本发明涉及兽用二联活疫苗，尤其涉及犬瘟热和犬细小病毒病二联活疫苗及其制备方法，属于兽用二联疫苗领域。
背景技术：
犬瘟热和犬细小病毒病是当前对我国养犬业危害严重的2种烈性传染病。
犬瘟热(caninedistemper，CD)是由犬瘟热病毒(caninedistempervirus，CDV)引起的一种高度接触性传染病，临床症状多样，容易继发其他细菌、病毒的混合感染和二次感染，死亡率可高达80％，患病动物在康复后还易留有麻痹、抽搐、癫痫样发作等后遗症。该病自1926年被发现呈世界性分布，危害我国养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业，引起大批犬、貂、狐等动物发病，经济损失惨重。近年来不断发现包括大熊猫、小熊猫以及狮、虎、豹等食肉目所有8个科、偶蹄目猪科、灵长目的猴属和鳍足目海豹等多种动物均有CD自然发病的报道。另外，人也已证实在患Pagets疾病的病人组织中检出CDV核酸。这些表明，CDV的感染范围在不断地扩大，生态学内容在不断地丰富。
犬细小病毒病(canineparovirus，CP)是由犬细小病毒(CanineParovirus，CPV)感染幼犬引起的一种急性传染病，以剧烈的呕吐、出血性肠炎、白细胞显著减少以及心肌炎为主要特征，2～4月龄幼犬易感性最强。我国自1982年证实存在犬细小病毒感染以来，在东北、华东和西南等地区的军犬、警犬、实验犬等犬群和狐狸等毛皮动物中广泛传播。由于CPV-2不断进行抗原漂移，现已分离获得CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c等多个抗原型流行毒株。近年来，随着CPV的不断变异，CPV宿主范围也在不断扩大，除感染犬、狐狸、狼等犬科动物外，还感染猫、豹、熊、虎等其它多种动物。该病发病急，病程短，传染性强，死亡率高，其发病率达50％～100％，死亡率为10％～50％，是对我国养犬业和经济动物养殖业危害极大的病毒性传染病之一，可造成严重的经济损失。
在1923年就诞生了首份犬瘟热组织灭活疫苗。Puntoni将CDV感染患有脑炎的犬脑组织通过福尔马林灭活制作成灭活组织疫苗，但CDV灭活全病毒疫苗免疫保护有限的，不能完全预防强毒感染，但是与对照相比能激活机体免疫反应抑制临床症状发展。1950年代CDV弱毒活病毒疫苗成功研制并迅速被广泛使用，极大降低了CD的发病率。常规的病毒弱化是将病毒在细胞中连续传代多次后实现的，如适应鸡胚内繁殖的Lederle株和Onderstepoort株及犬肾细胞适应株Rockborn。目前犬细小病毒疫苗主要有弱毒苗，Pfizer公司犬细小病毒病活疫苗，国内犬狂犬病、犬瘟热、副流感、腺病毒和细小病毒病五联活疫苗
Intervet公司犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗，犬瘟热、传染性肝炎、细小病毒病、副流感四联活疫苗；Merial公司犬瘟热、腺病毒病、细小病毒病、副流感病毒2型呼吸道感染四联活疫苗-犬钩端螺旋体病、黄疸出血钩端螺旋体病二联灭活疫苗；Pfizer公司犬细小病毒病活疫苗(商品名：)，犬瘟热、腺病毒2型、副流感和细小病毒病四联活疫苗(5)和犬瘟热、腺病毒2型、副流感、细小病毒病四联活疫苗-犬钩端螺旋体(犬型、黄疸出血型)二价活疫苗-犬冠状病毒病(灭活)疫苗；FortDodge的犬瘟热、腺病毒2型、细小病毒病、副流感四联活疫苗-犬冠状病毒病灭活疫苗以及国内吉林五星和杨凌均为犬狂犬病、犬瘟热、副流感、腺病毒和细小病毒病五联活疫苗等9个产品。
据不完全统计，犬瘟热和犬细小病毒病联合感染率约为10％，而现有疫苗毒株历史久远，保护率不高，毒株的免疫原性不强。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供一种犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗及其制备方法。
首先，本发明提供一种犬瘟热病毒(caninedistempervirus)弱毒疫苗株BJ/120株，其微生物保藏编号为CGMCCNo.10980，其F基因序列如SEQIDNo.1所示，H基因序列如SEQIDNo.2所示。
本发明还提供一种犬细小病毒(CanineParvovirus)弱毒疫苗株CPV/FJ/58株，其微生物保藏编号为CGMCCNo.7408，其VP2基因序列如SEQIDNo.3所示。
本发明还一种犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗，其包含微生物保藏号CGMCCNo.10980的犬瘟热病毒弱毒疫苗株以及微生物保藏号是CGMCCNo.7408的犬细小病毒弱毒疫苗株。
优选地，所述犬瘟热病毒弱毒疫苗株病毒含量不低于104.0TCID50/头份，犬细小病毒弱毒疫苗株病毒含量不低于104.0FAID50/头份。
其中，本发明犬瘟热弱毒疫苗株(BJ/120株)的培育：将分离的犬瘟热毒株BJ株在Vero细胞上连续传代至120代，获得犬瘟热细胞致弱株BJ/120株，经无菌、支原体、外源病毒检验，结果验证BJ/120株无细菌、霉菌生长，无支原体生长，纯净。
其中，本发明犬细小弱毒疫苗株(CPV/FJ/58株)的培育：将分离的犬细小毒株FJ株在DK细胞上连续传代至58代，获得犬细小病毒病细胞致弱株CPV/FJ/58株，经无菌、支原体、外源病毒检验，结果验证CPV/FJ/58株无细菌、霉菌生长，无支原体生长，纯净。
本发明还提供一种制备上述犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗的方法，其包括如下步骤：
1)分别培养所述的犬瘟热病毒弱毒疫苗株和2所述的犬细小病毒弱毒疫苗株，得到所述的2种弱毒疫苗株的病毒液；
2)分别对各弱毒疫苗株的病毒液进行病毒滴定，将各弱毒疫苗株进行混合，加入冻干保护剂，冻干即得。
其中，所述犬瘟热弱毒疫苗株的培养包括，选择经无菌、支原体、外源病毒，检验合格的Vero细胞，生长为单层，倒去培养液后，加入含1％～4％毒种的细胞维持液，置33-35℃培养，当CPE达到70-80％时收获。
其中，所述犬细小病毒弱毒疫苗株的培养包括，选择经无菌、支原体、外源病毒，检验合格的DK细胞，细胞分散后加入含0.5％～4％毒种的细胞生长液，37℃培养24～36小时，倒去培养液后加入细胞维持液，37℃继续培养当CPE达到70-80％时收获。
其中，所述冻干保护剂的配制方法：蔗糖8g，明胶5g，甘露醇2.5g，海藻糖2g，甘露醇0.3g，精氨酸0.5g，无离子水100ml，调整pH值为7.2～7.6。
其中，将混合的病毒液与冻干保护剂按1:1的体积比例进行混合。
本发明采用分离自中国病犬的野毒并经过驯化致弱的犬瘟热病毒、犬细小病毒为研究对象，依据病毒相容性研究，得到病毒混合液方式，加入冻干保护剂，制备犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗。该二联疫苗安全、有效、质量可控、适宜工业化生产。
本发明的犬瘟热病毒弱毒疫苗株BJ/120于2015年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.10980。
本发明的犬细小病毒(CanineParvovirus)弱毒疫苗株CPV/FJ/58于2013年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.7408。
本发明制苗使用的毒种为国内本土分离并致弱，具有毒种安全、免疫原性强等特点。另本发明的疫苗在2～8℃保存，有效期可达12个月。超过国内同类产品水平。本发明所制备的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗分别接种2～4月龄犬10只，免疫21日分别进行犬瘟热强毒剂量100ID50/只、犬细小病毒强毒100ID50/只，结果表明，3批疫苗对2种病的保护率均达到5/5，对照犬均5/5发病。因此，本发明犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗对预防犬瘟热、犬细小病毒病均能达到很好的效果，必将对犬瘟热和犬细小病毒病防控发挥重大作用。
附图说明
图1犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗的生产工艺路线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1生产用毒种的准备
犬瘟热病毒BJ/120株生产毒种的制备
将犬瘟热病毒CDV/BJ/120株以2％接种于Vero细胞单层，33℃培养96～120小时，细胞病变达到80％时进行收获，-20℃冻融3次后，抽样进行病毒含量测定、无菌检验、支原体检验和外源病毒检验，鉴定合格后定量分装，冻干或-40℃以下保存。
犬细小病毒CPV/FJ/58株生产毒种的制备
将犬细小病毒CPV/FJ/58株以2％接种于DK细胞，24～48小时细胞长成单层后换成含2％牛血清的MEM营养液，37℃培养96～120小时收获，转移至-20℃冻融3次后，抽样进行病毒含量测定、无菌检验、支原体检验和外源病毒检验，鉴定合格后定量分装，冻干或-40℃以下保存。
实施例2制备用病毒液制备
犬瘟热病毒液的制备
选择生长良好的Vero细胞单层，弃去营养液，将2％犬瘟热毒种加入含2％牛血清的MEM营养液中，置33℃培养，逐日观察细胞病变，当细胞病变达80％左右时收获，-20℃冻融3次后将病毒液置于-40℃以下冻存。
犬细小病毒液的制备
选择生长良好的DK细胞，经胰酶分散后，按2％比列将犬细小病毒毒种加入至细胞液中，24～48小时，待细胞形成单层后换成含2％牛血清的MEM营养液，37℃继续培养至96～120小时，将培养瓶转至-20℃冻融3次后将病毒液置于-40℃以下冻存。
实施例3犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗的制备
将实施例2所制备的犬瘟热病毒液和犬细小病毒液按体积比1:1进行混合，再与冻干保护剂按体积比1:1体积混合后，充分摇匀，定量分装于疫苗瓶中，冻干程序为-40℃6～7小时，-10℃16小时，30℃6小时，压盖、贴签。
所述冻干保护剂为：蔗糖8g，明胶5g，甘露醇2.5g，海藻糖2g，甘露醇0.3，精氨酸0.5g，无离子水100ml，调整pH值为7.2～7.6；116℃高压灭菌30分钟。
试验例1犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗免疫效力试验
1材料和方法
1.1试验用疫苗
犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗实验室产品，批号201001、201002、201003(实施例3制备)。
1.2实验动物
2～3月龄比格犬，犬瘟热、犬细小病毒中和抗体效价不高于1:4，无真菌和寄生虫感染。
1.3攻击用强毒
CDV/BJ株，CPV/QD株。
1.4试验方法
每批疫苗用注射用水稀释，肌肉接种2～3月龄比格犬10只，每只1头份，21日后分别进行犬瘟热强毒和犬细小病毒强毒的攻击，剂量100ID50/只，连同对照犬隔离观察21日。记录各组犬的发病及死亡情况。
2结果
2.1犬瘟热强毒攻毒结果
3批疫苗接种比格犬后21日，取各组犬进行犬瘟热强毒CDV/BJ株攻毒，100ID50/只，对照组5/5发病，其中1/5死亡，201001批、201002批、201003批免疫组均达5/5保护，结果见表1。
表1犬瘟热强毒攻毒保护结果
2.2犬细小强毒攻毒结果
3批疫苗接种比格犬后21日，取各组犬进行犬细小强毒CPV/QD株攻毒，100ID50/只，对照组5/5发病，其中2/5死亡，201001批、201002批、201003批免疫组均达5/5保护，结果见表2。
表2犬细小强毒攻毒保护结果
试验结论
本发明犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗接种犬后采用犬瘟热、犬细小病毒强毒攻击，保护率均达到5/5保护。
试验例2犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗同类产品比较试验
犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗实验室产品，批号201001、201002、201003；犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗，购自Intervet公司；狂犬病、犬瘟热、犬副流感、犬传染性肝炎、犬细小病毒病五联疫苗，购自吉林省五星动物保健药厂。
2月龄比格犬，犬瘟热、犬细小病毒中和抗体效价不高于1:4，无真菌和寄生虫感染。
5批疫苗用注射用水或包装稀释液稀释，肌肉接种2月龄比格犬10只，每只1头份，分别于7日、14日和21日采血测定犬瘟热和犬细小病毒中和抗体效价，并于21日后分别进行犬瘟热强毒和犬细小病毒强毒的攻击，剂量100ID50/只，连同对照犬隔离观察21日。记录各组犬的发病及死亡情况。
2.1免疫产生期试验
实验犬分别于接种疫苗后7日、14日、21日测定犬瘟热和犬细小病毒中和抗体效价，结果见表3和表4。
表3实验犬在接种疫苗后7日、14日、21日犬瘟热病毒中和抗体几何平均滴度(GMT)
表4实验犬在接种疫苗后7日、14日、21日犬细小病毒中和抗体几何平均滴度(GMT)
从表3和表4可以看出，对照犬在监测期内犬瘟热和犬细小病毒中和抗体GMT均不高于1:4。5组疫苗接种犬7日测定犬瘟热和犬细小病毒中和抗体效价，统计分析GMT，结果3批本品的抗体效价均高于intervet小犬二联疫苗和犬五联疫苗(p值＜0.05)，并且在接种后14日能达到保护性抗体水平，而其他2种疫苗均在21日才能达到。
2.2本动物攻毒试验结果
2.2.1犬瘟热强毒攻毒结果
5批疫苗接种比格犬后21日，取各组犬进行犬瘟热强毒CDV/BJ株攻毒，100ID50/只，对照组5/5发病，201001批、201002批、201003批、intervet小犬二联、吉林五星犬五联免疫组均达5/5保护，结果见表5。
表5同类产品比较犬瘟热强毒攻毒保护结果
2.2.2犬细小强毒攻毒结果
5批疫苗接种比格犬后21日，取各组犬进行犬细小强毒CPV/QD株攻毒，100ID50/只，对照组5/5发病，其中1/5死亡，201001批、201002批、201003批、intervet小犬二联、吉林五星犬五联免疫组均达5/5保护，结果见表6。
表6同类产品比较犬细小强毒攻毒保护结果
本发明犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗以及同类产品intervet小犬二联、吉林五星犬五联接种犬后，通过7日、14日、21日血清监测结果表明，本发明产品免疫产生期为14日，优于intervet和吉林五星产品，另采用犬瘟热、犬细小病毒强毒攻击，保护率均达到5/5保护。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。