本申请要求于2015年7月16日提交的美国临时申请号62/193,309的权益，该申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
发明领域
本公开大体上涉及特异性接合tnf受体超家族(tnfrsf)成员死亡受体5(dr5)的分子。更具体地说说说，本公开涉及至少结合dr5的多价和多特异性分子。
发明背景
发明概要
已证明如由抗体对dr4、dr5、gitr以及ox40的活性必需fc-γ受体(fcγr)所证实，靶向tnf受体超家族(tnfrsf)成员的常规抗体需要外源性交联以获得足够的激动剂活性(ichikawa等人2001alnat.med.7,954–960；li等人2008drugdev.res.69,69–82；pukac等人2005br.j.cancer92,1430–1441；yanda等人2008ann.oncol.19,1060–1067；yang等人2007cancerlett.251:146–157；bulliard等人2013jem210(9):1685；bulliard等人2014immunolandcellbiol92:475-480)。除经由fcγr交联之外，已证实其他外源药剂，包括添加寡聚配体或抗体结合实体(例如蛋白a和二次抗体)也增强抗tnfrsf抗体群集和下游信号传导。举例来说，cd137抗体pf-05082566的体外激动剂活性需要经由二次抗体交联(fisher等人cancerimmunolimmunother201261:1721–1733)。这些发现表明需要超过二聚体的tnfrsf群集。
临床上利用trail途径进行癌症治疗的努力依赖于天然配体trail的重组型式和对dr5具特异性的抗体。在临床前体外实验中抗体激动剂靶向dr5需要交联剂。举例来说，添加dr5配体trail增强抗dr5抗体amg655的凋亡诱导能力(graves等人2014cancercell26:177-189)。常规抗体为二价的并且仅能够使两个dr5受体(每个fab臂一个)群集。与tnfrsf的其他成员一致，两个dr5受体的群集不足以介导信号传导并活化体外细胞死亡途径。令人惊讶地，在人类癌症的临床前小鼠模型中体内施用dr5靶向抗体在多种肿瘤类型中展示显著活性。此活性后来据证实依赖于小鼠fcγr受体。在人类中的临床研究未能重现在这些临床前小鼠模型中所见到的强烈反应。假设在人类中缺乏活性是归因于抗体交联不足。这可能是归因于免疫受损的小鼠和人类癌症患者之间的血清igg、fcγr和或trail浓度的差异。
本公开提供靶向dr5的多价融合蛋白，所述多价融合蛋白能够有效地使介导直接细胞死亡的dr5信号传导激动。本公开的融合蛋白可为二价、三价、四价、五价或六价的。重要的是，本公开的融合蛋白能够独立于外源性交联剂而引发表达dr5的细胞的凋亡。
在一些实施方案中，本公开的融合蛋白合并了结合dr5的结合域(dr5bd)。在优选实施方案中，结合dr5的dr5bd不结合dr4、诱饵r1、诱饵r2、骨桥蛋白或任何其他tnfrsf成员。在优选实施方案中，结合dr5的dr5bd结合人类和食蟹猴dr5。在一些实施方案中，结合dr5的dr5bd阻断dr5与其配体trail的相互作用。在其他实施方案中，结合dr5的dr5bd不阻断dr5与其配体trail的相互作用。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白合并了多个结合dr5的dr5bd，所述多个结合dr5的dr5bd识别dr5上的不同表位。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白合并了多个结合dr5的dr5bd，其中一些dr5bd阻断dr5-trail相互作用，而其他不阻断dr5-trail相互作用。在优选实施方案中，本公开的dr5靶向融合蛋白诱导肿瘤细胞的直接细胞死亡。本公开的dr5靶向融合蛋白在治疗本质上为血液学和实体肿瘤的肿瘤方面有效用。
本公开提供多价结合dr5的融合蛋白，所述多价结合dr5的融合蛋白包含2个或更多个dr5结合域(dr5bd)。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白在治疗赘瘤方面有效用。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白结合肿瘤细胞上所表达的dr5。在一些实施方案中，融合蛋白含有两个或更多个不同的dr5bd，其中每一个dr5bd结合dr5。在一些实施方案中，融合蛋白含有结合dr5的dr5bd的多个拷贝。举例来说，在一些实施方案中，融合蛋白含有结合dr5的dr5bd的至少两个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白含有结合dr5的dr5bd的至少三个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白含有结合dr5的dr5bd的至少四个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白含有结合dr5的dr5bd的至少五个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白含有结合dr5的dr5bd的至少六个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白含有结合dr5的dr5bd的六个或更多个拷贝。
本公开的多价结合dr5的融合蛋白能够诱导受损、转化、病毒感染或赘生性细胞的直接细胞死亡，而不需要外源交联剂。另外，本公开的结合dr5的融合蛋白不诱导正常未转化细胞、非病毒感染或非赘生性细胞的直接细胞死亡。重要的是，本公开的dr5bd和由其组成的融合蛋白使预先存在的抗体对存在于一些人类受试者中的单域抗体的识别减少或消除。
tas266为基于四价人源化dr5靶向纳米抗体的治疗剂，所述治疗剂与二价抗体相比表现出优异的凋亡诱导能力，而不需要由fcγr进行额外的交联。(huet,h.a.等人,multivalentnanobodiestargetingdeathreceptor5elicitsuperiortumorcellkillingthroughefficientcaspaseinduction.mabs第6卷发行编号6,2014)。
在一些实施方案中，融合蛋白含有至少一个dr5bd，所述至少一个dr5bd包含选自由seqidno:15-91组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白含有dr5bd的两个或更多个拷贝，所述dr5bd包含选自由seqidno:15-91组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白含有dr5bd的三个或更多个拷贝，所述dr5bd包含选自由seqidno:15-91组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白含有dr5bd的四个或更多个拷贝，所述dr5bd包含选自由seqidno:15-91组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白含有dr5bd的五个或更多个拷贝，所述dr5bd包含选自由seqidno:15-91组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白含有dr5bd的六个或更多个拷贝，所述dr5bd包含选自由seqidno:15-91组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白包含选自由seqidno:92-124组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含选自由seqidno:92-118组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含选自由seqidno:119-124组成的组的氨基酸序列。
本公开的融合蛋白与非交联二价抗体相比能够增强tnfrsf成员的群集。与未交联二价抗体相比，由本公开的融合蛋白介导的增强的tnfrsf成员群集诱导增强的tnfrsf依赖性信号传导。在大多数实施方案中，融合蛋白将合并超过2个dr5bd，例如三个、四个、五个或六个。在一些实施方案中，融合蛋白将合并dr5bd和针对非tnfrsf成员抗原的结合域。在这些实施方案中，非tnfrsf抗原的相互作用能够提供额外的交联功能，并且仅用一个或两个dr5bd就实现了tnfrsf活化。在这些实施方案中，融合蛋白为多特异性的，结合两种不同的抗原。在其他实施方案中，融合蛋白合并了三个或更多个dr5bd和针对不是dr5的抗原的结合域，其中与此额外抗原的相互作用不会使dr5群集增强到超过由单独含有dr5bd的部分所达到的程度，而是提供生物分布优势，从而将融合蛋白的dr5激动活性集中于受试者体内的特定位点。举例来说，本公开的四价结合dr5的融合蛋白可包括额外抗原结合域，所述额外抗原结合域使活性集中于特定位点，而不会使激动活性增强到超过由缺乏此额外抗原结合域的四价结合dr5的融合蛋白所达到的程度。
在一些实施方案中，本公开的dr5bd衍生自抗体或抗体片段，包括scfv、fab、单域抗体(sdab)、vnar或vhh。在优选实施方案中，dr5bd为人类或人源化sdab。sdab片段可衍生自vhh、vnar、工程化vh或vk结构域。vhh可由仅骆驼科重链抗体产生。vnar可由仅软骨鱼重链抗体产生。已实施多种方法来从常规异二聚vh和vk结构域产生单体sdab，包括界面工程化和特定生殖系家族的选择。在其他实施方案中，dr5bd衍生自非抗体支架蛋白，例如但不限于所设计的锚定重复序列蛋白(人工设计的锚定重复序列蛋白(darpin))、高亲合性多聚体(avimer)、抗运载蛋白(anticalin)/脂质运载蛋白、centyrin以及fynomer。
通常，本公开的融合蛋白由经由接头多肽可操作地连接的至少两个或更多个dr5bd组成。利用sdab片段作为本公开的融合物内的特定dr5bd具有避免许多双/多特异性抗体方法共有的重链:轻链错配对问题的益处。另外，本公开的融合蛋白避免使用许多双特异性抗体所必需的长接头。
在一些实施方案中，融合蛋白的所有dr5bd识别dr5上的相同表位。举例来说，本公开的融合蛋白可合并对dr5上的多种表位具有不同识别特异性的2、3、4、5或6个dr5bd。在这些实施方案中，本公开的融合蛋白含有靶向dr5的不同区的多个dr5bd。在一些实施方案中，dr5bd可识别dr5上的不同表位或识别dr5上的表位和不同的抗原。举例来说，本公开提供合并有结合dr5和至少一种第二抗原的dr5bd的多特异性融合蛋白。
在一些实施方案中，本公开的融合蛋白由单一多肽组成。在其他实施方案中，本公开的融合蛋白由超过一种多肽组成。举例来说，其中异二聚化结构域被合并至融合蛋白中，以便构建不对称融合蛋白。举例来说，如果免疫球蛋白fc区被合并至融合蛋白中，那么可使用ch3结构域作为同二聚化结构域，或可使ch3二聚体界面区突变以实现异二聚化。
在一些实施方案中，融合蛋白含有相对末端的dr5bd。举例来说，dr5bd位于融合蛋白的氨基末端(n-末端)部分与融合蛋白的羧基末端(c-末端)部分。在其他实施方案中，所有dr5bd都位于融合蛋白的相同末端。举例来说，dr5bd位于融合蛋白的氨基或羧基末端部分。
在一些实施方案中，融合蛋白含有免疫球蛋白fc区。在一些实施方案中，免疫球蛋白fc区为选自由以下组成的组的igg同种型：igg1同种型、igg2同种型、igg3同种型以及igg4亚类。
在一些实施方案中，免疫球蛋白fc区或其免疫活性片段为igg同种型。举例来说，融合蛋白的免疫球蛋白fc区为人类igg1同种型，具有以下氨基酸序列：
在一些实施方案中，免疫球蛋白fc区或其免疫活性片段包含人类igg1多肽序列，所述人类igg1多肽序列与seqidno:1的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一。
在一些实施方案中，在氨基酸asn297(加框，kabat编号)处对人类igg1fc区进行修饰以防止融合蛋白的糖基化，例如asn297ala(n297a)或asn297asp(n297d)。在一些实施方案中，在氨基酸leu235(加框，kabat编号)处对融合蛋白的fc区进行修饰以改变fc受体相互作用，例如leu235glu(l235e)或leu235ala(l235a)。在一些实施方案中，在氨基酸leu234(加框，kabat编号)处对融合蛋白的fc区进行修饰以改变fc受体相互作用，例如leu234ala(l234a)。在一些实施方案中，在氨基酸234与235处改变融合蛋白的fc区，例如leu234ala和leu235ala(l234a/l235a)或leu234val和leu235ala(l234v/l235a)。在一些实施方案中，在gly235处改变融合蛋白的fc区以使fc受体结合减少。举例来说，其中将gly235从融合蛋白中去除。在一些实施方案中，在氨基酸gly236处对人类igg1fc区进行修饰以增强与cd32a的相互作用，例如gly236ala(g236a)。在一些实施方案中，人类igg1fc区缺乏lys447(kabat等人1991sequencesofproteinsofimmunologicalinterest的eu索引)。
在一些实施方案中，在以下位置中的一处或多处改变融合蛋白的fc区以使fc受体结合减少：leu234(l234)、leu235(l235)、asp265(d265)、asp270(d270)、ser298(s298)、asn297(n297)、asn325(n325)或ala327(a327)。举例来说，leu234ala(l234a)、leu235ala(l235a)、asp265asn(d265n)、asp270asn(d270n)、ser298asn(s298n)、asn297ala(n297a)、asn325glu(n325e)或ala327ser(a327s)。在优选实施方案中，fc区内的修饰使与fc-受体-γ受体的结合减少，而对与新生儿fc受体(fcrn)的结合影响极小。
在一些实施方案中，融合蛋白的fc区在以下位置中的一处或多处缺乏氨基酸以使fc受体结合减少：glu233(e233)、leu234(l234)或leu235(l235)。在这些实施方案中，这三种氨基酸的fc缺失使补体蛋白c1q结合减少。
在一些实施方案中，融合物或其免疫活性片段包含人类igg2多肽序列，所述人类igg2多肽序列与seqidno:2的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一。
在一些实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白fc区或免疫活性片段为人类igg2同种型，具有以下氨基酸序列：
在一些实施方案中，融合物或其免疫活性片段包含人类igg2多肽序列，所述人类igg2多肽序列与seqidno:3的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一。
在一些实施方案中，在氨基酸asn297(加框)处对人类igg2fc区进行修饰，以防止抗体的糖基化，例如asn297ala(n297a)或asn297asp(n297d)。在一些实施方案中，人类igg2fc区缺乏lys447(kabat等人1991sequencesofproteinsofimmunologicalinterest的eu索引)。
在一些实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白fc区或免疫活性片段为人类igg3同种型，具有以下氨基酸序列：
在一些实施方案中，抗体或其免疫活性片段包含人类igg3多肽序列，所述人类igg3多肽序列与seqidno:4的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一。
在一些实施方案中，在氨基酸asn297(加框，kabat编号)处对人类igg3fc区进行修饰以防止抗体的糖基化，例如asn297ala(n297a)或asn297asp(n297d)。在一些实施方案中，在氨基酸435处对人类igg3fc区进行修饰以延长半衰期，例如arg435his(r435h)。在一些实施方案中，人类igg3fc区缺乏lys447(kabat等人1991sequencesofproteinsofimmunologicalinterest的eu索引)。
在一些实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白fc区或免疫活性片段为人类igg4同种型，具有以下氨基酸序列：
在一些实施方案中，抗体或其免疫活性片段包含人类igg4多肽序列，所述人类igg4多肽序列与seqidno:5的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一。
在一些实施方案中，抗体或其免疫活性片段包含人类igg4多肽序列，所述人类igg4多肽序列与seqidno:127的氨基酸序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一。
在其他实施方案中，在氨基酸235处对人类igg4fc区进行修饰以改变fc受体相互作用，例如leu235glu(l235e)。在一些实施方案中，在氨基酸asn297(加框，kabat编号)处对人类igg4fc区进行修饰以防止抗体的糖基化，例如asn297ala(n297a)或asn297asp(n297d)。在一些实施方案中，人类igg4fc区缺乏lys447(kabat等人1991sequencesofproteinsofimmunologicalinterest的eu索引)。
在一些实施方案中，对人类iggfc区进行修饰以增强fcrn结合。增强与fcrn的结合的fc突变的实例为met252tyr、ser254thr、thr256glu(分别为m252y、s254t、t256e)(kabat编号，dall’acqua等人2006,j.biolchem第281卷(33)23514–23524)；met428leu和asn434ser(m428l、n434s)(zalevsky等人2010naturebiotech,第28卷(2)157-159)；或met252ile、thr256asp、met428leu(分别为m252i、t256d、m428l)(kabat等人1991sequencesofproteinsofimmunologicalinterest的eu索引)。
在本公开的融合蛋白包括fc多肽的一些实施方案中，fc多肽为突变的或修饰的。在这些实施方案中，使用kabat编号系统，突变或修饰的fc多肽包括以下突变：met252tyr和met428leu或met252tyr和met428val(m252y、m428l或m252y、m428v)。
在一些实施方案中，对人类iggfc区进行修饰以改变抗体依赖性细胞毒性(adcc)和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)，例如natsume等人,2008cancerres,68(10):3863-72；idusogie等人,2001jimmunol,166(4):2571-5；moore等人,2010mabs,2(2):181-189；lazar等人,2006pnas,103(11):4005–4010；shields等人,2001jbc,276(9):6591–6604；stavenhagen等人,2007cancerres,67(18):8882-8890；stavenhagen等人,2008advan.enzymeregul.,48:152-164；alegre等人,1992jimmunol,148:3461-3468中所描述；kaneko及niwa,2011biodrugs,25(1):1-11中综述的氨基酸修饰。增强adcc的突变的实例包括在ser239和ile332处的修饰，例如ser239asp和ile332glu(s239d、i332e)。增强cdc的突变的实例包括在lys326和glu333处的修饰。在一些实施方案中，在这些位置中的一处或两处对fc区进行修饰，例如使用kabat编号系统为lys326ala和/或glu333ala(k326a和e333a)。
在一些实施方案中，对人类iggfc区进行修饰以诱导异二聚化。举例来说，在ch3结构域内在thr366处具有氨基酸修饰，在将其用体积更大的氨基酸，例如try(t366w)置换时能够优先与具有在位置thr366、leu368以及tyr407处换成体积更小的氨基酸，分别例如ser、ala以及val(t366s/l368a/y407v)的氨基酸修饰的第二ch3结构域配对。可通过引入二硫键，例如通过在相对ch3结构域上将ser354换成cys(s354c)并且将y349换成cys(y349c)使经由ch3修饰的异二聚化进一步稳定(在carter,2001journalofimmunologicalmethods,248:7–15中综述)。
在一些实施方案中，对人类iggfc区进行修饰以防止二聚化。在这些实施方案中，本公开的融合蛋白为单体的。举例来说，在残基thr366处修饰成带电荷的残基，例如thr366lys、thr366arg、thr366asp或thr366glu(分别为t366k、t366r、t366d或t366e)防止ch3-ch3二聚化。
在一些实施方案中，融合蛋白含有衍生自免疫球蛋白铰链区的多肽。铰链区可选自人类igg亚类中的任一种。举例来说，融合蛋白可含有修饰的igg1铰链，所述修饰的igg1铰链具有以下序列：epkssdkthtcppc(seqidno:6)，其中与轻链的c-末端半胱氨酸形成二硫键的cys220突变成丝氨酸，例如cys220ser(c220s)。在其他实施方案中，融合蛋白含有截短的铰链，所述截短的铰链具有以下序列：dkthtcppc(seqidno:7)。
在一些实施方案中，融合蛋白具有从igg4修饰的铰链，所述铰链被修饰以防止或减少链交换，例如ser228pro(s228p)，其具有以下序列：eskygppcppc(seqidno:8)。在一些实施方案中，融合蛋白含有接头多肽。在其他实施方案中，融合蛋白含有接头和铰链多肽。
在一些实施方案中，本公开的融合蛋白缺少或具有减少的在n297处附接至n连接型糖链的岩藻糖。有许多方式来防止岩藻糖基化，包括但不限于在fut8缺陷型细胞系中制备；向哺乳动物细胞培养基中添加抑制剂，例如粟树精胺(castanospermine)；以及制备细胞系的代谢工程化。
在一些实施方案中，对dr5bd进行工程化以消除被在人类中被发现的预先存在的抗体识别。在一些实施方案中，通过位置leu11的突变对本公开的单域抗体进行修饰，例如leu11glu(l11e)或leu11lys(l11k)。在其他实施方案中，通过羧基末端区的改变对本公开的单域抗体进行修饰，例如末端序列由gqgtlvtvkpgg(seqidno:9)或＝gqgtlvtvepgg(seqidno:10)或其修饰型式组成。在一些实施方案中，通过位置11的突变并且通过羧基末端区的改变对本公开的单域抗体进行修饰。
在一些实施方案中，本公开的融合蛋白的dr5bd经由氨基酸接头可操作地连接。在一些实施方案中，这些接头主要由氨基酸甘氨酸和丝氨酸组成，在本文中表示为gs-接头。本公开的融合蛋白的gs-接头可具有各种长度，例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸。
在一些实施方案中，gs-接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：ggsggs，即(ggs)2(seqidno:11)；ggsggsggs，即(ggs)3(seqidno:12)；ggsggsggsggs，即(ggs)4(seqidno:13)；以及ggsggsggsggsggs，即(ggs)5(seqidno:14)。
在一些实施方案中，多价tnfrsf结合性融合蛋白为四价的。在一些实施方案中，四价tnfrsf结合性融合蛋白具有以下结构：vhh-接头-vhh-接头-铰链-fc，其中vhh为至少结合dr5的人源化或全人类vhh序列。
在一些实施方案中，多价tnfrsf结合性融合蛋白为四价的。在一些实施方案中，四价tnfrsf结合性融合蛋白具有以下结构：dr5bd-接头-dr5bd-接头铰链-fc，其中dr5bd为人源化或全人类vhh序列。
在一些实施方案中，多价tnfrsf结合性融合蛋白为六价的。在一些实施方案中，六价tnfrsf结合性融合蛋白具有以下结构：vhh-接头-vhh-接头-vhh-接头-铰链-fc，其中vhh为至少结合dr5的人源化或全人类vhh序列。
在一些实施方案中，多价tnfrsf结合性融合蛋白为六价的。在一些实施方案中，六价tnfrsf结合性融合蛋白具有以下结构：dr5bd-接头-dr5bd-接头-dr5bd-接头-铰链-fc，其中dr5bd为人源化或全人类vhh序列。
在一些实施方案中，本公开的靶向dr5的多价融合蛋白经由氨基酸接头可操作地连接。在一些实施方案中，这些接头主要由氨基酸甘氨酸和丝氨酸组成，在本文中表示为gs-接头。本公开的融合蛋白的gs-接头可具有各种长度，例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸。
在一些实施方案中，多价结合dr5的融合蛋白为四价的。在一些实施方案中，四价结合dr5的融合蛋白具有以下结构：vhh-接头-vhh-接头-铰链-fc，其中vhh为人源化或全人类vhh序列。在一些实施方案中，vhh序列是选自由seqidno:15-91组成的组。在一些实施方案中，四价结合dr5的融合蛋白包含选自由seqidno:92-118组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多价结合dr5的融合蛋白为六价的。在一些实施方案中，六价结合dr5的融合蛋白具有以下结构：vhh-接头-vhh-接头-vhh-接头-铰链-fc，其中vhh为人源化或全人类vhh序列。在一些实施方案中，vhh序列是选自由seqidno:15-91组成的组。在一些实施方案中，六价结合dr5的融合蛋白包含选自由seqidno:119-124组成的组的氨基酸序列。
附图简述
图1为本公开的示例性多价和多特异性融合蛋白的示意图。
图2a、2b、2c、2d、2e、2f以及2g为展示代表性dr5vhh或其人源化变体与人类dr5(图2a、2b、2e、2f以及2g)和cynodr5(图2c和2d)的结合的一系列图。图2a、2b、2e、2f以及2g展示如通过对表达dr5的cho细胞的流式细胞术所评估的一些vhh和人源化vhh结合于人类dr5的结合。图2c和2d展示如通过使用重组cynodr5的elisa所评估的vhh和人源化vhh结合于cynodr5的结合。在图2a、b、c、d以及e中，所用的dr5靶向融合蛋白为二价的，并且所用的格式为vhh-fc或人源化(hz)hzvhh-fc。在图2f和2g中，使用人源化四价(vhh-接头-vhh-fc)dr5靶向fc-融合蛋白。
图3a、3b以及3c为展示本公开的dr5靶向融合蛋白的间接凋亡诱导能力的一系列图。在所有分析中，使用colo205细胞，并且将dr5靶向vhhh10格式化为(a)h10-fc(二价)、(b)h10-接头-h10-fc(四价)或(c)h10-接头-h10-接头-h10-fc(六价)。图3a为展示在使用交联剂时二价dr5靶向融合蛋白的增强的凋亡诱导能力的图。图3b为展示与二价dr5靶向融合蛋白相比四价dr5靶向融合蛋白的增强的凋亡诱导能力的图。图3c为展示与二价dr5靶向融合蛋白和trail相比四价和另外六价dr5靶向融合蛋白的增强的凋亡诱导能力的图。
图4a为展示六价dr5靶向融合蛋白诱导抗性细胞系panc-1凋亡的能力的图。示出colo205以用于比较。示出了h10dr5靶向vhh。
图4b为展示在添加多柔比星(doxorubicin)时panc-1对四价dr5靶向融合蛋白的增强的敏感性的图。示出的dr5靶向vhh为人源化f03(hzf03)，被格式化为hzf03-接头-hzf03-fc。
图5为展示在使用colo-205细胞的鼠肿瘤异种移植模型中本公开的四价dr5靶向融合蛋白的抗肿瘤活性的图。经由静脉内施用以1mg/kg每周给予融合蛋白持续4周。当肿瘤达到约300mm3时开始给药。
图6a、6b、6c、6d、6e、6f、6g、6h、6i以及6j为展示与tas266(pct公布号wo2011/098520a1中所描述的四价dr5纳米抗体)相比，本公开的一些四价dr5靶向融合蛋白对各种癌症细胞系的直接细胞死亡诱导能力的一系列图：(图6a和6b)colo-205、panc-1(图6c和6j)、jl-1(图6d)、hct-116(图6e)、nci-h28(图6f)、nci-h460(图6g)、ht-29(图6h)以及msto-211h(图6i)。在图6a-6d中，dr5靶向vhh为格式化为hzvhh-接头-hzvhh-fc的1f5(hz1f5)的人源化变体。在图6e-6j中，dr5靶向vhh为格式化为hzvhh-接头-hzvhh-fc变体的1f2(hz1f2)或2c6(hz2c6)的人源化变体。
图7a为展示tas266(pct公布号wo2011/098520a1中所描述的四价dr5纳米抗体)和本公开的人源化四价1f5(tet-hz1f5v5)的自身抗体识别的差异的图。该图展示了45个人类供体的血清的结果。使用相应的抗人类igκ或抗人类igλhrp-缀合二次抗体在分开的分析中检测到含有κ或λ轻链的自身抗体。针对分别具有λ或κ轻链igg抗体的阳性对照对数据进行标准化。tas266展现出显著自身抗体识别，而tet-hz1f5v5的自身抗体识别降至igg对照背景。
图7b为证实从多个人类供体汇集的血清(ivig，-c，grifols)含有一些识别单域抗体(sdab)(包括tas266)的igg抗体的图。
图7c为证实tas266被ivig内的自身抗体识别诱导原代人类肝细胞凋亡的图。
图8a和8b为展示tas266(而非tet-hz1f5v5)对衍生自肝祖细胞系的终末分化的肝细胞heprgtm的自身抗体识别依赖性肝毒性的一系列图。在图8a中，使用半胱天冬酶-3/7特异性荧光底物与incucytezoom活细胞成像仪(essenbiosciences)监测凋亡，所示数据是在48小时时。在图8b中，在48小时后使用celltiterglo分析(promega)来监测凋亡。使用ivig(-c，grifols)作为含有sdab定向自身抗体的抗体汇集物。
详细说明
本公开提供特异性接合tnf受体超家族(tnfrsf)成员死亡受体5(dr5)的分子。更具体地说，本公开涉及至少结合dr5的多价分子。这些多价tnfrsf结合性融合蛋白包含两个或更多个tnfrsf结合域(dr5bd)，其中至少一个dr5bd结合dr5。这些分子在本文中被称为dr5靶向分子。
这些dr5靶向分子包括特异性结合dr5的单域抗体(sdab)序列的至少一个拷贝。在一些实施方案中，dr5靶向分子包括特异性结合dr5的sdab的两个或更多个拷贝，例如特异性结合dr5的sdab的三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或六个或更多个拷贝。
单域抗体(sdab)为由能够选择性结合于特定抗原的单一单体可变抗体结构域组成的抗体片段。单域抗体分子量仅为12-15kda，比由两条重蛋白链和两条轻链组成的常见抗体(150-160kda)小得多，并且甚至比fab片段(约50kda，一条轻链和半条重链)和单链可变片段(约25kda，两个可变结构域，一个来自轻链而另一个来自重链)还小。
单域抗体为互补决定区为单域多肽的一部分的抗体。实例包括但不限于重链抗体、天然不含轻链的抗体、衍生自常规4-链抗体的单域抗体、工程化抗体以及不是衍生自抗体的那些支架的单域支架。单域抗体可衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人类、骆驼、美洲驼、山羊、兔和/或牛。在一些实施方案中，本文所用的单域抗体为被称为不含轻链的重链抗体的天然存在的单域抗体。为了清楚起见，在本文中将此衍生自天然不含轻链的重链抗体的可变域称为vhh以将其与四链免疫球蛋白的常规vh区别开。此类vhh分子可衍生自在骆驼科物种中，例如在骆驼、美洲驼、单峰驼、羊驼以及原驼中出现的抗体。除骆驼科以外的其他物种也可产生天然不含轻链的重链抗体；此类vhh在本公开的范围内。
可通过用期望的抗原对单峰驼、骆驼、美洲驼、羊驼或鲨鱼进行免疫并且随后分离编码重链抗体的mrna来获得单域抗体。通过逆转录和聚合酶链反应，产生含有数百万克隆的单域抗体的基因文库。如噬菌体展示和核糖体展示等筛选技术有助于鉴定结合抗原的克隆。(参见例如arbabighahroudi,m.；desmyter,a.等人(1997).“selectionandidentificationofsingledomainantibodyfragmentsfromcamelheavy-chainantibodies”.febsletters414(3):521–526。)
一种不同的方法使用来自未事先免疫的动物的基因文库。此类原初文库通常仅含有对所期望的抗原具有低亲和力的抗体，从而使得有必要通过随机诱变作为额外的步骤来应用亲和力成熟。(saerens,d.等人(2008).“single-domainantibodiesasbuildingblocksfornoveltherapeutics”.currentopinioninpharmacology8(5):600–608。)
在已鉴定出最有效克隆时，对其dna序列进行最佳化，例如以改善其对酶的稳定性。另一个目标是人源化，以防止人类有机体对抗体的免疫反应。由于骆驼科vhh与人类vh片段之间的同源性，人源化是没有问题的。(参见例如saerens等人,(2008).“single-domainantibodiesasbuildingblocksfornoveltherapeutics”.currentopinioninpharmacology8(5):600–608。)最后一步是在大肠杆菌(e.coli)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)或其他合适的有机体中翻译最佳化的单域抗体。
单域抗体片段还衍生自常规抗体。在一些实施方案中，可从具有四条链的常见鼠类或人类igg制备单域抗体。(holt,l.j.等人(2003).“domainantibodies:proteinsfortherapy”.trendsinbiotechnology21(11):484–490。)过程是相似的，包含来自免疫或原初供体的基因文库以及用于鉴定最具特异性的抗原的展示技术。这种方法的一个问题是常见igg的结合区由两个结构域(vh和vl)组成，这两个结构域因其亲脂性而倾向于发生二聚化或聚集。通常通过用亲水性氨基酸置换亲脂性氨基酸来实现单体化，但是经常导致对抗原的亲和性的丧失。(参见例如borrebaeck,c.a.k.；ohlin,m.(2002).“antibodyevolutionbeyondnature”.naturebiotechnology20(12):1189–90。)如果可以保留亲和力，那么同样可在大肠杆菌、酿酒酵母或其他有机体中产生单域抗体。
可经由若干方法使单价单域抗体变为多价的。举例来说，可使编码第一sdab的cdna基因融合至编码dna序列的接头，随后为编码sdab的第二cdna等等。或者，可使编码sdab的cdna融合至编码第二蛋白质或其片段的天然多聚化或被工程化以进行多聚化的cdna。举例来说，sdab融合至iggfc区将使sdab二聚化。在串联sdab编码构建体被连接至fc编码构建体的情况下，所得融合蛋白一旦被表达将是四价的。在编码三种sdab的构建体被连接至fc编码构建体的情况下，所得融合蛋白一旦被表达将是六价的。本公开涵盖使用额外的多聚化结构域，包括胶原同三聚化和异三聚化结构域、亮氨酸拉链结构域、p53四聚化结构域、c-jun:fos异二聚肽序列、软骨寡聚基质蛋白(comp48)、三聚脂联素、三聚表面活性剂蛋白d和/或突触乙酰胆碱酯酶四聚体。
死亡受体5(trial-r2，tnfrsf10b)靶向
临床上利用trail途径进行癌症治疗的努力依赖于天然配体trail的重组型式和对dr5具特异性的抗体。在临床前体外实验中抗体激动剂靶向dr5需要交联剂。这是归因于常规抗体仅使两个dr5受体(每条重链和轻链一个)群集的事实。两个dr5受体不足以活化细胞死亡途径，因此需要交联剂。令人惊讶地，在人类癌症的临床前小鼠模型中，体内施用dr5靶向抗体在多种肿瘤类型中展示显著活性。此活性后来据证实依赖于小鼠fcγr受体。在人类中的临床研究未能重现在这些临床前小鼠模型中所见到的强烈反应。假设在人类中缺乏活性是归因于抗体交联不足。这可能是归因于免疫受损的小鼠和人类癌症患者之间的血清igg、fcγr(fcγr)和或trail浓度的差异。
本公开提供靶向dr5的多价融合蛋白，所述多价融合蛋白能够有效地使介导直接细胞死亡的dr5信号传导激动。本公开的融合蛋白可为三价、四价、五价或六价的。重要的是，本公开的融合蛋白能够独立于外源性交联剂而引发表达dr5的细胞的凋亡。
在一些实施方案中，本公开的融合蛋白合并了结合dr5的dr5bd。在优选实施方案中，结合dr5的dr5bd不结合dr4、诱饵r1、诱饵r2、骨桥蛋白或任何其他tnfrsf成员。在优选实施方案中，结合dr5的dr5bd结合人类和食蟹猴dr5。在一些实施方案中，结合dr5的dr5bd阻断dr5与其配体trail的相互作用。在其他实施方案中，结合dr5的dr5bd不阻断dr5与其配体trail的相互作用。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白合并了多个结合dr5的dr5bd，所述多个结合dr5的dr5bd识别dr5上的不同表位。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白合并了多个结合dr5的dr5bd，其中一些dr5bd阻断dr5-trail相互作用，而其他不阻断dr5-trail相互作用。在优选实施方案中，本公开的dr5靶向融合蛋白诱导肿瘤细胞的直接细胞死亡。本公开的dr5靶向融合蛋白在治疗本质上为血液学和实体肿瘤的肿瘤方面方面有效用。
示例性结合dr5的sdab
以下示出了dr5vhh(美洲驼源性的)和人源化序列，并且cdr序列在每个序列的下方示出。在一些实施方案中，使结合dr5的sdab融合至iggfc区，并且在这些实施方案中，融合蛋白为二价的，每个分子具有两个dr5结合域。在一些实施方案中，使两个结合dr5的sdab(2x)融合至iggfc区，并且在这些实施方案中，融合蛋白为四价的，每个分子具有四个dr5结合域。在一些实施方案中，使三个结合dr5的sdab(3x)融合至iggfc区，并且在这些实施方案中，融合蛋白为六价的，每个分子具有六个dr5结合域。
1f5
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2c6
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c12
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1f2
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fix-tas266
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本公开的dr5靶向分子的治疗用途还可包括施用一种或多种额外的药剂。
筛选具有所需特异性的dr5靶向分子的方法包括但不限于酶联免疫吸附分析(elisa)、酶分析、流式细胞术以及本领域中已知的其他免疫介导技术。
本公开进一步提供编码本发明融合蛋白的核酸序列并且特别是dna序列。优选地，dna序列由适合于染色体外复制的载体携带，诸如噬菌体、病毒、质粒、噬菌粒、粘粒、yac或附加体。特别地，可使用编码所需融合蛋白的dna载体来促进本文所述的制备dr5靶向分子的方法并且获得显著量的融合蛋白。可将dna序列插入合适的表达载体，即含有转录和翻译所插入的蛋白编码序列所必需的元件的载体中。可利用多种宿主-载体系统来表达蛋白编码序列。这些系统包括感染病毒(例如牛痘病毒、腺病毒等)的哺乳动物细胞系统；感染病毒(例如杆状病毒)的昆虫细胞系统；微生物，诸如含有酵母载体的酵母，或用噬菌体dna、质粒dna或粘粒dna转化的细菌。视所用的宿主-载体系统而定，可使用许多合适的转录和翻译元件中的任一种。
本公开还提供通过在引起多肽表达的条件下培养细胞来制备dr5靶向分子的方法，其中细胞包含编码本文所述的dr5靶向分子的分离的核酸分子和/或包括这些分离的核酸序列的载体。本公开提供通过在引起dr5靶向分子表达的条件下培养细胞来制备dr5靶向分子的方法，其中细胞包含编码本文所述的dr5靶向分子的分离的核酸分子和/或包括这些分离的核酸序列的载体。
可将本公开的融合蛋白(在本文中也被称为“活性化合物”)和其衍生物、片段、类似物以及同源物合并至适于施用的药物组合物中。此类组合物通常包含融合蛋白和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。本领域中的标准参考文本remington’spharmaceuticalsciences的最新版本中描述了合适的载体，该文献以引用的方式并入本文中。此类载体或稀释剂的优选实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液(ringer’ssolution)、右旋糖溶液以及5％人类血清白蛋白。也可使用脂质体和非水性载体，诸如固定油。此类介质和药剂用于药物活性物质为本领域熟知的。除了任何常规介质或药剂与活性化合物不相容之外，考虑在组合物中使用它们。还可将补充活性化合物合并至组合物中。
将本公开的药物组合物配制成与其预期施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外施用，例如经静脉内、经皮内、经皮下、经口(例如吸入)、经皮(即局部)、经粘膜以及经直肠施用。用于经肠胃外、经皮内或经皮下应用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(edta)；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的药剂，诸如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱来调节ph值，诸如盐酸或氢氧化钠。可将肠胃外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(在其中具水溶性)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophoreltm(basf,parsippany,n.j.)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在所有情况下，组合物必须无菌并且就存在易可注射性而言应为流体。它在制造和储存条件下必须稳定，并且必须防止诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇以及液体聚乙二醇等)以及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可例如通过使用诸如卵磷脂等包衣、通过在分散液的情况下维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂及抗真菌剂来防止微生物作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞(thimerosal)等。在许多情况下，在组合物中将优选包括等张剂，例如糖、诸如甘露糖醇等多元醇、山梨糖醇、氯化钠。可通过在组合物中包括延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶，来实现可注射组合物的延长吸收。
可通过按需要以所需量将活性化合物与上文所列成分中的一种或其组合一起合并在适当的溶剂中，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物合并至含有基础分散介质和来自上文所列的那些的其他所需成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，所述方法从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何额外的所需成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。可将其封装于明胶胶囊中或压制成片剂。出于口服治疗施用的目的，可将活性化合物与赋形剂合并，并且以片剂、锭剂或胶囊形式使用。还可使用流体载体来制备口服组合物以用作漱口水，其中流体载体中的化合物是经口应用并且进行漱口并吐出或咽下。可包括药学上相容的粘合剂和/或辅助材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊或锭剂等可含有以下成分中的任一种或具有类似性质的化合物：粘合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如褐藻酸、primogel或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或sterotes；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
对于通过吸入施用，以来自加压容器或分配器的气溶胶喷雾剂形式来递送化合物，所述加压容器或分配器含有合适的推进剂，例如诸如二氧化碳等气体或雾化剂。
全身施用也可以通过经粘膜或经皮手段来进行。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用适合于所要渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域中已知的，并且对于经粘膜施用来说，包括例如清洁剂、胆盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可通过使用鼻用喷雾剂或栓剂来实现。对于经皮施用，将活性化合物配制成如本领域中通常已知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或霜剂。
还可将化合物制成栓剂(例如用常规栓剂基质，诸如可可脂和其他甘油酯)或用于直肠递送的保留灌肠剂的形式。
在一个实施方案中，用将防止化合物从身体快速消除的载体来制备活性化合物，诸如控制释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可使用可生物降解、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。此类制剂的制备方法对于本领域的技术人员将是显而易见的。还可以从alzacorporation和novapharmaceuticals,inc.商购获得材料。还可使用脂质体悬浮液作为药学上可接受的载体。可根据本领域技术人员已知的例如如美国专利号4,522,811中所描述的方法来制备这些脂质体悬浮液。
将口服或肠胃外组合物配制成剂量单位形式以便于施用并且使剂量均匀是特别有利的。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为所要治疗的受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有预定量的活性化合物，所述预定量经计算与所需药物载体结合产生所需治疗效果。本公开的剂量单位形式的规格取决于并且直接依赖于活性化合物的独特特征和所要实现的特定治疗效果，以及混配此类活性化合物用于治疗个体的技术中固有的限制。
可将药物组合物与关于施用的说明书一起包括在试剂盒、容器、包装或分配器中。可将这些药物组合物与使用说明一起包括在诊断试剂盒中。
除非另外定义，否则结合本公开使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。通常，结合本文所述的细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交所使用的命名法以及其技术为本领域中熟知和常用的。使用标准技术来进行重组dna、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如电穿孔、脂质体转染)。根据制造商的说明书或如本领域中通常所实现或如本文所述来进行酶反应和纯化技术。通常根据本领域中熟知的常规方法并且如本说明书全文中所引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献所描述来执行前述技术和程序。参见例如sambrook等人.molecularcloning:alaboratorymanual(第2版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(1989))。结合本文所述的分析化学、合成有机化学以及医疗和药物化学所使用的命名法以及其实验室程序和技术为本领域中熟知和常用的那些。使用标准技术来进行化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。术语患者包括人类和兽医受试者。
如根据本公开所使用，除非另有说明，否则以下术语应理解为具有以下含义：
如本文所用，术语“靶向融合蛋白”和“抗体”可为同义词。如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，即含有特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子，以及免疫球蛋白(ig)分子的免疫活性部分。“特异性结合”或“与……免疫反应”或“针对”意味着抗体与所需抗原的一个或多个抗原决定簇反应，而不与其他多肽反应或以低得多的亲和力结合(kd>10-6)。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、dab(结构域抗体)、单链、fab、fab’和f(ab’)2片段、fv、scfv、fab表达文库以及单域抗体(sdab)片段，例如vhh、vnar、工程化vh或vk。
已知基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每一对具有一条“轻”链(约25kda)和一条“重”链(约50-70kda)。每条链的氨基末端部分包括具有约100至110或更多个氨基酸的主要负责抗原识别的可变区。每条链的羧基末端部分界定主要负责效应子功能的恒定区。一般而言，从人类获得的抗体分子与类别igg、igm、iga、ige以及igd中的任一种有关，这些类别因分子中存在的重链的性质而彼此不同。某些类别也有亚类(也称为同种型)，诸如igg1、igg2以及其他亚类。此外，在人类中，轻链可为κ链或λ链。
如本文所用，术语“单克隆抗体”(mab)或“单克隆抗体组合物”是指仅含有一种分子种类的抗体分子的抗体分子群体，所述抗体分子由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成。特别地，在所述群体的所有分子中单克隆抗体的互补决定区(cdr)为相同的。mab含有能够与以对其具独特结合亲和力为特征的抗原的特定表位发生免疫反应的抗原结合位点。
术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子中参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重(“h”)链和轻(“l”)链的n-末端可变(“v”)区的氨基酸残基形成。在被称为“高变区”的重链和轻链v区内的三个高度不同的区段位于被称为“框架区”或“fr”的更保守的侧翼区段之间。因此，术语“fr”是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间并且与其相邻的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区是相对于彼此安置于三维空间中以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合的抗原的三维表面互补，并且重链和轻链中的每一个的三个高变区被称为“互补决定区”或“cdr”。根据kabatsequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987和1991))或chothia和leskj.mol.biol.196:901-917(1987)；chothia等人.nature342:878-883(1989)的定义将氨基酸分配给每一个结构域。
本公开的融合蛋白单域抗体(sdab)片段部分在本文中可互换地称为靶向多肽。
如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合于免疫球蛋白或其片段或t细胞受体或由其特异性结合的任何蛋白质决定簇。术语“表位”包括能够特异性结合于免疫球蛋白或t细胞受体或由其特异性结合的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由化学活性表面分子集合(诸如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。当解离常数≤1μm；例如≤100nm，优选≤10nm并且更优选≤1nm时将抗体称为特异性结合抗原。
如本文所用，术语“免疫结合”和“免疫结合性质”以及“特异性结合”是指免疫球蛋白分子与免疫球蛋白对其具特异性的抗原之间产生一类非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可用相互作用的解离常数(kd)来表示，其中较小的kd代表较大的亲和力。可使用本领域中熟知的方法来定量所选多肽的免疫结合性质。一种此类方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中这些速率取决于复合搭配物的浓度、相互作用的亲和力以及在两个方向上同等地影响速率的几何参数。因此，可通过计算浓度以及缔合和解离的实际速率来确定“缔合速率常数”(k缔合)与“解离速率常数”(k解离)。(参见nature361:186-87(1993))。比率k解离/k缔合能够消除与亲和力无关的所有参数，并且等于解离常数kd。(大体上参见davies等人(1990)annualrevbiochem59:439-473)。当如通过诸如放射性配体结合分析、表面等离子体共振(spr)、流式细胞术结合分析或本领域技术人员已知的类似分析等分析所测量，平衡结合常数(kd)≤1μm、优选≤100nm、更优选≤10nm并且最优选为≤100pm至约1pm时，将本公开的抗体称为特异性结合于抗原。
优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。
保守氨基酸取代是指具有类似侧链的残基的可互换性。举例来说，具有脂肪族侧链的一组氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸以及异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸为赖氨酸、精氨酸以及组氨酸；而具有含硫侧链的一组氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
优选氨基酸取代为：(1)降低对蛋白水解的敏感性、(2)降低对氧化的敏感性、(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力、(4)改变结合亲和力以及(4)赋予或修改此类类似物的其他物理化学或功能性质的那些氨基酸取代。类似物可包括具有不是天然存在的肽序列的序列的各种突变蛋白。举例来说，可以在天然存在的序列中(优选在形成分子间接点的结构域以外的多肽部分中)进行单个或多个氨基酸取代(优选为保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应基本上改变亲本序列的结构特征(例如氨基酸置换不应倾向于打断存在于亲本序列中的螺旋，或破坏表征亲本序列的其他类型的二级结构)。proteins,structuresandmolecularprinciples(creighton编,w.h.freemanandcompany,newyork(1984))；introductiontoproteinstructure(c.branden和j.tooze编,garlandpublishing,newyork,n.y.(1991))；以及thornton等人nature354:105(1991)中描述了本领域识别的多肽二级和三级结构的实例。
如本文所用的术语“多肽片段”是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽，但其中剩余的氨基酸序列与例如从全长cdna序列所推断的天然存在的序列中的相应位置相同。片段通常为至少5、6、8或10个氨基酸长，优选为至少14个氨基酸长，更优选为至少20个氨基酸长，通常为至少50个氨基酸长，并且甚至更优选为至少70个氨基酸长。如本文所用的术语“类似物”是指包含具有至少25个氨基酸的片段的多肽，所述片段与推断的氨基酸序列的一部分具有基本同一性，并且在合适的结合条件下对dr5具有特异性结合。通常，多肽类似物相对于天然存在的序列包含保守氨基酸取代(或添加或缺失)。类似物通常为至少20个氨基酸长，优选为至少50个氨基酸长或更长，并且通常可与全长天然存在的多肽一样长。
肽类似物通常在制药工业中用作非肽药物，性质类似于模板肽。这些类型的非肽化合物被称为“肽模拟物”或“模拟肽”。fauchere,j.adv.drugres.15:29(1986)；veber和freidingertins第392页(1985)；以及evans等人.j.med.chem.30:1229(1987)。通常在计算机化分子模型化的辅助下开发此类化合物。可使用在结构上类似于治疗适用肽的肽模拟物来产生等效的治疗或预防效果。通常，模拟肽在结构上类似于范式多肽(即具有生物化学性质或药理学活性的多肽)，诸如人类抗体，但具有一个或多个肽键，所述一个或多个肽键任选通过本领域中熟知的方法被选自由以下组成的组的键联取代：--ch2nh--、--ch2s-、--ch2-ch2--、--ch＝ch--(顺式和反式)、--coch2--、ch(oh)ch2--以及-ch2so--。可利用用相同类型的d-氨基酸系统取代共有序列的一个或多个氨基酸(例如d-赖氨酸代替l-赖氨酸)来产生更稳定的肽。另外，可通过本领域中已知的方法来产生包含共有序列或基本上相同的共有序列变化型式的限制性肽(rizo和gieraschann.rev.biochem.61:387(1992))；例如通过添加能够形成使肽环化的分子内二硫键的内部半胱氨酸残基。
术语“药剂”在本文中用于表示化合物、化合物的混合物、生物大分子和/或由生物材料制得的提取物。
如本文所用，术语“标记”或“标记的”是指例如通过合并放射性标记的氨基酸或连接到具有可通过标记的亲和素(例如含有可通过光学或量热法检测的荧光标记或酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分的多肽来合并可检测标记。在某些情况下，标记或标记物还可为治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法为本领域已知的并且可以使用。用于多肽的标记的实例包括但不限于以下物质：放射性同位素或放射性核素(例如3h、14c、15n、35s、90y、99tc、111in、125i、131i)、荧光标记(例如fitc、若丹明(rhodamine)、镧系元素磷光体)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光剂、生物素基团、由二级报告子识别的预先确定的多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二次抗体的结合位点、金属结合域、表位标签)。在一些实施方案中，通过各种长度的间隔臂来连接标记以减少潜在的空间位阻。如本文所用的术语“药剂或药物”是指当适当施用给患者时能够诱导所期望的治疗效果的化合物或组合物。
在本公开中，“包含(comprises/comprising)”、“含有”、“具有”等可具有美国专利法中所赋予它们的含义，并且可意指“包括(includes/including)”等；术语“大体上由……组成”或“大体上组成”同样具有美国专利法中所赋予的含义，并且这些术语是开放性的，允许存在多于所叙述的内容，只要所叙述的内容的基本或新颖特征不因存在多于所叙述的内容而改变即可，但是排除现有技术实施方案。
“有效量”意指相对于未治疗的患者改善疾病症状所需的量。用于实践本公开以对疾病进行治疗性治疗的活性化合物的有效量视施药方式、受试者的年龄、体重以及总体健康而变化。最终，主治医师或兽医将决定适当的量和剂量方案。这个量被称为“有效”量。
“受试者”意指哺乳动物，包括但不限于人类或非人类哺乳动物，诸如牛、马、犬、啮齿动物、绵羊、灵长类动物、骆驼科或猫科动物。
如本文所用，术语“施用”是指将治疗剂转移、递送、引入或运送至需要用此类药剂治疗的受试者中的任何模式。此类模式包括但不限于经口、经局部、经静脉内、经腹膜内、经肌肉内、经皮内、经鼻内以及经皮下施用。
“片段”意指多肽或核酸分子的一部分。此部分优选含有参考核酸分子或多肽的整个长度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸或氨基酸。
本文中所提供的范围应理解为该范围内所有值的简写。举例来说，1至50的范围应理解为包括由以下组成的组中的任何数字、数字组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
除非特别陈述或由上下文明显看出，否则如本文所用，术语“一个”、“一种”以及“所述”应理解为单数或复数。除非特别陈述或由上下文明显看出，否则如本文所用，术语“或”应理解为包括性的。
除非特别陈述或由上下文明显看出，否则如本文所用，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可理解为在所陈述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％以内。除非另外由上下文清楚的，否则本文中所提供的所有数值均由术语“约”修饰。
在以下实施例中将进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求书中所描述的本公开范围。
实施例
实施例1：结合分析
使用用编码全长r5的cdna稳定转染的cho细胞系或内源性表达dr5的癌细胞系通过流式细胞术来评估dr5靶向融合蛋白的结合。将滴定系列的融合蛋白与表达dr5的细胞系(每孔约2.5-5x104个细胞)在4℃下在facs缓冲液(pbs1％bsa，0.1％nan3ph7.4)中在96孔板中一起孵育30分钟。在facs缓冲液中进行3个洗涤步骤之后，添加apc-缀合的抗人类fcγ特异性二次抗体(jacksonimmunoresearch)，并且在4℃下孵育30分钟。在facs缓冲液中再进行三个洗涤步骤之后，经由流式细胞术(iqueintellicyte)检测结合的抗体。通过elisa来测定融合蛋白与食蟹猴dr5(cynodr5)的结合，其中将与cynodr5的融合至鼠fc区(mfc)的细胞外结构域(ecd)对应的重组蛋白固定在medisorp96孔板(nunc)上。在充足的阻断和洗涤步骤之后，使用hrp-缀合的抗人类fcγ特异性二次抗体(jacksonimmunoresearch)和tmb试剂检测结合的融合蛋白，并且在a650nm下读取吸光度。
实施例2：凋亡分析
通过使用celltiter-(promegag7572)测量在16-48小时处理期后存在的atp的量来确定抗体介导的直接细胞杀伤。将癌细胞以每孔1.5-3x104个细胞、以每孔7x104个细胞接种于组织培养物处理过的96孔平底板中。测量细胞死亡的替代方法为在抗体处理期间使用incucytetm半胱天冬酶-3/7凋亡试剂(essenbioscience4440)对细胞进行荧光染色，并且使用zoom系统对荧光细胞进行定量。在一些实施方案中，融合蛋白含有多肽。所用的细胞系包括colo-205(ccl-222tm)、panc-1(crl-1469tm)、hct-116(ccl-247tm)、jl-1(dsmzacc596)、nci-h28(crl-5820tm)、nci-h460(htb-177tm)、ht-29(htb-38tm)、msto-211h(crl-2081tm)。在一些实验中，使用抗人类iggfcγ特异性二次抗体(jacksonimmunoresearch)来交联本公开的dr5靶向融合蛋白并且使其进一步群集。在其他实验中，使用6μm强力霉素(doxycycline)来使细胞对dr5介导的凋亡敏感。