小鼠中检测到更大量的荧光，并且与plga处理的小鼠相反，24小时后检测到荧光，显示pudcanp的高保留。
图8c表明，负载胰岛素的pudca纳米颗粒，但不负载胰岛素的plga纳米颗粒(在糖尿病的第一周每天总共施用7个剂量)的口服管饲维持血糖水平至少21天并逆转t1d。在治疗期间，小鼠的体重基本保持不变(图8d)。
值得注意的是，胰岛素负载的pudca纳米颗粒使t1d小鼠的预期存活增加一倍(图8e)。
胰腺靶向胰岛素负载的pudca纳米颗粒的有益治疗效果可以解释为与用胰岛素负载的plga纳米颗粒治疗的小鼠相比，在口服纳米颗粒后4和8小时，用胰岛素负载的pudca纳米颗粒治疗的小鼠的胰腺中显著更高的胰岛素水平(图8a)。(plga4h：4.10ng，plga8h：6.41ng，pudca4h：25.9ng，pudca8h：14.9ng，p<0.001，n＝5)。类似地，在口服纳米颗粒后4和8小时，用胰岛素负载的pudca纳米颗粒处理的小鼠的血清中的胰岛素浓度与用胰岛素负载的plga纳米颗粒处理的小鼠相比显著更高(图8b)(plga4h：6.55ng/ml，plga8h：6.14ng/ml，pudca4h：14.94ng/ml，pudca8h：11.80ng/ml，p<0.01，n＝5)。
通过治疗空的(空白)pudcanp减轻t1d疾病进展(图8c)表明这些颗粒可能赋予胰腺微环境免疫抑制作用，可能与包封的胰岛素协同作用。研究cd4+t细胞和骨髓源性树突细胞(bmdc)对pudcanp体外处理的细胞应答。当使用抗cd3和抗cd28抗体非特异性刺激细胞时，用高(50μg/ml)和低(5μg/ml)剂量的pudcanp预处理cd4+t细胞导致更低的总ifn-γ产生(图9c)。类似地，当用lps和抗原卵清蛋白预处理dc后dc和t细胞共培养时，抗原特异性ot-iicd4+细胞产生较低的ifn-γ(图9d)。在两种情况下，无论用pudca治疗，il-2的产生都不变(图9e和9f)。此外，在lps和卵白蛋白刺激后存在pudca的情况下bmdc的单一培养不会导致dc表面标记物表达的表型变化(图9g，9h和9i)。这些结果显示pudca可以抑制t细胞的cd4+效应子活性，同时保持dc激活完整。
综上所述，这些结果表明pudcanp是用于预防和治疗t1d的有前途的平台。图8a-9i中的数据显示负载胰岛素的pudca纳米颗粒逆转nod小鼠中的1型糖尿病。
实例9.pba纳米颗粒靶向炎症性肠病中的发炎肠.
通过喂食用葡聚糖硫酸钠(dss)(10mg/ml)治疗2周的水，在balb/c小鼠中诱导结肠炎。ibd小鼠在口服(管饲)250μl4mg/ml悬浮于缓冲盐水ph7.4(50mg/kg)的溶液后3和24小时后接受负载dir的plga纳米颗粒。
ibd小鼠的肠内炎症可以用pba纳米颗粒靶向。如图10b所示，250μl的4mg/mlpudca或plga纳米颗粒在健康或ibd小鼠中口服管饲显示在口服管饲后3和24小时，ibd小鼠的发炎肠内保留了比plga纳米颗粒显著更多量的pudca纳米颗粒。因此，pudca纳米颗粒可以以更高的效率靶向ibd小鼠模型的发炎的肠，并且比plga纳米颗粒更长地保留在那里(比较24小时的荧光强度)。(plga：2.26×108，pudca：6.20×108，n＝3，p<0.01)
由于聚(胆汁酸)(pba)np具有包封疏水性或两亲性小分子药物以及胰岛素等蛋白质的能力，因此该研究代表了用于有效口服递送各种分子的模块化、多功能np平台。这些生物启发的np通过胃保护、增强的肠通透性和巨噬细胞携带积聚在发炎的胰腺中。另外，用pba聚合物形成的np的治疗功效可能源于gi保护和胰腺运输之间的协同作用，以及通过触发抗炎信号传导过程。
总之，证明合理设计的pbanp能够在胃肠道中存活，在胰腺积聚，并预防和治疗t1d。这种平台技术可以用于几种其它胰腺疾病，其发病率和严重后果越来越严重，包括死亡率极高的胰腺炎和胰腺癌。