本发明涉及用于改善免疫应答的刺激的方法。
发明背景
尽管有在免疫学领域中的目前知识，尤其是关于疫苗技术的知识，但没有合适的疫苗可用于针对多种病原体。hiv(人免疫缺陷病毒)、htlv(人t细胞嗜淋巴病毒)、结核病和hcv(丙型肝炎病毒)的广泛流行病仍然无法达到有效的疫苗接种，而埃博拉病毒和其他出现的病原体会威胁以压倒我们的健康护理系统。类似地，全球恐怖主义的崛起已将潜在的流行病扩展到包括致命病原体例如拉沙病毒和马尔堡病毒。
疫苗可以是预防性的(它们在实际感染发生之前给予)或治疗性的(其中它们引发或加速对已经在体内的病原体的免疫应答)。疫苗接种的两种方法要求实体免疫应答的建立。由感染或疫苗接种活化的免疫应答依赖于几种细胞类型例如t、b和抗原呈递细胞，以及几种不同分子主要是抗原、mhc分子、t和b细胞受体及许多其他的相互作用。
t辅助细胞通过由mhcii类(mhc-ii)分子呈递的抗原刺激，所述mhc-ii分子位于抗原呈递细胞的表面上。mhc-ii分子在内质网中合成。在合成期间，它们以阻止mhc-ii分子负载有自身抗原的方式与恒定链(li)组合。mhc-ii分子和恒定链通过信号序列转运至在特异性细胞隔室中的细胞表面。随着隔室通过加工其内容物而成熟，它从溶酶体发展到晚期内体(在与内吞囊泡融合后)到mhcii类隔室(miic)。内吞囊泡含有外源抗原，例如蛋白酶解切割的细菌肽片段。这些片段通过其降解制备，以负载到mhc-ii分子上。mhc-ii分子通过恒定链在2部分过程中释放，其中恒定链首先通过蛋白酶解被降解，仅留下在mhc-ii结合结构域中称为clip的肽，其次通过hla-dm分子除去clip。mhc-ii分子随后游离，以结合外源抗原，且在miic囊泡与质膜融合后，将其呈递在细胞表面上。这起始体液免疫应答，因为呈递的抗原刺激t辅助细胞的活化，这依次通过几种方式活化b细胞，这最终分化成抗体分泌细胞。
当专职抗原呈递细胞或活化组织驻留细胞呈递衍生自mhcii类上的细胞内细胞器的抗原时，t辅助细胞也可参与细胞免疫应答。以这种方式，cd4+t细胞通过分泌细胞因子和趋化因子来协调炎症，并为抗原呈递细胞提供刺激。
2类t细胞的功能是显著不同的，如由其名称所示的。细胞毒性t细胞通过细胞的直接裂解和通过分泌细胞因子例如γ-干扰素来消灭细胞内病原体和肿瘤。占优势的细胞毒性t细胞是cd8+t细胞，这也是抗原特异性的。辅助t细胞也可以裂解细胞，但其主要功能是分泌促进b细胞(抗体生产细胞)、抗原呈递细胞和其他t细胞的活性的细胞因子，并且因此广泛增强对于外源抗原的免疫应答，包括抗体介导的和细胞毒性t细胞介导的应答机制。cd4+t细胞是免疫应答中的主要辅助t细胞表型。
传统疫苗依赖于整个生物，已杀死的致病性菌株或具有减毒致病性的菌株。这些疫苗存在引入疾病的风险，它们被设计为防止减毒不足或在疫苗制备期间足够的生物在杀灭步骤中存活。而且，此类疫苗具有减少的传染力，并且通常是无足够的免疫原性的，导致来自疫苗接种的不充分保护。
已经使用分子生物学技术以试图开发基于来自病原生物的个别抗原蛋白的新疫苗。从概念上讲，使用抗原肽而不是整个生物将避免致病性，同时提供含有最多免疫原性抗原的疫苗。然而，已经证明难以选择给定蛋白或多肽的最佳抗原，而且已经发现纯肽或碳水化合物倾向于是弱免疫原。
基因(dna或rna)疫苗是开发预防性和治疗性疫苗的新的和有希望的候选物。随后的免疫应答的强度通过载体(即裸dna、病毒载体、减毒活病毒等)的效力、抗原的表达水平和重组抗原本身(即高或低亲和力mhc结合物、对于或多或少有限的t-或b-细胞库选择的结构决定簇等)的组合来确定。通常确信免疫记忆的有效诱导需要或受益于cd4+(辅助细胞)t细胞与cd8+(细胞毒性)t细胞和介导许多免疫记忆作用的b细胞的相互作用。然而，与病毒载体化的疫苗相比，常规dna疫苗的一个潜在缺点是它们在人中的低免疫原性。该低免疫原性的一个可能原因是限制细胞内形成的抗原进入mhcii途径用于抗原加工和呈递给t辅助细胞以及在专职抗原呈递细胞上产生的抗原量。
发明概述
在某些实施方案中，本发明提供了改善的免疫应答的刺激，其方式也在某些实施方案中增加应答的动力学，同时扩大和/或改善应答，同时在一些实施方案中尤其避免现有技术中描述的疫苗接种方法的上述缺点。具体而言，在此可提供用于直接、特异和快速刺激免疫系统的新型系统，以便改善所有动物的疫苗接种。
通过本发明，发现通过在恒定链内引入蛋白酶切割位点，进一步改善通过融合抗原与恒定链实现的抗病毒cd4+和cd8+t细胞应答。另外并且令人惊讶地发现，在通过蛋白酶切割融合蛋白后，融合蛋白在细胞外空间中分泌，而对分子的其他免疫刺激特性没有任何实质性的负面影响。因此，本发明的构建体提供平衡的免疫应答。
序列的描述
seqidno:1人恒定链同种型p35的氨基酸序列
seqidno:2编码人恒定链同种型p35的核苷酸序列
seqidno:3人恒定链同种型p33的氨基酸序列
seqidno:4人恒定链同种型p43的氨基酸序列
seqidno:5编码人恒定链同种型p43的核苷酸序列
seqidno:6人恒定链同种型p41的氨基酸序列
seqidno:7人恒定链同种型c的氨基酸序列
seqidno:8编码人恒定链同种型c的核苷酸序列
seqidno:9鼠恒定链p31的氨基酸序列
seqidno:10编码鼠恒定链p31的核苷酸序列
seqidno:11鼠恒定链p41的氨基酸序列
seqidno:12编码鼠恒定链p41的核苷酸序列
seqidno:51res接头的氨基酸序列
seqidno:52编码res接头的核苷酸序列
seqidno:53ha标签的氨基酸序列
seqidno:54编码ha标签的核苷酸序列
seqidno:55编码li/fur/int的核苷酸序列
seqidno:56li/fur/int的氨基酸序列
seqidno:57示例性弗林蛋白酶切割位点
seqidno:58编码sp-alb的核苷酸序列
seqidno:59sp-alb的氨基酸序列
seqidno:60编码sp-alb-19-30的核苷酸序列
seqidno:61sp-alb-19-30的氨基酸序列
seqidno:62编码li-19-30的核苷酸序列
seqidno:63li-19-30的氨基酸序列
seqidno:64编码li-fur-19-30的核苷酸序列
seqidno:65li-fur-19-30的氨基酸序列
seqidno:66ova257-264(siinfekl)肽序列
seqidno:68编码it4var19抗原的多核苷酸序列
seqidno:69编码pflcinvar30抗原的多核苷酸序列。
附图说明
图1：用不同佐剂的ova抗原的mhci表达的分析-用不同的had5-ova构建体感染后，jawsii细胞的表面上的ova的mhci呈递。
图2：用不同佐剂的ova抗原的mhci表达的分析-足垫肿胀测量，其代表在右足垫中用had5-it4var19-pfclinvar30构建体免疫后的t细胞募集。
图3：用不同佐剂的ova抗原的mhcii表达的分析。该图显示il-2水平，其代表在用不同had5-ova构建体感染并被mhcii-ova特异性的t细胞识别的jawsii细胞的表面上的ova的mhcii呈递。
图4a和4b：编码的抗原it4var19和pfclinvar30的表达的分析。(a)说明用不同的had5-it4var19-pfclinvar30病毒感染的vero细胞的sn(上清液)中通过western印迹鉴定pfclinvar30。用50moi/细胞感染vero细胞，并且48小时后收获sn。(b)说明在用had5-it4var19-pfclinvar30感染cos7细胞后，在上清液中的变性和非变性条件下通过western印迹鉴定pfclinvar30。
图5a-5d：编码的抗原it4var19和pfclinvar30的表达的分析。这些图表说明用had5-it4var19-pfclinvar30感染cos7细胞后，上清液或细胞裂解物中表达的蛋白与epcr的结合的分析。
图7a-7d：在had5疫苗接种后诱导的针对it4var19和pfclinvar30的抗体，用于比较li-fur佐剂与对照。(a)和(c)显示用ad5-li-fur-it4var19-pfclinvar30(n=5)、ad5-sp-alb-it4var19-pfclinvar30(n=5)、ad5-li-it4var19-pfclinvar30(n=5)、ad5-li-cterm-fur-it4var19-pfclinvar30(n=5)、ad5-d17-li-fur-it4var19-pfclinvar30(n=5)免疫balb/c小鼠后10周的识别it4var19的抗体的检测。将血清稀释至1:5并以两倍稀释度添加至孔中。将吸光度和稀释度绘制在log(x)轴(c)上，计算曲线下面积并绘制在(a)上。(b)和(d)显示用ad5-li-fur-it4var19-pfclinvar30(n=5)、ad5-sp-alb-it4var19-pfclinvar30(n=5)、ad5-li-it4var19-pfclinvar30(n=5)、ad5-li-cterm-fur-it4var19-pfclinvar30(n=5)、ad5-17-li-fur-it4var19-pfclinvar30(n=5)免疫balb/c小鼠后10周的识别pfclinvar30的抗体的检测。将血清稀释至1:5并以两倍稀释度添加至孔中。将吸光度和稀释度绘制在log(x)轴(d)上，计算曲线下面积并绘制在(c)上。
图8a-8b：ad5疫苗接种后诱导的针对it4var19和pfclinvar30的抑制性抗体的测量，用于比较li佐剂。(a)显示来自用ad5-li-fur-it4var19-pfclinvar30(n=5)、ad5-sp-alb-it4var19-pfclinvar30(n=5)、ad5-li-it4var19-pfclinvar30(n=5)免疫balb/c小鼠后第10周血清的抑制it4var19与epcr的结合的抗体的检测(血清稀释至1:50)。(b)显示来自用ad5-li-fur-it4var19-pfclinvar30(n=5)、ad5-sp-alb-it4var19-pfclinvar30(n=5)、ad5-li-it4var19-pfclinvar30(n=5)免疫balb/c小鼠后第10周血清的抑制pfclinvar30与epcr的结合的抗体的检测。将血清稀释至1:50。
图9a-e：ad5疫苗接种后诱导的交叉反应性抗体的鉴定。用(a)ad5-li-fur-it4var19-pfclinvar30(n=5)、(b)ad5-sp-alb-it4var19-pfclinvar30(n=5)、(c)ad5-li-it4var19-pfclinvar30(n=5)、(d)ad5-li-cterm-fur-it4var19-pfclinvar30(n=5)、(e)ad5-d17-li-fur-it4var19-pfclinvar30(n=5)通过多路复用疫苗接种后10周，在balb/c小鼠的血清中检测到交叉反应性抗体。将血清稀释至1:50并与涂覆不同cidr(富含半胱氨酸的结构域间区域)蛋白的珠粒一起孵育，然后通过发光检测与珠粒的结合。
(a)、(b)和(c)显示根据用ad5-li-fur-it4var19-pfclinvar30(n=5),ad5-sp-alb-it4var19-pfclinvar30(n=5),ad5-li-it4var19-pfclinvar30(n=5)免疫balb/c小鼠后(a)2周、(b)6周或(c)10周的识别it4var19的抗体的检测。将血清稀释至1:50。(d)显示用ad5-li-fur-it4var19-pfclinvar30(n=5)、ad5-sp-alb-it4var19-pfclinvar30(n=5)、ad5-li-it4var19-pfclinvar30(n=5)免疫c57bl/6小鼠后10周识别pfclinvar30的抗体的检测。将血清稀释至1:50。
图11a-11b：在c57bl/6小鼠中，与对照相比，在用li-fur佐剂的had5后诱导的针对it4var19和pflcinvar30的抑制性抗体。(a)和(b)显示来自用ad5-li-fur-it4var19-pfclinvar30(n=5)、ad5-sp-alb-it4var19-pfclinvar30(n=5)、ad5-li-it4var19-pfclinvar30(n=5)免疫c57bl/6小鼠后第10周血清的抑制(a)it4var19或(b)pfclinvar30与epcr的结合的抗体的检测。将血清稀释至1:50。
图12a-12c：ad5免疫后对melarv癌症的抗体应答的分析。(a)显示用ad5-li-fur-p15e(n=5)或ad5-li-fur-p15e(n=5)免疫并用2x105b16f10gp细胞攻击后计数的肺转移的数目。(b)和(c)显示在用ad5-li-fur-p15e(n=5)或ad5-li-fur-p15e(n=5)免疫c57bl/6后90天的识别p15e蛋白的抗体的检测。将血清稀释至1:25并以两倍稀释度添加至孔中。将吸光度和稀释度绘制在log(x)轴(b)上，计算曲线下面积并绘制在(c)上。
图13：恒定链的结构域的说明。
图14：不同抗原的分泌和形式。
图15：经由抑制测定法的cidr检测的说明。(1)预先混合血清和cidr蛋白。识别构象cidr的抗体将与蛋白结合。(2)用epcr(cidr的天然配体)包被板。(3)将混合血清-cidr添加板中。与血清中的抗体结合的cidr将不能与其天然配体结合并将被洗掉。未与抗体结合的cidr将结合epcr并且不会被洗掉。(4)添加识别cidr上的标签的二抗。
无信号=抗体抑制cidr与其天然配体的结合
荧光信号=抗体无法阻止cidr与其天然配体的结合。
图16：鼠p31li(上序列)和人p31li(下序列)的比对。
图17：对来自恒定链ova连接的构建体的细胞上清液的elisa的结果。
图18-20：与mhcii分子相互作用的恒定链和模型机制的说明。与膜结合的li-ag再次在内体中被吸收，因此活化cd4+t细胞。
图21a-21b：实施例中使用的不同ad5构建体的说明。(a)显示设计的5种had5载体，其全部编码it4var19-pfclinvar30(cidr1.1)和不同形式的恒定链-弗林蛋白酶或分泌信号。插入的抗原侧接人cmv启动子(hucmv)和猿猴病毒40(sv40)多腺苷酸化信号。(b)显示设计的5种had5载体，其全部编码chova和不同形式的恒定链-弗林蛋白酶。插入的抗原侧接人cmv启动子(hucmv)和猿猴病毒40(sv40)多腺苷酸化信号。
发明详述
本发明涉及疫苗，其包含核酸构建体，例如dna构建体，尤其是包含编码与抗原蛋白或肽可操作连接的恒定链的序列的核酸构建体，其中已在恒定链内引入蛋白酶的切割位点。
在第一个方面，本发明涉及包含编码以下的序列的核酸构建体：
a.与b可操作连接的至少一种恒定链或其变体，
b.至少一种抗原蛋白或肽或其抗原片段；
其中
-所述恒定链或其变体的c末端可操作连接至所述抗原蛋白或肽或其抗原片段的n末端；
-所述恒定链或其变体包含位于所述蛋白酶切割位点的c末端的蛋白酶切割位点和任选三聚化(trim)结构域。
在一个进一步方面，本发明涉及如本文所述的核酸构建体，其用于刺激免疫应答。
在又一个进一步方面，本发明涉及如本文所述的核酸构建体，其用作用于刺激免疫应答的引发物，由此增加随后施用的疫苗或共同施用的疫苗的效力。
在又一个进一步方面，本发明涉及如本文所述的核酸构建体，其用于加强免疫应答，由此增加引发剂量疫苗的效力。
在又另一个方面，本发明涉及嵌合蛋白，其包含：
-所述恒定链或其变体的c末端的部分可操作连接至所述抗原蛋白或肽或其抗原片段的n末端；且
在又另一个方面，本发明涉及包含如本文所述的核酸构建体的递送媒介物。
在又另一个方面，本发明涉及用于将本文所述的递送媒介物施用于个体的方法，其中所述施用选自针注射、基因枪、喷射注射、电穿孔、超声和流体动力学递送。
在又另一个方面，本发明涉及用于将本文所述的核酸构建体施用于个体的方法，其中所述施用选自针注射、基因枪、喷射注射、电穿孔、超声和流体动力学递送。
在又另一个方面，本发明涉及包含如本文所述的核酸构建体的细胞。
在又另一个方面，本发明涉及可以识别如本文所述的嵌合蛋白的抗体。
在又另一个方面，本发明涉及本文所述抗体在用于检测抗体结合的蛋白的测定中的用途。
在又另一个方面，本发明涉及包含编码以下的核酸序列的组合物：
a.至少一种恒定链或其变体；
-所述恒定链或其变体包含位于所述蛋白酶切割位点的c末端的蛋白酶切割位点和任选三聚化(trim)结构域，
所述组合物用作药物。
在又另一个方面，本发明涉及包含如本文所述的递送媒介物的疫苗组合物，其用作药物。
在又另一个方面，本发明涉及包含如本文所述的递送媒介物的组合物在制备药物中的用途。
在又另一个方面，本发明涉及如本文所述的递送媒介物，其用于生产疫苗。
在又另一个方面，本发明涉及包含核酸构建体的病毒载体，所述核酸构建体包含编码以下的序列：
c.与d可操作连接的至少一种恒定链，
d.至少一种抗原蛋白或肽或其抗原片段；
在又另一个方面，本发明涉及包含核酸构建体的腺病毒载体，所述核酸构建体包含编码以下的序列：
e.与f可操作连接的seqidno:1-8中任一个的至少一种恒定链，
f.至少一种抗原蛋白或肽或其抗原片段；
-所述恒定链的c末端可操作连接至所述抗原蛋白或肽或其抗原片段的n末端；
-所述恒定链包含位于所述蛋白酶切割位点的c末端和所述抗原蛋白或肽或其抗原片段的n末端的弗林蛋白酶切割位点和的三聚化(trim)结构域。
在又另一个方面，本发明涉及部件试剂盒，其包含：
a.包含如本文所述的核酸构建体的组合物；
b.用于施用所述组合物的医疗仪器或其他装置；和
c.关于如何使用所述部件试剂盒的说明书。
在又另一个方面，本发明涉及用于诱导动物中的免疫应答的方法，其包括向所述动物施用如本文所述的疫苗组合物。
在又另一个方面，本发明涉及用于遗传免疫的方法，其包括以下步骤：
-制备如本文所述的核酸构建体，
-将所述核酸构建体施用于个体。
在又另一个方面，本发明涉及用于增加疫苗的效力的方法，其包括以下步骤：
a.提供如本文所述的核酸构建体，或如本文所述的组合物；
b.通过将步骤a)的核酸构建体或组合物施用于个体来引发个体的免疫系统，由此刺激个体中的免疫应答。
定义
腺病毒：一组包含双链dna的病毒。腺病毒可以进行遗传修饰，使得其不能复制或条件性不能复制。以这种形式，作为腺病毒构建体或腺病毒载体，它们可以用作基因递送媒介物用于疫苗接种或基因疗法。
佐剂：其与施用的免疫原决定簇/抗原/核酸构建体的混合物增加或以其他方式改善对于所述决定簇的免疫应答的任何物质。
氨基酸：任何合成或天然存在的氨基羧酸，包括在肽和多肽包括在体内合成的蛋白和酶中存在的任何氨基酸，从而包括氨基酸的修饰。术语氨基酸在本文中与术语“氨基酸残基”同义使用，其意欲包含如所述已与至少一个其他种类例如2、例如3、例如超过3个其他种类反应的氨基酸。通用词氨基酸包括天然和非天然氨基酸，其中任何可以以“d”或“l”异构形式存在。通常，该术语是指20种常见的天然存在的氨基酸中的任何一种。
抗体：免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的活性部分。抗体是例如完整免疫球蛋白分子或其保留免疫学活性的片段。
抗原：可以与克隆分布的免疫受体(t细胞或b细胞受体)结合的任何物质。通常是肽、多肽或多聚体多肽。抗原优选能够引发免疫应答。
载体：抗原与之偶联以帮助诱导免疫应答的实体或化合物。
嵌合蛋白：由核苷酸序列编码的遗传工程改造蛋白，所述核苷酸序列通过将2种或更多种完整或部分基因或一系列(非)随机核酸剪接在一起制备。
补体：其作用于“补充”抗体工作的复杂系列的血液蛋白。补体破坏细菌，产生炎症，且调节免疫反应。
细胞因子：生长或分化调节剂，在本文中非限定使用，并且不应限制本发明和权利要求的解释。除细胞因子外，粘附或辅助分子或其任何组合可以单独或与细胞因子组合采用。
ctl：细胞毒性t淋巴细胞。表达cd8连同t细胞受体，且因此能够响应由i类分子呈递的抗原的t细胞亚组。
递送媒介物：由此核苷酸序列或多肽或两者可以从至少一种介质转运到另一种介质(例如病毒载体)的实体。
片段：用于指出核酸或多肽的非全长部分。因此，片段自身也分别是核酸或多肽。
个体：禽、哺乳动物、鱼、两栖类或爬行类的任何物种或亚种。更合适地，哺乳动物，更合适地，人。
恒定链：与内质网和后续细胞隔室中的mhcii分子结合且稳定其的整合膜蛋白糖蛋白。此处术语恒定链涵盖所有天然存在或人工生成的与人恒定链具有特定相似性的全长或片段化的同源基因和蛋白。恒定链在本文中缩写为li。
分离的：与本文公开的核酸、多肽或抗体结合使用的‘分离的’指已鉴定且从其天然的、一般的细胞环境的组分中分离和/或回收的那些。本发明的核酸、多肽和抗体优选是分离的，并且本发明的疫苗和其他组合物优选包含分离核酸、多肽或分离抗体。
mhc：主要组织相容性复合物，存在mhc的2个主要亚类，i类和ii类。
核酸：传送遗传信息的核苷酸链或序列。就本发明而言，核酸是脱氧核糖核酸(dna)。
核酸构建体：遗传工程改造的核酸。一般包含几种元件例如基因或其片段、启动子、增强子、终止子、多聚腺苷酸尾、接头、多聚接头、可操作接头、多克隆位点(mcs)、标记、终止密码子、其他调节元件、内部核糖体进入位点(ires)或其他。
可操作接头：以保证核酸或多肽的生物加工的方式使核酸构建体或(嵌合)多肽的2个部分结合在一起的核苷酸或氨基酸残基序列。
病原体：疾病的特异性病原体，特别是生物剂例如病毒、细菌、朊病毒或寄生虫，其可以引起对其宿主的疾病，也被称为传染剂。
肽：限定序列且由酰胺键连接的多个共价连接的氨基酸残基。该术语与寡肽和多肽类似地使用。天然和/或非天然氨基酸可以通过肽键或通过非肽键连接。术语肽还包含通过化学或酶催化反应引入的翻译后修饰，如本领域已知的。该术语可以指多肽变体或片段。
药物载体：也称为赋形剂或稳定剂，在采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或个体是无毒的。通常生理学上可接受的载体是ph缓冲的水性溶液。生理学上可接受的载体的实例包括缓冲液例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如edta；糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子例如钠；和/或非离子表面活性剂例如tween.tm.、聚乙二醇(peg)和pluronics.tm。
多个：至少2个。
启动子：rna聚合酶在其上结合以起始通过一种或多种附近结构基因的信使rna转录的dna链中的结合位点。
信号肽：决定蛋白在细胞中的最终定位的短氨基酸序列，也被称为分选肽。
sirna：小干扰rna(sirna)，其靶向(以序列特异性方式)内源rna用于降解，由此减少基因产物的量。
表面活性剂：能够减少它溶解于其中的液体的表面张力的表面活性试剂。表面活性剂是包含其为亲水的极性基团和其为疏水的非极性基团，并且通常由脂肪链组成的化合物。
疫苗：能够在动物中诱导免疫应答的物质或组合物。在该正文中也被称为免疫原性组合物。免疫应答是在生物中诱导记忆的免疫应答(体液/抗体和/或细胞免疫应答)，导致传染剂由二次而不是初次应答对抗，从而减少其对宿主生物的影响。本发明的疫苗可以作为预防和/或治疗药物给予。组合物可以包含下述中的一种或多种：一种或多种抗原、包含与li可操作地连接的一种或多种抗原的核酸构建体、载体、佐剂和药物载体。
变体：给定参考核酸或多肽的‘变体’指这样的核酸或多肽，其展示出与所述参考核酸或多肽的一定序列同源性/同一性程度，但不同于所述参考核酸或多肽。
免疫应答
疫苗可以在预防上使用：它们在实际感染发生前给予；或在治疗上使用：其中它们引发或加速对已在体内的病原体的免疫应答。2种疫苗接种方法要求实体免疫应答的建立。通过感染或疫苗接种活化的免疫应答依赖于几种细胞类型例如t、b和抗原呈递细胞，以及几种不同分子主要是抗原、mhc分子、t和b细胞受体及许多其他的相互作用。
t辅助细胞通过由mhcii类(mhc-ii)分子呈递的抗原刺激，所述mhc-ii分子位于抗原呈递细胞的表面上。mhc-ii分子在内质网中合成。在合成期间，它们以阻止mhc-ii分子负载有自身抗原的方式与恒定链(li)组合。mhc-ii分子通过恒定链中的信号序列转运至在特异性细胞隔室中的细胞表面。随着隔室通过加工其内容物而成熟，它从溶酶体发展到晚期内体(在与内吞囊泡融合后)到mhcii类隔室(miic)。内吞囊泡包含外源抗原，例如蛋白酶解切割的细菌肽片段。这些片段通过其降解制备，以负载到mhc-ii分子上。mhc-ii分子通过恒定链在2部分过程中释放，这时恒定链首先通过蛋白酶解被降解，仅留下在mhc-ii结合结构域中称为clip的肽，其次通过hla-dm分子除去clip。mhc-ii分子随后游离，以结合外源抗原，且在miic囊泡与质膜融合后，将其呈递在细胞表面上。这起始体液免疫应答，因为呈递的抗原刺激t辅助细胞的活化，这依次通过几种方式活化b细胞，这最终分化成抗体分泌细胞。
2类t细胞的功能是显著不同的，如由其名称所示的。细胞毒性t细胞通过细胞的直接裂解和通过分泌细胞因子例如γ-干扰素来消灭细胞内病原体和肿瘤。占优势的细胞毒性t细胞是cd8+t细胞，这也是抗原特异性的。辅助t细胞也是裂解细胞，但其主要功能是分泌促进b细胞(抗体生产细胞)和其他t细胞的活性的细胞因子，并且因此它们广泛增强对于外源抗原的免疫应答，包括抗体介导的和细胞毒性t细胞介导的应答机制。cd4+t细胞是免疫应答中的主要辅助t细胞表型。
核酸构建体
本发明的一个方面涉及核酸构建体，其包含编码与至少一种抗原蛋白或肽或其抗原片段可操作连接的至少一种恒定链或其变体的序列；其中所述恒定链或其变体的c末端可操作连接至所述抗原蛋白或肽或其抗原片段的n末端，且其中所述恒定链或其变体包含位于所述蛋白酶切割位点的c末端的蛋白酶切割位点和任选三聚化(trim)结构域。
核酸构建体应理解为遗传工程改造的核酸。核酸构建体可以是非复制的且线性的核酸、环状表达载体、自主复制质粒或病毒表达载体。核酸构建体可以包含几种元件，例如但不限于基因或其片段、启动子、增强子、终止子、多聚腺苷酸尾、接头、多聚接头、可操作接头、多克隆位点(mcs)、标记、终止密码子、内部核糖体进入位点(ires)和用于整合的宿主同源序列或其他限定元件。应当理解根据本发明的核酸构建体可以包含上述元件的任何组合的所有或亚组。用于工程改造核酸构建体的方法是本领域众所周知的(参见例如，molecularcloning：alaboratorymanual，sambrook等人，编辑，coldspringharborlaboratory，第2版，coldspringharbor，n.y.，1989)。
在一个实施方案中，构成核酸构建体的核酸残基可以被修饰。所述修饰可以选自：乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、核糖基化、硫化及其他。
在一个实施方案中，根据本发明的核酸构建体可以由dna组成。在另一个实施方案中，核酸构建体可以由选自下述的核酸组成：脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)、锁核酸(lna)、肽核酸(pna)、嵌入核酸(ina)、扭曲嵌入核酸(tina)、己糖醇核酸(hna)、阿糖核酸(ana)、环己烷核酸(cna)、环己烯基核酸(cena)、甘油核酸(gna)、苏糖基核酸(tna)、缺口-聚体、混合-聚体、吗啉代类物质或其组合。
密码子优化和简并核酸序列
功能蛋白在异源宿主中的表达是现代生物技术的基石。不幸的是，许多蛋白难以在其原始背景外表达。它们可以包含表达限制性调节元件，来自使用非经典核苷酸编码的生物，或来自具有在所需宿主中很少使用的密码子的普遍基因(generife)。基因合成速度和效率中的改善已致使可行的完整基因重新设计用于最大限度的蛋白表达。例如，当在研究下的基因的密码子频率与宿主表达系统的密码子频率匹配时，蛋白表达可以显著改善。例如，重新设计策略可以不仅包括最佳密码子偏好的使用，还包括mrna结构元件的改变以及翻译和起始区的修饰。用于密码子优化的技术是本领域技术人员已知的，并且可以通过商业供应者例如genscriptcorporation进行。
应当理解根据本发明的包含恒定链或其变体的核酸构建体可以以任何方式进行密码子优化，以便通过翻译成蛋白即氨基酸产生构成根据本发明的恒定链或其变体的氨基酸序列，所述恒定链对应于seqidno:1-50且更合适地1-8(人变体链)中的任一者中公开的氨基酸序列。
同样地，根据本发明的包含恒定链的核酸构建体可以以任何方式进行密码子优化，以便通过翻译成蛋白即氨基酸产生构成根据本发明的恒定链或其变体的氨基酸序列，所述恒定链对应于其中核酸构建体可以用于引发免疫应答的任何动物的氨基酸序列；包括任何脊椎动物、哺乳动物、鱼或禽。
替换很少使用的密码子：一般而言，基因包含的罕见密码子越多，异源蛋白将在那种特定宿主系统内以合理水平表达的可能性越小。如果罕见密码子成簇或在蛋白的n末端部分中出现，则这些水平变得甚至更低。用更紧密地反映宿主系统的密码子偏好而不改变氨基酸序列的其他密码子替换罕见密码子可以增加功能蛋白表达水平。
消除问题密码子：生物使用小于5%-10%时机的任何密码子都可能引起问题，不管它来自何处。再次，紧密或相邻密码子对蛋白表达比它们分开可以具有更大的影响。消除罕见密码子和可以作为终止信号阅读的密码子可以阻止低表达或不存在表达的情况。
在哺乳动物宿主中表达病毒蛋白：如果基因正确制备，甚至病毒基因也可以在哺乳动物细胞系中成功表达。病毒基因的密集信息负荷频繁导致重叠的读码框。许多病毒基因还在编码序列内编码顺式作用的负调节序列。病毒基因可以重新合成，不仅只表达所需蛋白，还破坏调节元件，从而增强蛋白产生。病毒密码子优化在dna疫苗研究中是特别有用的，因为它增加靶的免疫原性。
其他限制：尽管密码子偏好在基因表达中发挥很大作用，但表达载体和转录启动子的选择也是重要的。在蛋白n末端区域周围的核苷酸序列对于罕见密码子的存在和紧邻起始aug的密码子的特性是特别敏感的。在翻译和mrna稳定性之间还存在一定相互影响。
遗传密码的简并性：根据上文可见遗传密码具有冗余性但不具有多义性(ambiguity)。例如，尽管密码子gaa和gag都指定谷氨酸(冗余性)，但其中无一指定任何其他氨基酸(无多义性)(关于完全关联参见下文密码子表)。编码一种氨基酸的密码子可以在其3个位置中的任何中不同。遗传密码的简并性是解释沉默突变的存在的原因。因为4种碱基的三联体密码指定20种氨基酸和终止密码子，所以产生简并性。
该表显示20种氨基酸、起始和终止密码子和64种可能密码子。mrna的方向是5'到3'。
同义取代：沉默突变或取代是不导致对蛋白的氨基酸序列的改变的dna突变。它们可以在非编码区中出现(在基因外或在内含子内)，或它们可以以不改变最终氨基酸序列的方式在外显子内出现。短语沉默突变或取代通常可与短语同义突变或取代互换使用；然而，同义突变或取代是前者的子范畴，仅在外显子内出现。
应当理解根据本发明的包含恒定链或其变体的核酸构建体可以包含同义取代，以便通过翻译成蛋白即氨基酸产生构成根据本发明的恒定链或其变体的氨基酸序列，所述恒定链对应于seqidno:1-50或更合适地seqidno:1-8(人变体链)中的任一者中公开的氨基酸序列。
同样地，根据本发明包含恒定链的核酸构建体可包含同义取代，以便通过翻译成蛋白即氨基酸产生构成根据本发明的恒定链或其变体的氨基酸序列，所述恒定链对应于其中核酸构建体可以用于引发免疫应答的任何动物的氨基酸序列；包括任何脊椎动物、哺乳动物、鱼或禽。
非同义取代成同义氨基酸：非同义取代引起氨基酸中的改变。然而，氨基酸根据所述氨基酸的性质分组，并且一个氨基酸由另一个氨基酸的取代可以对包含所述氨基酸的蛋白的功能或性质没有影响(如果取代导致同义氨基酸)。此类取代可以指示保守取代或突变：dna或rna序列中的改变导致一个氨基酸由生物化学相似的氨基酸替换。
因此，应当理解根据本发明包含恒定链或其变体的核酸构建体可以包含非同义取代，以便通过翻译成蛋白即氨基酸产生构成恒定链变体的氨基酸序列，其中所述非同义取代导致其为同义的一个或多个氨基酸的取代。
同义取代可以包含疏水性氨基酸由另一个疏水性氨基酸的取代；亲水性氨基酸由另一个亲水性氨基酸的取代；极性氨基酸由另一个极性氨基酸的取代；非极性氨基酸由另一个非极性氨基酸的取代；带正电的氨基酸由另一个带正电的氨基酸的取代；带负电的氨基酸由另一个带负电的氨基酸的取代；中性氨基酸由另一个中性氨基酸的取代；多重性(ambiguous)氨基酸由其配对多重性荷电氨基酸的取代，例如异亮氨酸和亮氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸以及谷氨酰胺和谷氨酸；芳香族氨基酸由另一个芳香族氨基酸的取代；脂肪族氨基酸由另一个脂肪族氨基酸的取代；或任何氨基酸由丙氨酸的取代。这些取代可以指示等值取代。
剪接变体
可变剪接是rna剪接变异机制，其中初级基因转录物(前mrna)的外显子分离且重新连接，以便产生可变核糖核苷酸排列。这些线性组合随后经历翻译过程，其中指定氨基酸的特定和独特序列，导致同种型蛋白或剪接变体。以这种方式，可变剪接使用遗传表达以促进更多样的蛋白的合成。在真核生物中，可变剪接是朝向更高效率的重要步骤，因为信息可以经济得多地被贮存。几种蛋白可以在其长度在原核生物编码方式中只够2种蛋白的dna序列中编码。
在一个实施方案中，本发明的核酸构建体可以这样设计，以便产生多重抗原肽或抗原肽的片段和/或多重恒定链或其变体。
在一个实施方案中，根据本发明的核酸构建体包括抗原肽或所述抗原肽的片段的至少1、例如2、例如3、例如4、例如5、例如6、例如7、例如8、例如9、例如10、例如11、例如12、例如13、例如14、例如15、例如16、例如17、例如18、例如19、例如20种剪接变体。
超过一种抗原肽剪接变体可以包含相同或不同的抗原肽。
在另一个实施方案中，根据本发明的核酸构建体包含恒定链或其变体的至少1、例如2、例如3、例如4、例如5、例如6、例如7、例如8、例如9、例如10、例如11、例如12、例如13、例如14、例如15、例如16、例如17、例如18、例如19、例如20种剪接变体。
合适地，本发明的构建体包含单个恒定链或其变体和单个抗原肽或所述抗原肽的片段。
超过一种恒定链剪接变体可以包含相同或不同恒定链或其变体。
在一个实施方案中，恒定链的至少一种剪接变体包含天然全长恒定链。在另一个实施方案中，恒定链的至少一种剪接变体包含恒定链的变体。在另外一个实施方案中，恒定链的至少一种剪接变体包含恒定链的变体，其中所述li不包含li-key区域的lrmk氨基酸残基。在另一个实施方案中，恒定链的至少一种剪接变体包含恒定链的变体，其中所述li不包含clip结构域的m81和m99残基。在一个实施方案中，li-key区域的lrmk氨基酸残基已被缺失或取代。在一个进一步实施方案中，其恒定链或其变体不包含clip结构域的m81和m99残基。
由此可见剪接变体可以包含相同或不同抗原肽和/或相同或不同恒定链或其变体的任何组合。
以这种方式，可能的是“改组”(“shuffle”)包含恒定链的不同结构域或区域的序列(外显子)，以便通过可变剪接获得恒定链的变体。以这种方式，还可能的是“改组”包含一种或多种抗原肽的不同结构域或区域的序列(外显子)，以便通过可变剪接获得一种或多种所述抗原肽的变体。
恒定链
术语“恒定链”，也称为“li”或“cd74”，是指非多态的ii型整合膜蛋白。该蛋白在淋巴细胞成熟和适应性免疫应答中具有多种功能；具体地，li确保新合成的mchii靶向至内吞作用途径，其中该复合物可以遇到抗原肽。(pietersj.(1997)curr.opin.immunol.,9:8996)。另外，已显示li作为i类mhc分子伴侣发挥作用(morris等人(2004)immunol.res.,30:171-179)且通过其核内体靶向性序列，促进针对共价连接的抗原的cd4+而非cd8+t细胞的刺激(diebold等人(2001)genether.8:487-493)。
恒定链已经在几种生物例如鸡、牛、狗、小鼠、大鼠和人中表征。在一个实施方案中，恒定链是脊椎动物起源的，更优选是哺乳动物起源的，且最优选是人起源的。采用的恒定链优选是接受疫苗接种的生物的恒定链。在一个实施方案中，所述恒定链和治疗的宿主生物或接收者属于相同物种。
对于鼠恒定链，仅已知两种同种型(p31和p41)分别对应于人恒定链同种型p33和p41。seqidno:9和seqidno:10分别对应于鼠恒定链p31同种型的氨基酸序列和核酸序列。seqidno:11和seqidno:12分别对应于鼠恒定链p41同种型的氨基酸序列和核酸序列。合适地，恒定链的片段衍生自恒定链的小鼠p31或p41同种型。
在一个实施方案中，所述恒定链是seqidno:1-50中任一个中所述的多肽序列。更合适地，seqidno:1-8中任一个的人恒定链。
恒定链的变体
恒定链的变体与恒定链(例如seqidno:1-50的恒定链序列中的任何一个或多个或更合适地seqidno:1-8的人恒定链)共有序列同一性水平，或者可以是恒定链的片段(例如seqidno:1-50的恒定链序列中的任何一个或多个或更合适地seqidno:1-8的人恒定链)。
在一个实施方案中，恒定链的变体是与seqidno:1-50中任何一个或多个或更合适地seqidno:1-8的人恒定链共有至少80%、更合适地至少85%、更合适地至少90%、更合适地至少95%、更合适地至少97%、更合适地至少98%、更合适地至少99%同一性的多肽序列。
在一个实施方案中，恒定链是来自如seqidno:3中的任一个所示恒定链的任何部分的至少40个氨基酸的片段。这包括包含下述残基的片段：残基1-40、10-50、20-60、25-65、30-70、35-75、40-80、45-85、50-90、55-95、60-100、65-105、70-110、75-115、80-120、85-125、90-130、95-135、100-140、105-145、110-150、115-155、120-160、125-165、130-170、135-175、140-180、145-185、150-190、155-195、160-200,165-205、170-210和175-216。它还包括如上文列出中的任何扩大至其任一侧的高达5个残基的片段。它进一步包括至少50个残基、至少60个残基、至少70个残基、至少80个残基、至少90个残基、至少100个残基、至少110个残基、至少120个残基、至少130个残基、至少140个残基、至少150个残基、至少160个残基、至少170个残基、至少180个残基至少190个残基、至少200个残基和至少210个残基的片段。
在本发明的范围内包括与seqidno:3具有至少85%序列同一性、例如至少90%序列同一性、例如至少91%序列同一性、例如至少92%序列同一性、例如至少93%序列同一性、例如至少94%序列同一性、例如至少95%序列同一性、例如至少96%序列同一性、例如至少97%序列同一性、例如至少98%序列同一性、例如99%序列同一性的上述片段中的任何。
合适地，所述恒定链或其变体能够增强对抗原蛋白或肽或其抗原片段的免疫应答。
多肽和多核苷酸序列比较
对于序列比较，一个序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列登入计算机中，指定随后的坐标(如果需要的话)，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定可选参数。序列比较算法随后基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
如本文所用的“比较窗口”是指这样的区段，其中在两条序列最优比对后，序列可以与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对的方法是本领域所众所周知的。用于比较的序列最优比对可以如下进行，例如通过smith&waterman,adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过needleman&wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过pearson&lipman,proc.nat’l.acad.sci.usa85:2444(1988)的搜索相似性方法，通过这些算法的计算机化实现(gap、bestfit、fasta、和tfasta，于wisconsingeneticssoftwarepackage中,geneticscomputergroup,575sciencedr.,madison,wi)，或通过手动比对和目检(例如参见，currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel等人,编1995supplement))。
blast算法还进行两条序列之间的相似性的统计分析(参见例如,karlin&altschul,proc.nat’l.acad.sci.usa90:5873-5787(1993))。由blast算法提供的相似性的一种量度是最小和概率(p(n))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小和概率小于约0.2，更优选小于约0.01且最优选小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
序列之间的“差异”是指与第一序列相比，在第二序列的位置中的单个残基的插入、缺失或取代。两个序列可以含有1个、2个或更多个此类差异。在与第一序列同一(100%序列同一性)的第二序列中的插入、缺失或取代导致降低的序列同一性百分比。例如，如果同一序列是9个残基长，则第二序列中的一个取代导致88.9%的序列同一性。如果同一序列是17个氨基酸残基长，则第二序列中的两个取代导致88.2%的序列同一性。
或者，为了将第一参考序列与第二比较序列进行比较的目的，可以确定为了产生第二序列向第一序列做出的添加、取代和/或缺失的数目。添加是将一个残基添加至第一序列中(包括在第一序列的任一个末端处的添加)。取代是用一个不同残基取代第一序列中的一个残基。缺失是从第一序列缺失一个残基(包括在第一序列的任一个末端处的缺失)。
在一些实施方案中，至少一种恒定链的至少一个区域、肽或结构域被添加至至少一种恒定链的区域、肽或结构域，从至少一种恒定链的区域、肽或结构域除去，或取代至少一种恒定链的区域、肽或结构域。所述区域、肽或结构域可以衍生自至少一种恒定链，或衍生自另一种蛋白。其也可以是合成的。
在一个实施方案中，信号肽被添加至编码恒定链的序列，从编码恒定链的序列除去，或替换编码恒定链的序列。信号肽是决定蛋白在细胞中的最终定位的短氨基酸序列，也被称为分选肽。决定蛋白至亚细胞隔室例如内质网、高尔基体和各种隔室包括高尔基体、核、质膜、线粒体及其中的各种空间和膜、过氧化物酶体、溶酶体、胞内体和分泌囊泡的信号肽都包括在本发明的范围内。一个优选实施方案包括单独的恒定链的溶酶体靶向序列。另一个优选的实施方案仅包含恒定链的key区。所述信号肽可以衍生自恒定链。
在一些实施方案中，trim结构域被添加至至少一种恒定链的trim结构域，从至少一种恒定链的trim结构域除去，或替换至少一种恒定链的trim结构域。trim结构域是三聚化结构域，其负责恒定链的三聚化。seqidno:3中所示的人恒定链的trim结构域对应于跨越残基134至208的区域。seqidno:9中所示的鼠恒定链的trim结构域对应于跨越残基118至192的区域。
在一个实施方案中，所述trim结构域衍生自恒定链，例如在恒定链中发现的天然trim结构域。合适地，trim结构域具有与seqidno:1-50、更合适地seqidno:1-8中所述的恒定链序列中的trim结构域相同的序列。在另一个实施方案中，其衍生自另一种蛋白。在又另一个实施方案中，其是合成的。在一些实施方案中，添加至恒定链的trim结构域、从恒定链的trim结构域除去或替换恒定链的trim结构域的trim结构域仅包含trim结构域。在其他实施方案中，其包含trim结构域连同n末端相邻序列或c末端相邻序列，而没有恒定链的任何其他区域或结构域。其他优选的实施方案仅包含trim区的n末端或c末端相邻序列，但没有trim区本身。相邻意指c末端侧的trim区的10个残基内、20个残基内或24个残基内的任何氨基酸，或n末端侧的trim区的10个残基内、trim区内的20个残基内、30个残基内、40个残基内、50个残基内、75个残基内或100个残基内的氨基酸。
另一个实施方案涉及至少一种恒定链的clip区的除去、添加或替换。如上所述，clip区的添加或替换包括用来自相同或其他生物的恒定链的clip区或来自相同或其他生物的clip区的变体来添加或替换在选择的一种或多种恒定链的变体中的现有clip区的选项。如由上文可见，变体clip区可以是特异性生成的clip区的突变体形式，通过单个或多个核酸取代、缺失或添加生成。一个优选实施方案包括单独的clip区，或连同n末端相邻序列或c末端相邻序列的clip区，不含恒定链的任何其他区域或结构域。其他优选实施方案包括单独的clip区的n末端或c末端相邻序列，但不含clip区自身。相邻意指在clip区的10个残基内、在clip区的20个残基内、在30个残基内、在40个残基内、在50个残基内、在75个残基内或在100个残基内的任何氨基酸。
另一个实施方案涉及至少一种恒定链的内体分选信号的除去、添加或替换。如上所述，内体分选信号的添加或替换包括用来自相同或其他生物的恒定链的内体分选信号或来自相同或其他生物的内体分选信号的变体添加或替换所选择的一种或多种恒定链的变体中的现有内体分选信号的选项。如上所述，变体内体分选信号可以是通过单个或多个核酸取代、缺失或添加生成的特定生成的内体分选信号的突变形式。一个优选实施方案包含单独的内体分选信号，或内体分选信号连同n末端相邻序列或c末端相邻序列，而没有恒定链的任何其他区域或结构域。其他优选的实施方案仅包含内体分选信号的n末端或c末端相邻序列，但没有内体分选信号本身。相邻意指内体分选信号的10个残基内、内体分选信号的20个残基内、30个残基内、40个残基内、50个残基内、75个残基内或100个残基内的任何氨基酸。
在一个实施方案中，跨膜结构域被添加至编码恒定链的序列，从编码恒定链的序列除去，或替换编码恒定链的序列。跨膜结构域是短氨基酸序列，其允许蛋白锚定在细胞膜中，使得其嵌入其中。
在本发明的一个实施方案中，li的跨膜结构域的所有或部分可以由来自任何其他蛋白例如趋化因子受体ccr6tm6的相应区段替换。
在本发明的另一个实施方案中，li的跨膜结构域的所有或部分可以由来自趋化因子受体ccr6tm6的相应区段替换。
在一些实施方案中，恒定链片段可以进一步包含允许或便于片段锚定至膜的肉豆蔻酰化位点。
在具体实施方案中，所述恒定链片段包含信号肽结构域、跨膜结构域和三聚化结构域。合适地，所述跨膜结构域具有与seqidno:1-50、更合适地seqidno:1-8中任一个中的跨膜结构域相同的序列。所述跨膜结构域可以包含跨越seqidno:3的残基50至115的区域。
蛋白酶切割位点
如本文所用，蛋白酶切割位点是指细胞内蛋白酶切割位点。本文公开了包含编码与至少一种抗原蛋白或肽或其抗原片段可操作连接的至少一种恒定链或其变体的序列的核酸，其中所述恒定链的c末端可操作连接至所述抗原蛋白或肽或其抗原片段的n末端，且其中所述恒定链或其变体包含蛋白酶切割位点。
蛋白酶切割位点被理解为由本文公开的核酸编码的恒定链内的氨基酸的序列，其中氨基酸序列可以被细胞内蛋白酶识别和加工。换言之，多肽包含允许蛋白酶在多肽内进行肽键的水解的位点。合适地，所述蛋白酶切割位点对于本发明的构建体是异源的，即不天然存在于构建体的组分(即所述恒定链或抗原蛋白或肽或其抗原片段)内。合适地，切割发生在反式高尔基体网络中。
所述蛋白酶切割位点可以被任何细胞内蛋白酶识别。在一些实施方案中，所述细胞内蛋白酶是内质网的蛋白酶或反式高尔基体网络蛋白酶(最合适地反式高尔基体网络蛋白酶)，合适地选自弗林蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶。弗林蛋白酶是属于枯草杆菌蛋白酶样原蛋白转化酶的家族的蛋白酶，其将潜在的前体蛋白加工成其生物活性产物。弗林蛋白酶是一种钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶，其可以在其配对的碱性氨基酸加工位点处有效地切割前体蛋白。弗林蛋白酶在高尔基体中富集，其中其发挥功能以将其他蛋白切割成其成熟的活性形式。弗林蛋白酶切割碱性氨基酸靶序列的紧靠下游的蛋白。除了加工细胞前体蛋白以外，弗林蛋白酶还被许多病原体利用。例如，病毒例如hiv、流感和登革热病毒的包膜蛋白必须被弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样蛋白酶切割以变得完全有功能。炭疽毒素、假单胞菌外毒素和乳头瘤病毒同样必须在它们最初进入宿主细胞期间由弗林蛋白酶加工。枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶是具有与枯草杆菌蛋白酶的功能相似的功能的蛋白酶，所述枯草杆菌蛋白酶是属于枯草蛋白酶(subtilase)(丝氨酸蛋白酶)的组的非特异性蛋白酶。
已令人惊讶地发现，在恒定链内插入蛋白酶切割位点导致与抗原蛋白或肽或其抗原片段可操作连接的恒定链的分泌。在一些实施方案中，所述蛋白酶切割位点是枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的切割位点。在其他实施方案中，优选的蛋白酶切割位点是弗林蛋白酶切割位点。
技术人员知道如何设计和引入核酸中的编码蛋白酶切割位点、例如弗林蛋白酶切割位点的序列。蛋白酶通过本领域已知的识别序列识别其靶标。在弗林蛋白酶的情况下，弗林蛋白酶识别许多切割位点，其中一个实例是rxr/kr(精氨酸，任何氨基酸，精氨酸或赖氨酸，精氨酸)。用于分析弗林蛋白酶切割位点的数据库是可得的并且是技术人员已知的。应当理解，为了确保适当的切割，可以引入多于一个蛋白酶切割位点。例如，所述蛋白酶切割位点可以包含彼此相邻的两个蛋白酶切割位点。优选的弗林蛋白酶切割位点是序列sgrrarrrarrsgr(seqidno:57)。
蛋白酶切割位点包含在恒定链或其变体内。在本发明的范围内的是其中蛋白酶切割位点位于恒定链的末端、例如c末端或n末端的核酸构建体，以及其中蛋白酶切割位点在恒定链的内部的构建体。在优选实施方案中，蛋白酶切割位点的引入不破坏核酸构建体的开放阅读框。
所述蛋白酶切割位点可以插入恒定链中(即蛋白酶切割位点的存在不会导致恒定链的任何氨基酸的缺失或取代)，或者可替换地所述蛋白酶切割位点可以取代恒定链的一个或多个氨基酸或完整区域。
合适地，所述蛋白酶切割位点位于ess的c末端，更合适地跨膜结构域的c末端，更合适地key区域的c末端，更合适地clip区的c末端。在每种情况下，所述抗原蛋白或肽或其抗原片段的n末端。
合适地，所述蛋白酶切割位点位于恒定链的ess和c末端之间，更合适地恒定链的跨膜区和c末端之间，更合适地恒定链的key区和c末端之间，更合适地恒定链的clip区和c末端之间。
更合适地，所述蛋白酶切割位点位于ess和trim结构域之间，更合适地跨膜区和trim结构域之间，更合适地key区和trim结构域之间，更合适地clip区和trim结构域之间。
如上所详述，所述恒定链可以包含许多结构域，例如至少一个trim结构域、至少一个信号肽、至少一个clip结构域、至少一个内体分选信号和至少一个肉豆蔻酰化位点。在一些实施方案中，核酸构建体以使得蛋白酶切割位点不包含在任何上述结构域内的方式设计。在其他实施方案中，核酸构建体以使得蛋白酶切割位点包含在任何上述结构域内的方式设计。所述蛋白酶切割位点可以插入恒定链中，或者可替换地，所述蛋白酶切割位点可以替换天然存在于恒定链中的区域，使得具有蛋白酶切割位点的恒定链的总长度与没有蛋白酶切割位点的恒定链的总长度实质上相同。在优选实施方案中，因此替换的区域不发挥对恒定链重要或必需的活性。在优选实施方案中，所述蛋白酶切割位点替换恒定链的不是trim结构域、信号肽、clip结构域、内体分选信号或肉豆蔻酰化位点的区域。
在一个优选实施方案中，所述蛋白酶切割位点位于clip结构域和trim结构域之间。所述蛋白酶切割位点可以例如位于trim结构域的紧靠上游或clip结构域的紧靠下游。不受理论束缚，假设在trim结构域的上游插入蛋白酶切割位点不会挑战恒定链的三聚化，并且所得多肽是三聚体的。
所述蛋白酶切割位点也可以插入clip结构域的上游，例如内体分选信号的紧靠下游。
在另一个优选实施方案中，所述蛋白酶切割位点位于trim结构域的下游，例如trim结构域的紧靠下游或例如恒定链的c末端。在此类实施方案中，假设挑战恒定链的三聚化，并且所得多肽是单体的。
因此，蛋白酶切割位点的放置可以根据是否期望由核酸构建体编码的多肽的单体形式或三聚体形式来设计。
抗原
抗原是含有至少一个能够引发免疫应答的表位的多肽。术语抗原、抗原序列、抗原蛋白、抗原片段和免疫原在本文中可互换使用。表位(也称为抗原决定簇)是被免疫系统识别的抗原序列的部分。合适地，该识别由抗体、b细胞或t细胞与所讨论的表位的结合介导。被抗体或b细胞结合的表位称为b细胞表位，而被t细胞结合的表位称为t细胞表位。合适地，结合被定义为抗体或t细胞受体(tcr)和相应表位之间的结合常数为1x105m-1或更高，或1x106m-1，1x107m-1，1x108m-1或更高的结合。术语“表位”是指构象以及非构象表位。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在的情况下，与前者的结合丧失而与后者的结合没有丧失。t细胞表位是非构象性的，即它们是线性的，而b细胞表位可以是构象或非构象性的。线性b细胞表位通常长度在5至20个氨基酸之间变化。
合适地，所述抗原序列衍生自病原体。抗原序列合适地衍生自选自以下的病原体：病毒、细菌、原生生物和多细胞寄生虫。在一个替代实施方案中，合适地，所述抗原序列衍生自癌细胞。
在一些实施方案中，至少一个恒定链可操作连接至至少两个抗原蛋白或肽或其抗原片段。因此，在一些实施方案中，抗原蛋白或肽或其抗原片段的数目是三个、四个、五个、六个、八个或十个或更多个。在一些实施方案中，每个恒定链元件和每个抗原元件彼此可操作连接，如下所定义。
所述抗原可以衍生自(例如获得自)感染人和非人脊椎动物的人或非人病原体，包括例如细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生虫，或癌细胞或肿瘤细胞。在一个实施方案中，所述抗原是重组蛋白，例如重组原核蛋白。
病毒抗原
在一个优选实施方案中，至少一种抗原可以源于但不限于下述病毒科中的任何：腺病毒、沙粒病毒科、星状病毒科、布尼亚病毒科、嵌杯病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、疱疹病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、细小rna病毒科、痘病毒科、呼肠病毒科、逆转录病毒科、弹状病毒科和披膜病毒科。
在一些实施方案中，至少一种抗原可以衍生自选自以下的病毒：逆转录病毒、黄病毒科病毒、正粘病毒、疱疹病毒科、沙粒病毒、丝状病毒科、痘病毒科和乳多空病毒科。
在一些实施方案中，所述至少一种抗原蛋白或肽选自以下和/或可以是以下任一种的至少一种抗原片段：水泡性口炎病毒糖蛋白(vsv-gp)、甲型流感ns-1(非结构蛋白1)、甲型流感m1(基质蛋白1)、甲型流感np(核蛋白)、lcmvnp、lcmvgp、埃博拉病毒gp、埃博拉病毒np、小鼠γ疱疹病毒m2、m3和orf73(例如mhv-68m2、m3和orf73)、鸡卵清蛋白(ova)或辅助t细胞表位。
微生物抗原
在一个优选实施方案中，至少一种抗原蛋白或肽来自选自下述的微生物：结核分枝杆菌、炭疽芽孢杆菌、葡萄球菌属物种和弧菌属物种。
寄生虫抗原
一个实施方案涉及核酸构建体，其中编码的至少一种抗原蛋白或肽来自寄生虫。
本发明的另一个实施方案涉及核酸构建体，其包含来自上述病原体中的任何的至少2种抗原蛋白或肽的组合。
在一个优选实施方案中，至少一种抗原蛋白或肽来自选自下述的寄生虫：疟原虫属物种、利什曼原虫属物种和锥虫属物种。
家畜抗原
又另一个优选实施方案涉及至少一种抗原蛋白或肽或所述抗原蛋白或肽的片段，其是与上述抗原中的任何具有至少85%同一性的抗原肽或蛋白。氨基酸之间的同源性或同一性可以通过先前提及的blosum评分矩阵中的任何进行计算。
癌抗原
一个实施方案涉及核酸构建体，其中所述至少一种抗原蛋白或肽或抗原蛋白或肽的片段来自癌症特异性多肽或癌抗原。
优选地，本发明的至少一种抗原衍生自但不限于选自下述的癌症特异性多肽：mage-3，mage-1，gp100，gp75，trp-2，酪氨酸酶，mart-1，cea，ras，p53，b-连环蛋白，gp43，gage-1，bage-1，psa，muc-1、2、3，和hsp-70，trp-1，gp100/pmel17，β-hcg，ras突变型，p53突变型，hmw黑色素瘤抗原，muc-18，hoj-1，细胞周期蛋白依赖性激酶4(cdk4)，半胱天冬酶8，her-2/neu，人乳头状瘤病毒hpv6、11、16、18、31和33型，bcr-abl酪氨酸激酶，癌胚抗原(cea)，端粒酶和sv40大t。
一个实施方案涉及核酸构建体，其中至少一种抗原蛋白或肽或抗原蛋白或肽的片段来自选自下述的癌症特异性多肽：p53、her-2/neu、端粒酶和黑色素瘤抗原。
组合两种或更多种任何本文提及的抗原在本发明的范围内。
可操作接头
本发明的一个方面涉及核酸构建体，其中至少一种恒定链或其变体可操作连接至至少一种抗原蛋白或肽或其抗原片段，其中所述恒定链的c末端可操作连接至所述抗原蛋白或肽的n末端。因此，所述可操作接头位于恒定链和抗原蛋白或肽或其抗原片段之间。
在恒定链和抗原蛋白或肽或抗原蛋白或肽的片段之间的可操作连接是直接连接或由间隔区介导的连接。术语可操作接头应理解为核苷酸或氨基酸残基序列，其以保证核酸或多肽的生物加工的方式使核酸构建体或嵌合多肽的2个部分结合在一起。如果可操作接头是直接连接，则各自编码开放读码框或开放读码框的片段的2个核酸彼此紧邻放置，并且从而也在框内。如果可操作接头由间隔区介导，则一系列核苷酸分别插入编码至少一种恒定链和至少一种抗原肽的核苷酸之间。在本发明的范围内的是这样的实施方案，其中间隔区仅是以保留开放读码框的方式使本发明的至少2种元件连接的一系列核苷酸，或间隔区可以编码如本文下文定义的一种或多种信号或分离元件。
合适地，所述恒定链通过作为接头序列的间隔区间接连接至抗原序列。合适地，所述接头序列包含甘氨酸和丝氨酸或更合适地由甘氨酸和丝氨酸组成，更合适地，所述接头序列包含序列glyser或更合适地由序列glyser组成。或者，所述接头序列包含'asci'接头或由'asci'接头组成，所述'asci'接头是具有由多核苷酸序列aggcgcgcc编码的多肽序列argargala的接头。或者，所述接头序列包含‘res’接头或更合适地由‘res’接头组成，所述‘res’接头是具有由多核苷酸序列agcgatcgctatttaaataggcgcgcc(seqidno:52)编码的多肽序列seraspargtyrleuasnargargala(seqidno:51)的接头。或者，所述接头序列包含人流感血凝素(ha)标签(多肽seqidno:53，多核苷酸seqidno:54)或更合适地由其组成。
合适地，所述接头序列由50个或更少，更合适地30个或更少，更合适地10个或更少，更合适地5个或更少的残基组成。
在另一个实施方案中，可操作接头包含编码关于mhcii类分子的至少一个辅助表位的间隔区。辅助表位的实例是免疫原决定簇例如白喉毒素。特别地白喉毒素b片段cooh-末端区域已显示在小鼠中是免疫原性的。此外，hsp70部分或整体、以及其他免疫原性肽例如流感病毒、或具有锚定至hlai类和ii类分子的锚定基序的免疫原性序列或肽也可以在核酸构建体的间隔区中编码。
在又另一个实施方案中，核酸构建体的可操作接头可以包含至少一个sirna或mirna编码序列。sirna(小干扰rna)和mirna(微小rna)以序列特异性方式靶向内源rna用于降解。因此可以选择在本发明的核酸构建体内编码的sirna或mirna，以靶向不希望有的基因产物。
在另一个实施方案中，可操作接头包含至少一个多聚接头或多克隆位点(mcs)。多聚接头和mcs是包含限制酶识别序列的核苷酸系列，即其中限制酶以平端或交错方式切割dna的位点，促进dna的其他片段/序列亚克隆到核酸构建体内。多聚接头/mcs的识别序列一般是独特的，意味着它们在核酸构建体的其他地方未发现。可操作接头可以另外包含一个或多个终止或末端密码子，其发出新生多肽从核糖体释放的信号。可操作接头还可以包含至少一个ires(内部核糖体进入位点)和/或至少一个启动子。ires是允许在信使rna(mrna)序列中间起始翻译的核苷酸序列，作为蛋白合成的更大过程的部分。启动子是使得基因能够被转录的dna序列。启动子由rna聚合酶识别，这随后起始转录，如下文所详述。启动子可以是单向或双向的。
在一个优选实施方案中，跨越在恒定链和至少一种抗原之间的区域的可操作接头是这样的可操作接头，其包含至少一个多聚接头、至少一个启动子以及还任选地至少一个ires。这些元件可以以任何次序放置。在一个进一步优选的实施方案中，恒定链的终止密码子已被缺失，并且多聚接头已以保存开放读码框的方式克隆到载体内，允许插入多聚接头内的至少一种抗原的框内阅读。这具有促进多种抗原在一个步骤或多个克隆步骤中亚克隆到相同构建体内，并且允许多种抗原在与恒定链相同的框内同时表达的优点。终止密码子可以在多聚接头后插入用于翻译终止。这个实施方案可以与上述辅助表位中的任何、mi/sirna或本文描述的其他元件中的任何进行组合。
在一个优选实施方案中，置于至少一个恒定链和至少一个抗原蛋白或肽或其片段之间的可操作接头优选使得确保构建体的开放阅读框的可读性，使得所述抗原肽：前面是至少一个可操作接头，所述可操作接头本身前面是至少一个恒定链或其变体。优选将至少一种抗原肽编码序列置于恒定链的末端部分，并将可操作接头插入其之间。末端部分是恒定链或其片段的第一个或最后一个残基。
在一些实施方案中，恒定链可操作连接至一种抗原蛋白或肽或其抗原片段，并且抗原蛋白或肽或其抗原片段可操作连接至至少一种另外的抗原蛋白或肽或其抗原片段，其中所述抗原片段蛋白或肽或其抗原片段彼此可操作连接，如本文所定义。
组合
核酸构建体编码多个元件是在本发明的范围内的，所述元件是至少一种恒定链和至少一种抗原蛋白或肽或所述蛋白或肽的片段。因此具有多个恒定链落入本发明的范围内，这些各自彼此可操作地连接且与多个抗原蛋白或肽或抗原蛋白或肽的片段可操作地连接。核酸构建体的元件因此必须彼此是可操作地连接的。各自与一种抗原蛋白或肽或所述蛋白或肽的片段可操作地连接的几个系列的恒定链(这些系列各自彼此可操作地连接)包含在本发明内。恒定链各自可以包含如上所定义的蛋白酶切割位点。因此，本文还公开了具有多个蛋白酶切割位点的实施方案。
本发明的优点和非常重要的方面涉及下述事实：可以起始任何类型的免疫应答例如t细胞介导和抗体介导的应答，二者可以用已知是弱抗原的表位、未知抗原性质的多肽和同时多个表位/抗原来起始。蛋白酶位点的插入导致抗原作为单体或三聚体分泌，并且这导致改善的免疫应答。
因此，也在本发明的范围内的是一个优选实施方案是核酸构建体，所述核酸构建体编码与多个抗原蛋白或肽或蛋白或肽的片段可操作地连接的至少一种恒定链，例如2、3、4、5、6、8、10、12种或更多种抗原蛋白或肽或蛋白或肽的片段，其中所述恒定链包含蛋白酶切割位点。
核酸构建体可以包含另外元件。这些包括但不限于：内部核糖体进入位点(ires)，编码涉及抗原呈递的蛋白的基因，所述蛋白例如lamp、钙网织蛋白；编码涉及细胞内散布(spreading)的蛋白的基因，所述蛋白例如vp22、hivtat、cx43或其他连接蛋白和细胞内缝隙连接组成成分；编码天然杀伤细胞(nk细胞)活化分子例如h60和细胞因子、鸡卵白蛋白或任何t辅助细胞表位的基因。
在一个实施方案中，核酸构建体包含编码涉及抗原呈递的蛋白的至少一种基因，所述蛋白例如lamp、limp、钙网织蛋白或hsp70。
在另一个优选实施方案中，核酸构建体包含编码涉及细胞内散布的蛋白的至少一种基因，所述蛋白例如vp22、cx43、hivtat、其他连接蛋白和细胞内缝隙连接组成成分。
启动子
术语启动子将在此处用于指一组转录控制模块，其在rna聚合酶ii的起始位点周围成簇。关于启动子被如何组织的许多想法衍生自几种病毒启动子的分析，包括关于hsv胸苷激酶(tk)和sv40早期转录单位的启动子。由更近期工作加强的这些研究已显示启动子由不连续功能模块组成，各自由约7-20bpdna组成，并且包含转录活化蛋白的一个或多个识别位点。每个启动子中的至少一个模块作用于rna合成的起始位点的定位。这点的最佳已知实例是tata盒，但在缺乏tata盒的某些启动子中，例如哺乳动物末端脱氧核苷酰转移酶基因的启动子和sv40晚期基因的启动子，重叠自身起始位点的不连续元件帮助固定起始位置。
另外的启动子元件调节转录起始频率。一般地，这些位于起始位点上游30-110bp的区域中，尽管许多启动子近期已显示也包含起始位点下游的功能元件。元件之间的间距是弹性的，从而使得当元件倒转或相对于彼此移动时，启动子功能被保存。在tk启动子中，在活性开始下降前元件之间的间距可以增至相隔50bp。依赖于启动子，看起来个别元件可以共同或独立地作用，以活化转录。可以引导由核酸构建体编码的序列的转录起始的任何启动子可以在本发明中使用。
本发明的一个方面包括核酸构建体，其中使得构建体能够表达的启动子在至少一种可操作地连接的恒定链和抗原蛋白或肽编码序列前。
进一步方面的是启动子选自组成型启动子、诱导型启动子、生物特异性启动子、组织特异性启动子和细胞类型特异性启动子。
使用诱导型启动子的优点包括提供可以随意活化的“休眠”疫苗的选项。如果疫苗接种优选仅在体内局部与全身性(例如在涉及癌症的情况下)比较诱导，或疫苗在疫苗接种时对于接受者的健康是有害的，这可以是有用的。
在一个优选实施方案中，核酸构建体包含选自下述的启动子：cmv启动子、sv40启动子和rsv启动子。尤其优选的是cmv启动子和sv40启动子。
递送媒介物
在一个方面，本发明涉及如包含在递送媒介物中的在上文任何中描述的核酸构建体。递送媒介物是由此核苷酸序列或多肽或两者可以从至少一种介质转运到另一种介质的实体。递送媒介物一般用于表达在核酸构建体内编码的序列和/或用于构建体或其中编码的多肽的细胞内递送。在本发明的范围内的是递送媒介物是选自下述的媒介物：基于rna的媒介物、基于dna的媒介物/载体、基于脂质的媒介物、基于病毒的媒介物和基于细胞的媒介物。此类递送媒介物的实例包括但不限于：生物可降解聚合物微球体、基于脂质的制剂例如脂质体载体、将构建体涂覆至胶体金颗粒上、脂多糖、多肽、多糖和病毒媒介物的聚乙二醇化。
一个优选实施方案涉及通过机械或电学技术将核酸构建体作为裸dna递送。特别地，在金颗粒上涂覆核酸构建体是一个有利的实施方案。在金颗粒上的核颗粒构建体的递送通过使用粒子轰击设备例如基因枪的弹道转移完成。
一个更优选实施方案包括作为递送媒介物的病毒，其中所述病毒选自下述非详尽组：腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、泡沫病毒、巨细胞病毒、塞姆利基森林病毒、痘病毒、基于mva的载体、rna病毒载体和dna病毒载体。此类病毒载体是本领域众所周知的。
病毒载体通常由两种组分(修饰的病毒基因组和围绕其的外壳结构)组成，尽管有时病毒载体以裸露形式引入或用除了病毒蛋白以外的蛋白包被。大多数现有载体具有与野生型病毒相似的外壳结构。该结构包装并保护病毒核酸并提供结合和进入靶细胞的手段。
优选地，病毒载体从野生型病毒基因组修饰以使病毒不能在靶细胞中生长，同时使病毒能够在用于制备感染性颗粒的宿主细胞(例如包装或辅助细胞)中生长。载体核酸通常是用于在辅助细胞系中复制和包装的必需的顺式作用病毒序列，以及用于调节递送至靶细胞的多核苷酸的表达的表达控制序列。其他病毒功能在如本领域已知的特定包装或辅助细胞系中反式表达。
腺病毒
在一个更优选实施方案中，包含如本文所述的核酸构建体的媒介物是腺病毒。腺病毒基因组由近似36kb的线性双链dna分子组成，其携带完成病毒复制周期所必需的超过约30种基因。早期基因被分为4个区域(e1至e4)，其对于病毒复制是必需的，除了e3区，据信e3区调节抗病毒宿主免疫应答。e1区(eia和eib)编码负责调节病毒基因组的转录的蛋白。e2区基因(e2a和e2b)的表达导致病毒复制所需的多肽的合成。由e3区编码的蛋白阻止通过细胞毒性t细胞和肿瘤坏死因子的细胞溶解。由e4区编码的蛋白参与dna复制、晚期基因表达和剪接以及宿主细胞关闭。晚期基因通常编码促成病毒衣壳的结构蛋白。此外，腺病毒基因组携带顺式作用5'和3'itr(倒置末端重复)和dna复制必需的包装序列。itr携带dna复制起点，而衣壳化区域是将腺病毒dna包装成感染性颗粒所需的(参见例如us2004/0157307)。
在本发明的最优选实施方案中，包含如本文所述的核酸构建体的媒介物是复制缺陷型腺病毒或条件复制缺陷型腺病毒。可以将腺病毒载体工程改造为条件复制的(crad载体)，以便在特定细胞(例如例如增殖细胞)中选择性复制。在另一个方面，腺病毒载体对e1功能是复制缺陷的(例如，通过e1的全部或部分缺失或诱变)。载体的腺病毒骨架可以包含额外的修饰(一个或多个病毒基因中的缺失、插入或突变)。e2修饰的实例通过位于dbp(dna结合蛋白)编码基因上的热敏突变来说明。腺病毒序列也可以缺失e4区的全部或部分。非必需e3区域内的额外缺失可以允许所递送的多核苷酸的大小增加。然而，保留编码许病毒逃避免疫系统或炎性应答的多肽(例如gp19k)的e3序列的全部或部分可能是有利的。也可以使用保留itr和包装序列且包含实质遗传修饰以消除病毒抗原的残余合成的第二代载体来改善转导细胞中的表达基因的长期表达。引入细胞的核酸构建体可以插入病毒基因组的任何位置，除了顺式作用序列(参见例如us2004/0157307)。
本发明的一个优选实施方案包括腺病毒，例如：绵羊腺病毒、ii型犬腺病毒、修饰的牛痘病毒ankara(mva)或mva-bn。
或者，用于本发明中的腺病毒载体衍生自非人类猿猴腺病毒。许多腺病毒已分离自非人类猿猴例如黑猩猩、倭黑猩猩、恒河猴和大猩猩，并且衍生自这些腺病毒的载体诱导对由这些载体编码的转基因的强烈免疫应答(colloca等人(2012)sci.transl.med.4:1-9;roy等人(2004)virol.324:361-372;roy等人(2010)j.ofgenemed.13:17-25)。基于非人类猿猴腺病毒的载体的某些优点包括在靶群体中相对缺乏针对这些腺病毒的交叉中和抗体。例如，某些黑猩猩腺病毒与预先存在的中和抗体应答的交叉反应仅存在于2%的靶群体中，相比之下，在某些候选人类腺病毒载体的情况下为35%。
腺病毒颗粒或空腺病毒衣壳也可用于通过病毒介导的共内化过程转移核酸构建体或基于核酸的递送载体。该方法可以在阳离子试剂(例如聚卡宾(polycarbenes))或包含一个或多个脂质层的脂质囊泡存在的情况下完成。
可以使用互补细胞系或辅助病毒，根据本领域任何常规技术制备和增殖腺病毒颗粒，所述互补细胞系或辅助病毒反式提供病毒复制所必需的缺失的病毒基因。腺病毒颗粒可以从培养物上清液回收，但也可以在裂解后从细胞回收，并且任选地根据标准技术(例如色谱法和超速离心法)进一步纯化。
通过修饰病毒表面蛋白，可以用衍生自具有广泛宿主范围的腺病毒的载体实现细胞类型特异性靶向。例如，腺病毒感染的特异性由附着于允许细胞表面的细胞受体决定。在这方面，存在于腺病毒衣壳表面的纤维和五邻体在细胞附着中发挥关键作用。因此，腺病毒的细胞靶向可以通过编码纤维和/或五邻体的病毒基因的遗传修饰来实施，以生成能够与独特细胞表面受体特异性相互作用的修饰的纤维和/或五邻体。
本发明的一个方面涉及包含核苷酸构建体的腺病毒载体，所述核苷酸构建体编码至少一种抗原和刺激mhc-i应答的至少一种蛋白或肽或蛋白或肽的片段。
本发明的一个进一步方面涉及腺病毒载体，其中所述核苷酸构建体编码刺激mhc-ii应答的至少一种蛋白或肽或蛋白或肽的片段。
更优选地，所述腺病毒载体包含内体肽负载隔室定位肽。这种内体肽负载隔室定位肽可以选自，但不限于选自：分选信号肽、lamp、limp和恒定链。
最优选地，所述腺病毒载体包含至少一种mhc应答刺激蛋白或肽或蛋白或肽的片段，并且所述mhc应答刺激蛋白或肽或蛋白或肽的片段是恒定链。
重组细胞
本发明的一个方面涉及包含如在上文中的任何中定义的核酸构建体的细胞。此类重组细胞可以用作体外研究的工具，用作核酸构建体的递送媒介物或用作基因疗法方案的一部分。根据本发明的核酸构建体和基于核酸的载体可以通过本领域众所周知的技术引入细胞内，并且所述技术包括dna显微注射到细胞的核内、转染、电穿孔、脂转染/脂质体融合和粒子轰击。合适的细胞包括自体和非自体细胞，并且可以包括异种细胞。
在一个优选实施方案中，本发明的核酸构建体包含在抗原呈递细胞(apc)内。在其表面上呈递与mhc分子结合的抗原的任何细胞被视为抗原呈递细胞。此类细胞包括但不限于巨噬细胞、树突细胞、b细胞、杂合apc和养育(foster)apc。制备杂合apc的方法是本领域众所周知的。
在一个更优选的实施方案中，apc是专职抗原呈递细胞，并且最优选apc是mhc-i和/或mhc-ii表达细胞。
根据上文中的任何的apc可以是获得自患者的干细胞。在引入本发明的核酸构建体后，干细胞可以以治疗具有医学状况的患者的意图重新引入患者内。优选地，从患者中分离的细胞是能够分化成抗原呈递细胞的干细胞。
在本发明的范围内另外包括的是包含本发明的核酸构建体的抗原呈递细胞不表达任何共刺激信号，并且抗原蛋白或肽或所述蛋白或肽的抗原片段是自身抗原。
嵌合蛋白和抗体
本发明的一个目的是由如本文上文描述的核酸构建体编码的嵌合蛋白，包含至少一种可操作地连接的恒定链和至少一种抗原蛋白或肽或所述抗原蛋白或肽的片段，其中所述恒定链或其变体的c末端可操作连接至所述抗原蛋白或肽或其抗原片段的n末端，且其中所述恒定链或其变体包含位于所述蛋白酶切割位点的c末端的蛋白酶切割位点和任选trim结构域。嵌合蛋白应理解为由核苷酸序列编码的遗传工程改造蛋白，所述核苷酸序列通过将2种或更多种完全或部分基因或一系列(非)随机核酸剪接在一起制备。
本发明的一个方面涉及可以识别如本文上文定义的嵌合蛋白的抗体。术语抗体应理解为免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的活性部分。抗体是例如完整免疫球蛋白分子或其保留免疫学活性的片段。此类抗体可以用于动物的被动免疫，或用于在用于检测抗体与之结合的蛋白的测定中。
疫苗组合物
本发明的一个方面涉及包含核酸序列的组合物，所述核酸序列编码与至少一种抗原蛋白或肽或所述抗原蛋白或肽的片段可操作连接的至少一种恒定链，其中所述恒定链或其变体的c末端可操作连接至所述抗原蛋白或肽或其抗原片段的n末端，且其中所述恒定链或其变体包含位于所述蛋白酶切割位点的c末端的蛋白酶切割位点和任选trim结构域。因此，所述疫苗可以包含如上任一者中所定义的核酸构建体。疫苗还可以用作药物。
核酸构建体组合物
本发明的一个方面涉及包含核酸序列的组合物，所述核酸序列编码与至少一种抗原蛋白或肽或所述抗原蛋白或肽的片段可操作地连接的至少一种恒定链或其变体。组合物因此可以包含如上文中的任何中定义的核酸构建体。组合物可以另外用作药物。
根据本发明的核酸构建体组合物可以根据已知方法进行配制，例如通过一种或多种药学上可接受的载体也称为赋形剂或稳定剂与活性剂的混合。这些赋形剂对于施用于任何个体/动物，优选脊椎动物且更优选人可以是可接受的，因为它们在采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或个体是无毒的。通常生理学上可接受的载体是ph缓冲水溶液。此类赋形剂、载体和配制方法的实例可以例如在remington'spharmaceuticalsciences(maackpublishingco，easton，pa)中找到。生理学上可接受的载体的实例包括但不限于：缓冲液例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如edta；糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子例如钠；和/或非离子表面活性剂例如tweentm、聚乙二醇(peg)和pluronicstm。
为了配制适合于有效施用的药学上可接受的组合物，此类组合物根据本发明将包含有效量的核酸构建体，所述核酸构建体被包含在递送媒介物内或嵌合蛋白在如本文描述的核酸构建体内编码。通常，如果用如由本发明的核酸构建体编码的蛋白或多肽引发免疫应答，则通过使蛋白或肽与之偶联且因此帮助诱导免疫应答，载体将用作支架。载体蛋白可以是任何常规载体，包括适合于呈递免疫原决定簇的任何蛋白。合适载体一般是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体(例如油小滴或脂质体)和非活性病毒颗粒。此类载体是本领域普通技术人员众所周知的。此外，这些载体可以充当免疫刺激剂(“佐剂”)。动物的免疫可以用佐剂和/或药物载体进行。常规载体蛋白包括但不限于钥孔血蓝蛋白，血清蛋白例如转铁蛋白、牛血清白蛋白或人血清白蛋白，卵白蛋白，免疫球蛋白或激素例如胰岛素。载体可以连同佐剂或独立于其存在。
在下文中，核酸构建体组合物或组合物意指包含对于预防和治疗用途包括刺激患者中的免疫应答有用的组合物。进一步考虑本发明的组合物不包括任何全身或局部毒性反应或任何其他副作用。
在一个优选实施方案中，如本文使用的，短语‘组合物’指用于引发免疫应答的组合物。
在一个优选实施方案中，核酸构建体是包装的。用于核酸构建体的包装装置(means)包括选自但不限于下述的装置：基于rna的或基于dna载体、基于脂质的载体、病毒表达载体、病毒递送载体、胶体金颗粒和生物可降解聚合物微球体的包被。先前提及的递送装置中的任何因此可以用于在组合物中使用的包装目的。
在一个实施方案中，核酸构建体的包装方法是选自但不限于下述的病毒表达载体：腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘苗病毒和dna病毒载体。病毒载体可以是复制缺陷型或条件复制缺陷型病毒载体。
本发明的一个方面涉及包含至少2种载体的组合物。这包含如所述的任何1种或2种不同核酸构建体可以包装到至少2种载体内，这些载体是如上文中的任何中所述的类型。本发明另外涉及包含3、4、5或6种载体的组合物。再次，这些载体可以彼此不同或相同，并且可以携带如本文上文描述的相同或不同核酸构建体。
本发明的一个进一步方面涉及组合物，其包含如由本文描述的核酸构建体中的任何编码的至少一种嵌合蛋白。当嵌合蛋白或多肽待用作免疫原时，它可以通过在重组细胞中表达任何一种或多种上述核酸构建体产生，或它可以通过本领域已知的方法通过化学合成制备。如上文中所述，此类嵌合蛋白和/或肽可以与载体偶联，以增加对于蛋白/肽的免疫应答，并且可以连同或不连同佐剂和/或赋形剂一起施用。
在一个实施方案中，本发明涉及如本文描述的核酸构建体用于产生组合物的用途。
增强免疫应答：常规佐剂
佐剂可以包括在组合物中以增强特异性免疫应答。因此，特别重要的是鉴定这样的佐剂，当与一种或多种抗原/核酸构建体和/或递送媒介物(其中任何也可以被称为免疫原决定簇)组合时，其导致能够诱导强特异性免疫应答的组合物。免疫原决定簇还可以在免疫前与2种或更多种不同佐剂混合。组合物在呈现的正文中还被称为免疫原性组合物。
大量佐剂已得到描述并且用于在实验室动物例如小鼠、大鼠和兔中生成抗体。在此类设置中，副作用的耐受相当高，因为主要目标是获得强抗体应答。对于用途和对于批准用于在药物中使用，且特别对于在人中使用，要求组合物的组分包括佐剂是充分表征的。进一步要求组合物具有任何不良反应的最低限度危险，例如肉芽肿、脓肿或发热。
本发明的一个实施方案涉及包含佐剂的组合物。在一个优选实施方案中，组合物适合于施用于哺乳动物例如人类。因此，优选佐剂适合于施用于哺乳动物，并且最优选地适合于施用于人类。
在另一个优选实施方案中，组合物适合于施用于禽或鱼，并且最优选鸡(家鸡)。因此，优选佐剂适合于施用于禽或鱼。
另一大组佐剂是细菌起源的那些。具有细菌起源的佐剂可以进行纯化且合成(例如胞壁酰二肽、脂质a)，并且宿主介质已得到克隆(白介素1和2)。最近十年已在细菌起源活性组分的几种佐剂的化学纯化中获得显著进展：百日咳博德特氏菌、结核分枝杆菌、脂多糖、弗氏完全佐剂(fca)和弗氏不完全佐剂(difcolaboratories，detroit，mich.)和merckadjuvant65(merck和company，inc.，rahway，n.j.)。另外，依照本发明的合适佐剂是例如titermaxclassical佐剂(sigma-aldrich)、iscoms、quila、alun，参见us58767和5,554,372，脂质a衍生物、霍乱毒素衍生物、hsp衍生物、lps衍生物、合成肽基质、gmdp及其他以及与免疫刺激剂组合(us5,876,735)。百日咳博德特氏菌在本发明的背景中作为佐剂是有利的，由于其通过对t淋巴细胞群体的作用调节细胞介导的免疫的能力。对于脂多糖和弗氏完全佐剂，佐剂活性部分已得到鉴定且合成，这允许研究结构-功能关系。这些还考虑用于包括在根据本发明的免疫原性组合物中。
已发现脂多糖(lps)及其各种衍生物包括脂质a与脂质体或其他脂质乳剂组合是有力佐剂。仍未确定是否可以产生用于在人中的一般使用的具有足够低毒性的衍生物。弗氏完全佐剂是大多数实验研究中的标准。
矿物油可以加入免疫原性组合物中，以便保护抗原不受快速分解代谢。
许多其他类型的材料可以用作根据本发明的免疫原性组合物中的佐剂。这些包括植物产物例如皂苷、动物产物例如壳多糖和众多合成化学制品。
根据本发明的佐剂还可以通过其提议的作用机制进行分类。这类分类法必定是略微任意的，因为大多数佐剂看起来通过超过一种机制起作用。佐剂可以通过抗原定位和递送，或通过对构成免疫系统的细胞例如巨噬细胞和淋巴细胞的直接作用起作用。根据本发明的佐剂通过其增强免疫应答的另一种机制是通过抗原沉积物的产生。这看起来促成铝化合物、油乳剂、脂质体和合成聚合物的佐剂活性。脂多糖和胞壁酰二肽的佐剂活性看起来主要通过巨噬细胞的活化介导，而百日咳博德特氏菌影响巨噬细胞和淋巴细胞。当掺入根据本发明的免疫原性组合物内可以是有用的佐剂的进一步实例在us5,554,372中描述。
在根据本发明的组合物中有用的佐剂因此可以是矿物盐，例如氢氧化铝和磷酸铝或钙凝胶、油乳剂和基于表面活性剂的制剂例如mf59(微流体化去污剂稳定的水包油乳剂)、qs21(纯化皂苷)、as02(sbas2、水包油乳剂+单磷酰脂质a(mpl)+qs21)、montanideisa51和isa-720(稳定的油包水乳剂)、佐剂65(包含花生油、二缩甘露醇一油酸和单硬脂酸铝)、ribiimmunochemresearchinc.，hamilton，utah)、微粒佐剂例如病毒体(掺入流感血凝素的单层脂质体小泡(原文为cehicles，疑为vehicles))、as04(含mpl的al盐)、iscoms(皂苷和脂质(例如胆固醇)的结构复合物、聚丙交酯共乙交酯(plg)、微生物衍生物(天然和合成)例如单磷酰脂质a(mpl)、detox(mpl+草分支杆菌(m.phlei)细胞壁支架)、agp(rc-529(合成乙酰化单糖))、dc_chol(能够自组构成脂质体的类脂免疫刺激剂)、om-174(脂质a衍生物)、cpg基序(包含免疫刺激cpg基序的合成寡核苷酸)、修饰细菌毒素、具有无毒佐剂效应的lt和ct、内源人免疫调节剂例如hgm-csf或hil-12或immudaptin(c3d串联排列)、惰性媒介物例如金颗粒。
佐剂的另外实例包括：免疫刺激油乳剂(例如，油包水、水包油、水包油包水例如弗氏不完全佐剂例如montainde，specol，矿物盐例如al(oh)3、alpo4，微生物产物，皂苷例如quala，合成产物以及佐剂佐剂，和免疫刺激复合物(iscom)和细胞因子，热灭活细菌/组分，纳米珠，lps，lta。其他常用佐剂的列表公开于wo2003/089471中的第6-8页上，所述列表在此引入作为参考。
根据本发明的免疫原性组合物还可以包含稀释剂例如缓冲剂，抗氧化剂例如抗坏血酸，低分子量(小于约10个残基)多肽，蛋白，氨基酸，碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精，螯合剂例如edta，谷胱甘肽及其他稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐水或与非特异性血清白蛋白混合的盐水是示例性合适稀释剂。
佐剂一般以根据制造商的说明书的量包括在免疫原性组合物中。
增强免疫应答：非常规佐剂
细胞因子调节
对于有效的疫苗，它必须诱导对于给定病原体的合适免疫应答。这可以通过修饰表达的抗原形式(即细胞内与分泌的比较)、递送方法和途径和递送的dna剂量来完成。然而，它还可以通过共施用编码免疫调节分子例如细胞因子、淋巴因子或共刺激分子的质粒dna(pdna)来完成。这些“遗传佐剂”可以连同如本文概述的‘常规佐剂’或‘其他免疫刺激佐剂’中的任何以许多方式施用：
作为2种分开质粒的混合物，一种编码免疫原和另一种编码细胞因子；
作为通过间隔区分开的单一的双或多顺反子载体；或
作为质粒编码的嵌合体或融合蛋白；或
以其天然形式，即蛋白或核苷酸。
一般而言，促炎因子(例如各种白介素、肿瘤坏死因子和gm-csf)加上th2诱导细胞因子的共施用增加抗体应答，而促炎因子和th1诱导细胞因子降低体液应答且增加细胞毒性应答(这例如在病毒保护中更重要)。有时还使用共刺激分子如b7-1、b7-2和cd40l。
这个概念已成功地应用于编码il-10的pdna的局部施用。编码b7-1(在apc上的配体)的质粒在抗肿瘤模型中已成功地增强免疫应答，并且使编码gm-csf和约氏疟原虫(p.yoelii)的环子孢子蛋白(pycsp)的质粒混合已增强针对后续攻击的保护(而单独的编码pycsp的质粒则不是)。gm-csf可以促使树突细胞更有效地呈递抗原，且增强il-2产生和th细胞活化，从而驱动增加的免疫应答。这可以通过首先用ppycsp和pgm-csf混合物引发，且以后用表达pycsp的重组痘病毒加强得到进一步增强。然而，与通过单独的ppcmsp1-hbs递送获得的保护比较，编码gm-csf(或ifn-γ、或il-2)和夏氏疟原虫(p.chabaudi)裂殖子表面蛋白1(c末端)-乙型肝炎病毒表面蛋白(pcmsp1-hbs)的融合蛋白的质粒的共注射实际上消除了针对攻击的保护。
其他免疫刺激佐剂
在一个实施方案中，下述中的任何可以用作关于根据本发明的核酸构建体或组合物的免疫刺激佐剂：
lps(脂多糖)，poly-ic(多聚肌醇胞嘧啶)或任何其他佐剂，其类似于双链rna、ll37、rig-1解螺旋酶、il-12、il-18、ccl-1、ccl-5、ccl-19、ccl-21、gm-csf、cx3cl、cd86、pd-1、分泌pd-1、il10-r、分泌il10-r、il21、icosl、41bbl、cd40l，以及刺激免疫应答的其他任何蛋白或核酸序列。
在一个实施方案中，使免疫刺激佐剂与腺病毒纤维蛋白融合。例如，cx3cl可以与腺病毒纤维蛋白融合。
免疫刺激cpg基序
质粒dna自身看起来对免疫系统具有佐剂作用。质粒dna已衍生自这样的细菌，发现所述细菌触发先天性免疫防御机制，活化树突细胞和产生th1细胞因子。这是由于识别具有免疫刺激的特定cpg二核苷酸序列。cpg刺激(cpg-s)序列在细菌衍生的dna中的出现频率为真核生物中的20倍。这是因为真核生物显示“cpg抑制”-即cpg二核苷酸对以比预期的低得多的频率出现。另外，cpg-s序列是低甲基化的。这在细菌dna中频繁出现，而在真核生物中出现的cpg基序在胞嘧啶核苷酸上都是甲基化的。相比之下，抑制免疫应答活化的核苷酸序列(命名为cpg中和，或cpg-n)在真核生物基因组中是过度出现的。最佳免疫刺激序列已发现是未甲基化的cpg二核苷酸，其侧面为2个5'嘌呤和2个3'嘧啶。此外，在这个免疫刺激六聚体外的侧面区域任选是富含鸟嘌呤的，以确保结合且摄取到靶细胞内。
先天性免疫系统与适应性免疫系统协同作用，以设定针对dna编码蛋白的应答。cpg-s序列诱导多克隆b细胞活化以及细胞因子表达和分泌的上调。受刺激的巨噬细胞分泌il-12、il-18、tnf-α、ifn-α、ifn-β和ifn-γ，受刺激的b细胞分泌il-6和一些il-12。在dna疫苗的质粒骨架中cpg-s和cpg-n序列的操纵可以确保对于编码抗原的免疫应答的成功，并且驱动针对th1表型的免疫应答。如果病原体要求th应答用于保护，则这是有用的。cpg-s序列也已用作外部佐剂，用于具有可变成功率的dna和重组蛋白疫苗接种。具有低甲基化的cpg基序的其他生物也已证实多克隆b细胞扩增的刺激。然而，在这背后的机制可以比简单甲基化更复杂–未发现低甲基化的鼠类dna设定免疫应答。
dna的配制
dna免疫的效率可以通过针对降解稳定dna且增加dna递送到抗原呈递细胞内的效率得到改善。这可以通过用dna包被生物可降解的阳离子微粒(例如用十六烷基三甲基溴化铵配制的聚(丙交酯共乙交酯))来达到。此类dna包被微粒在产生ctl方面可以与重组痘苗病毒一样有效，特别是当与铝混合时。直径300nm的颗粒看起来对于通过抗原呈递细胞摄取是最有效的。
施用
根据本发明的核酸构建体和组合物可以以治疗有效量施用于个体。有效量可以根据各种因素例如个体的状况、重量、性别和年龄而改变。其他因素包括施用方式。
在一个实施方案中，根据本发明的核酸构建体可以以dna、rna、lna、pna、ina、tina、hna、ana、cna、cena、gna、tna、缺口-聚体、混合-聚体(mix-mers)、吗啉代类物质或其任何组合的形式递送给受试者。
在一个实施方案中，根据本发明的核酸构建体可以以dna的形式递送给受试者。
在另一个实施方案中，根据本发明的核酸构建体可以以rna的形式递送给受试者。因此，核酸构建体可以在施用前转录成rna。
在另外一个实施方案中，根据本发明的核酸构建体可以以蛋白的形式递送给受试者。因此，核酸构建体可以在施用前翻译成蛋白。
在其中根据本发明的核酸构建体以蛋白的形式递送给受试者的实施方案中，蛋白可以已进行修饰，以增加稳定作用和/或优化进入细胞内的递送。蛋白可以具有增加的稳定性，原因在于二硫键的存在(例如us5,102,985用过氧化氢处理以还原形式的蛋白溶液，以90-96%得率生成具有分子内二硫桥的蛋白)、极性残基中的增加、表面电荷优化、表面盐桥、封装(例如用中孔硅酸盐)，或蛋白可以与热休克蛋白(例如hsp-60、hsp-70、hsp-90、hsp-20、hsp-27、hsp-84及其他)、hivtat易位结构域、腺病毒纤维蛋白或任何其他蛋白或结构域连接。
药物或兽医学组合物可以通过各种途径提供给个体，例如皮下(sc或s.c.)、腹膜内(i.p.)、局部、经口和肌内(im或i.m.)。药物组合物的施用经口或肠胃外实现。肠胃外递送的方法包括局部、动脉内(直接对于组织)、肌内、大脑内(ic或i.c.)、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内(iv或i.v.)、腹膜内或鼻内施用。本发明还具有提供用于在用组合物引发免疫应答的方法中使用的合适局部、经口、全身和肠胃外药物制剂的目的。
例如，组合物可以在此类经口剂型中施用，例如片剂、胶囊(各自包括限时释放和持续释放制剂)、丸剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、溶液、悬浮液、气溶胶、糖浆剂和乳状剂，或通过注射。同样地，它们还可以以静脉内(弹丸和输注)、腹膜内、皮下、局部连同或不连同阻塞、或肌内形式施用，全部使用药学领域普通技术人员众所周知的形式。可以采用包含本文所述化合物中的任何的有效但无毒量的组合物。还包含其是本领域已知适合于配制可注射免疫原性肽组合物的任何和所有常规剂型，例如冻干形式和溶液、悬浮液或乳剂形式，需要时，其包含常规药学上可接受的载体、稀释剂、防腐剂、佐剂、缓冲组分等。
在一个实施方案中，用于引发和/或后续加强疫苗的组合物作为缓慢或持续释放制剂给予。
根据本发明的核酸构建体或组合物的优选施用方式包括但不限于全身施用，例如静脉内或皮下施用、真皮内施用、肌内施用、鼻内施用、经口施用、直肠施用、阴道施用、肺施用和一般地任何形式的粘膜施用。此外，在本发明中包括用于在本文中提及的任何施用形式的方法在本发明的范围内。
根据本发明的核酸构建体或组合物可以施用一次，或任何次数例如2、3、4或5次。
在一个优选实施方案中，核酸构建体或组合物施用一次，随后为合适疫苗的施用。
在另一个优选实施方案中，核酸构建体或组合物在施用疫苗前作为一系列施用进行施用。此类系列可以包括每天、每第二天、每第三天、每第四天、每第五天、每第六天、每周、每两周或每第三周施用核酸构建体或组合物，总共1、2、3、4或5次。
用核酸构建体或组合物引发因此预期通过施用疫苗得到进一步加强。施用可以以不同于先前施用或类似于先前施用的形式或在不同于先前施用或类似于先前施用的身体部分中。
加强注射(shot)是同源或异源加强注射。同源加强注射是其中第一次和后续施用包括相同构建体且更具体而言相同递送媒介物。异源加强注射是其中相同构建体包含在不同载体内。
根据本发明的组合物的优选施用形式是将组合物施用于身体区域，内或外，最可能是给定感染的接受器(receptacle)。感染接受器是感染通过其接受的身体区域，例如关于流感，感染接受器是肺。
本发明的核酸构建体或组合物可以施用于它对于其可以是有利的任何生物，特别是任何动物例如脊椎动物。组合物的施用装置和方式适合于接受者落入本发明的范围内。
组合物的优选接受者是哺乳动物，并且在本发明的一个更优选实施方案中，哺乳动物选自：牛、猪、马、绵羊、山羊、美洲驼、小鼠、大鼠、猴、犬、猫、雪貂和人。在最优选的实施方案中，哺乳动物是人。
组合物的另一个优选接受者是来自禽纲(禽)的任何脊椎动物，例如家鸡(鸡)。
本发明的一个实施方案包括进一步包括第二种活性成分的组合物。第二种活性成分选自但不限于佐剂、抗生素、化学治疗、抗变应原、细胞因子、免疫系统的补体因子和共刺激分子。
本发明的另一个实施方案包括部件试剂盒，其中试剂盒包括根据上文中的任何的至少一种核酸构建体或组合物，用于施用所述核酸构建体或组合物的装置，和关于如何做到这点的说明书。包括多个剂量的相同组合物或几种不同组合物在本发明的范围内。在一个优选实施方案中，部件试剂盒进一步包含第二种活性成分。在一个更优选的实施方案中，所述第二种活性成分是合适疫苗，即能够加强通过所述免疫应答的先前引发产生的免疫应答的疫苗。
本发明进一步包括用于加强动物中的免疫应答的方法，其包括给动物施用根据上文中的任何的核酸构建体或组合物，随后施用合适疫苗，从而引发且加强受试者的免疫系统。
免疫应答可以是但不限于下述应答类型中的任何：mhc-i依赖性应答、mhc-i和/或mhc-ii依赖性应答、t细胞依赖性应答、cd4+t细胞依赖性应答、cd4+t细胞不依赖性应答、cd8+t细胞依赖性应答和b细胞依赖性免疫应答。合适疫苗是在用根据本发明的核酸构建体或组合物引发免疫系统后能够加强免疫系统的那些。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及治疗有此需要的个体的方法，其包括施用如本文上文所述的组合物，以治疗所述个体中的临床状况。
增加疫苗的效力
本发明的一个实施方案涉及编码如上所述可操作连接的至少一种恒定链或其变体和至少一种抗原蛋白或肽或蛋白或肽的片段的核酸构建体。在一些实施方案中，至少一种抗原蛋白或肽或蛋白或肽的片段来自病毒、细菌或寄生虫。
使用包含恒定链或其变体的核酸构建体开发引发-加强方案并不总是直截了当的。
在一些实施方案中，提供了如上所述的编码至少一种恒定链和病毒、细菌或寄生虫抗原或其片段的核酸构建体，用于引发免疫应答，其中所述引发随后为用疫苗的后续加强疫苗接种。所述恒定链的变体可以是如本文其他地方指定的任何变体，包括其中一些结构域已通过例如氨基酸或区域的缺失或取代加以改变的恒定链。
在一个实施方案中，本发明涉及核酸构建体用于增加疫苗效力或用于引发免疫应答的用途。
在一个实施方案中，本发明公开了用于增加疫苗效力或用于引发免疫应答的方法，其包括以下步骤：
a.提供如本文所述的包含恒定链或其变体和抗原肽或其片段的核酸构建体，
b.通过施用步骤a)的核酸构建体引发受试者的免疫系统，由此刺激所述受试者中的免疫应答，和
b.通过施用合适疫苗加强步骤b)的免疫应答。
a.提供如本文所述的包含恒定链的变体和抗原肽或其片段的核酸构建体，
c.通过施用合适疫苗加强步骤b)的免疫应答，
其中所述恒定链的变体包含通过例如缺失或取代的trim区域的改变。
其中所述恒定链的变体包含通过例如缺失或取代的内体分选信号的改变。
其中所述恒定链的变体包含通过例如缺失或取代的信号肽的改变。
其中所述恒定链的变体是seqidno:1-8中任一个的变体，并且不包含前17个氨基酸。
其效力增加的疫苗可以是针对任何上述疾病或病症的疫苗。在一些实施方案中，所述疫苗是癌症疫苗。在其他实施方案中，所述疫苗针对异常生理应答。
疫苗类型
本发明的一个方面涉及受试者中的免疫应答引发，通过施用如上所述的包含li连接的抗原的核酸构建体来进行，随后为通过给相同受试者施用合适疫苗达到的后续加强。
根据本发明的合适疫苗优选具有与用于引发免疫应答的核酸构建体共同的至少一个相同特征。所述相同特征可以包含在恒定链的部分或全部、抗原肽的部分或全部、主链结构的部分或全部例如启动子区的部分或全部、增强子的部分或全部、终止子的部分或全部、多聚腺苷酸尾的部分或全部、接头的部分或全部、多聚接头的部分或全部、可操作接头的部分或全部、多克隆位点(mcs)的部分或全部、标记的部分或全部、终止密码子的部分或全部、内部核糖体进入位点(ires)的部分或全部和用于整合的宿主同源序列或其他限定元件的部分或全部中。
在一个优选实施方案中，相同特征是抗原肽或独特辅助t细胞表位的部分或全部。在一个最优选的实施方案中，相同特征是抗原肽的部分或全部。
在另一个优选实施方案中，相同特征是恒定链的部分或全部。
疫苗可以被视为常规或创新的。本文引用的疫苗类型中的任何可以在根据本发明的后续加强步骤中使用。
常规疫苗或第一代疫苗依赖于完整生物；已被杀死的致病菌株，或具有减毒致病性的菌株。
分子生物学技术已用于开发新疫苗，基于来自致病生物的个别抗原蛋白的第二代疫苗。概念上，抗原肽而不是完整生物的使用将避免致病性，同时提供包含最具免疫原性的抗原的疫苗。这些包括基于众所周知的灭活毒性化合物的基于类毒素的疫苗，和基于灭活或减毒致病菌株的片段的亚单位疫苗。
缀合物疫苗：特定细菌具有弱免疫原性的多糖外衣壳。通过使这些外衣壳与蛋白(例如毒素)连接，免疫系统可以导致识别多糖，如同它是蛋白抗原。
重组载体疫苗：通过使一种微生物的生理学和另一种的dna组合，免疫可以针对具有复杂感染过程的疾病产生。
合成疫苗主要或整个由合成肽、碳水化合物或抗原组成。
dna(或遗传)疫苗或第三代疫苗是用于开发预防和治疗疫苗的新的和有希望的候选物。dna疫苗由dna的小环状段(质粒)构成，其已进行遗传工程改造，以产生来自微生物的一种或多种抗原。将疫苗dna注射到机体的细胞内，其中宿主细胞的“内部机制”“阅读”dna，并且将其转变成致病蛋白。因为这些蛋白被识别为外来的，所以它们通过宿主细胞加工且在其表面上展示，以改变免疫系统，这随后触发一系列免疫应答。确保免疫应答的强度通过载体(即裸露dna、病毒载体、活减毒病毒等)效力、抗原表达水平和重组抗原自身(即高或低亲和力mhc结合物、对于或多或少有限的t或b细胞储库选择的结构决定簇等)的组合决定。免疫记忆的有效诱导要求或获益于cd4+(辅助细胞)t细胞与介导免疫记忆的许多效应的cd8+(细胞毒性)t细胞和b细胞的相互作用，这一般是真实的。
在本发明的一个实施方案中，用根据本发明的核酸构建体引发免疫应答随后为用于加强所述免疫应答的第一代或常规疫苗的后续施用。
在本发明的一个实施方案中，用根据本发明的核酸构建体引发免疫应答随后为用于加强所述免疫应答的第二代疫苗的后续施用。
在本发明的一个实施方案中，用根据本发明的核酸构建体引发免疫应答随后为用于加强所述免疫应答的第三代或dna疫苗的后续施用。
在dna疫苗构建体中使用恒定链以增加免疫原性是本领域众所周知的。在本发明的一个实施方案中，用根据本发明的核酸构建体引发免疫应答随后为用于加强所述免疫应答的dna疫苗的后续施用，所述dna疫苗包含恒定链或其变体。
在本发明的一个实施方案中，用根据本发明的核酸构建体引发免疫应答随后为用于加强所述免疫应答的腺病毒疫苗的后续施用。
疫苗可以进一步是单价的(monovalent)(也称为一价的(univalent))或多价的(multivalent)(也称为多价的(polyvalent))。单价疫苗设计为针对单一抗原或单一微生物免疫。多价或多价体疫苗设计为针对相同微生物的2种或更多种菌株，或针对2种或更多种微生物免疫。
在一个进一步实施方案中，将缓冲剂添加至疫苗组合物中。鉴于组合物的组分和用于施用于受试者的必要适合性，调节液体制备物的ph。合适地，液体混合物的ph为至少4，至少5，至少5.5，至少5.8，至少6。液体混合物的ph可以为小于9，小于8，小于7.5或小于7。在其他实施方案中，液体混合物的ph为4至9，5至8，例如5.5至8。因此，ph将合适地为6-9，例如6.5-8.5。在一个特别优选的实施方案中，ph为5.8至6.4。
适当的缓冲液可以选自乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、马来酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐和tris。在一个实施方案中，所述缓冲剂是磷酸盐缓冲剂，例如na/na2po4、na/k2po4或k/k2po4。所述缓冲剂可以以至少6mm、至少10mm或至少40mm的量存在于液体混合物中。所述缓冲剂可以以小于100mm、小于60mm或小于40mm的量存在于液体混合物中。
合适地，使用0.05ml至1ml，例如0.1至0.5ml的人剂量体积，尤其是约0.5ml或0.7ml的剂量体积。所用组合物的体积可以取决于递送途径和位置，其中通过皮内途径给予较小剂量。单位剂量容器可以含有过量，以允许在施用单位剂量期间适当地操纵材料。
尤其对于肠胃外施用，组合物应当是无菌的。灭菌可以通过各种方法进行，尽管灭菌通过过滤无菌级过滤器方便地进行。“无菌级过滤器”意指在大于或等于1x107/cm2的有效过滤面积的攻击水平下被微生物攻击后产生无菌流出物的过滤器。为了本发明的目的，无菌级过滤器对于本发明领域的技术人员是众所周知的，无菌级过滤器具有0.15至0.25μm、合适地0.18-0.22um、例如0.2或0.22um的孔径。
部件试剂盒
在一个方面，本发明涉及部件试剂盒，其包含含有如本文所公开的核酸构建体的组合物、用于施用所述组合物的医疗仪器或其他装置和使用说明书。
实施例
材料和方法
疫苗设计
mhc-iova和mhcii-ova呈递的分析
对于mhci抗原呈递，jawsii细胞用250moi/细胞的插入有ova的不同ad5构建体感染(图21a)。第二天，将细胞洗涤并用与mhc展示的ova片段siinfekl(seqidno:66)结合的抗小鼠h2kb染色。藻红蛋白(pe)荧光通过facscalibur分析，并使用flowjo解释数据。对于mhcii抗原呈递，105jaws细胞用250moi/细胞的插入有ova的不同ad5构建体感染(参见图21a)。第二天，将细胞洗涤并与4x104个bo-97.10(特异性识别与ova结合的mhcii的细胞系(hugo等人1993))一起孵育。共培养96h后，收获上清液并通过elisa测量il-2水平(使用il-2readysetandgo测定法(ebioscience,88-7024-86))。
t细胞应答的分析
最初通过在右后爪中疫苗接种后balb/c小鼠中的足垫肿胀测量来评价t细胞应答。小鼠用ad5-li-fur-it4var19-pfclinvar30(n=5)、ad5-sp-alb-it4var19-pfclinvar30(n=5)和ad5-li-it4var19-pfclinvar30(n=5)疫苗接种。每天用卡尺测量足垫肿胀，并且绘制与未疫苗接种的爪相比的增加以比较不同的疫苗接种组。疫苗接种后，细胞和细胞因子被募集至已引入抗原的位点以引发免疫应答。通过在足垫后面的松散组织中免疫，对载体和疫苗抗原的免疫应答引起肿胀，其可以通过卡尺测量。定量被解释为细胞免疫应答的强度的指标。
上清液和细胞胞质溶胶中的蛋白的检测
通过不同的插入有it4var19和pfclinvar30的ad5构建体以10ifu/细胞感染cos7细胞或以50ifu/细胞感染vero细胞24小时来研究抗原的分泌，其中培养基更换为无血清培养基。感染后48h收获上清液和细胞，并用np40和蛋白酶抑制剂混合物裂解细胞。使用vivaspin柱浓缩上清液。上清液在sds-page上运行并通过免疫的大鼠血清识别。一抗用抗大鼠碱性磷酸酶抗体识别，所述抗大鼠碱性磷酸酶抗体用bcip/nbt片剂揭示。通过测试与其天然配体epcr的结合来研究上清液和细胞裂解物中的it4var19和pfclinvar30的折叠。将nuncmaxisorp板用3μg/mlepcr胞外域包被，并将上清液和细胞裂解物添加至孔中。通过用免疫的大鼠血清识别it4var19或pflcinvar30来揭示两种蛋白的相互作用。用辣根过氧化物酶(hrp)缀合的多克隆兔抗大鼠识别大鼠抗体。使用elisa读板器(versamaxmoleculardevices)在450nm下测量光密度。
小鼠中的疫苗接种用于评价抗体应答
balb/c或在一些情况下c57bl/6小鼠在第0天用不同的cidr构建体(每组n=5)以2x109个颗粒肌肉内疫苗接种，并在同源加强(2x109个颗粒肌内)后8周加强。在第一次疫苗接种后2周、6周和10周收获血液样品。
抗体应答的分析：识别elisa：
从血液样品分离血清，并通过elisa分析抗体应答。nuncmaxisorp板用5μg/mlit4var19或pfclinvar30蛋白包被。将血清添加至孔中并相应稀释至所需的读出值。用辣根过氧化物酶(hrp)缀合的多克隆兔抗小鼠ig(p260dako,denmark)检测特异性识别it4var19和pfclinvar30的抗体。使用tmbplus(kem-en-tecdiagnostics,4395a)揭示孔。使用elisa读板器(versamaxmoleculardevices)在450nm下测量光密度。
抗体应答的分析：抑制elisa：
从血液样品分离血清，并通过elisa分析抗体应答。nuncmaxisorp板用3μg/mlecpr包被。将血清和it4var19或pfclinvar30蛋白混合，且然后测试抗体阻止与epcr结合的能力。通过hrpig抗his-标签鉴定it4var19或pfclinvar30和epcr之间的结合。使用tmbplus(kem-en-tecdiagnostics,4395a)揭示孔。使用elisa读板器(versamaxmoleculardevices)在450nm下测量光密度。
通过luminex分析交叉反应性抗体：
疫苗接种后10周，通过多路复用检测balb/c小鼠的血清中的交叉反应性抗体。将1/50稀释的血清与包被有不同cidr蛋白的珠粒孵育，并通过发光检测与珠粒的结合，如cham等人2008所述。
体内肿瘤进展的测量：
将c57bl/6小鼠在足垫中用ad5-li-弗林蛋白酶-p15e(n=5)或ad5-li-p15e(n=5)以2x107ifu免疫。在第155天，将小鼠用2x105个b16f10gp细胞(表达淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)的糖蛋白(gp)的免疫显性表位的鼠黑色素瘤细胞系)iv.攻击。攻击后14天，分离肺并在2%pfa于pbs中的溶液中固定过夜。转移被计数为肺表面的黑色结节。
抗p15e抗体应答的评价
统计分析
进行非参数mann-whitney检验以比较不同组之间的分析抗体应答。将来自第10周的血清(用于识别)稀释2倍并用非线性回归曲线分析，并计算曲线下面积(auc)并绘图用于比较。使用graphpadprism进行统计学分析。p-值<0.05被认为是显著的。用单向方差分析、随后newman-keuls检验分析足垫肿胀。
实施例1a：mhci-ova呈递
jawsii细胞如上文材料和方法部分中所述培养、感染、固定和染色，并通过流式细胞术分析。结果显示于图1中，并显示li-fur-ag复合物不影响mhc-i呈递。然而，d17-li-fur-ova插入的ad5显示ova构建体的呈递减少，即使内体分选途径通常不与mhci分选途径重叠，而是与mhcii分选途径重叠。
实施例1b：t细胞应答
疫苗接种后，细胞和细胞因子被募集至已引入抗原的位点以引发免疫应答。通过在足垫后面的松散组织中免疫，对载体和疫苗抗原的免疫应答引起肿胀，其可以通过卡尺测量。定量被解释为细胞免疫应答的强度的指标。
疫苗接种后，用li和li-fur构建体疫苗接种的小鼠的足垫比用spalb构建体疫苗接种的小鼠中更肿胀(图2)，表明用li和li-fur构建体，免疫应答比用spalb构建体更强烈。用li-和li-fur构建体疫苗接种导致非常相似水平的肿胀，表明非常相似的t细胞应答。
实施例2：mhcii-ova呈递
li-fur构建体显示在dc样细胞的表面上的ova的mhcii呈递增加。然而，呈递低于li-构建体，因为li-fur复合物的分泌降低内体的再摄取，因此降低mhcii呈递(图3)。
实施例3：编码的蛋白的表达
图4a显示可以在感染细胞的上清液中检测到设计为经由弗林蛋白酶识别位点和和白蛋白信号肽分泌的偶联抗原，其中li-cterm-fur是最有效的。图4b显示在非变性条件下，可以用li-fur和d17-li-fur检测三聚体。这是因为三聚化结构域存在于li中，因此编码的抗原作为三聚体分泌(还参见图18-20)。
实施例4：编码的蛋白的表达
从图5可以看出，在上清液和细胞裂解物中检测到两种编码的抗原it4var19和pfclinvar30与epcr的结合。与sp相比，li-fur-cidr构建体在sn中诱导更高水平的分泌抗原，而li-cidr以最小水平分泌，但在细胞内以高水平保留。这些发现还证实抗原的构象得到维持，并且epcr结合表位的可及性不受恒定链诱导的三聚化防止。
早在疫苗接种后2周检测到li-fur佐剂提供的增强的应答，其中抗体应答与单体分泌(sp-alb)和膜三聚体(li)相比增加(图6)。这显示li-fur佐剂触发加速和增强的免疫应答。疫苗接种后10周和同源加强后2周，对于每种编码的抗原，与两种其他构建体相比，抗体应答显著增加。
实施例6：增加的抗体应答
图7说明当比较li-fur构建体与突变构建体时，ess和三聚化的存在都提供对抗体应答的最佳佐剂效应，因为可以看出每个序列的缺失导致免疫应答的降低。
实施例7：增加的抑制应答
如图8中可以看出，疫苗接种后生成的抗体能够阻止it4var19和pfclinvar30结合其天然配体(epcr)，显示不仅抗体应答增加，而且用li和li-fur构建体也更有效。因此可以得出结论，与单独的li或具有sp-alb的分泌的抗原相比，li-fur佐剂不仅诱导抗体的更快产生和更高水平，而且诱导具有增加的功能性的抗体。
实施例8：增加的抗体应答的交叉反应性
发现与其他构建体相比，当小鼠用含有li-fur佐剂的构建体疫苗接种时，诱导的交叉反应性的强度更高，尤其是与cidr1.1的交叉反应性(图9)。与单独的li或分泌的抗原版本相比，使用该佐剂也增加遗传上另外的“var”基因(来自cidr1.4、1.7和1.8)的识别。因此，抗原与li-fur的栓系不仅触发更高和更有功能的抗体应答，而且还允许诱导的抗体的更一致的交叉反应性。在此同样，显示三聚化和ess结构域两者均提供最佳佐剂效应。
实施例9和10：在c57bl/6中诱导的抗体应答
这些图显示用balb/c小鼠获得并且上面显示的所有抗体结果(识别和抑制数据)在不同的小鼠品系(这里是c57bl/6小鼠)中可重复(图10和11)。
实施例11：li-fur对不同抗原(melarv中的p15e)的佐剂作用的分析
与ad5-li组相比，用li-fur构建体疫苗接种的小鼠显示肿瘤转移的显著减少(图12)。不幸的是，在ad5免疫后12周，由于检测相当低，不可能检测到两组之间抗体水平的差异。
实施例12：对来自恒定链ova连接的构建体的细胞上清液的elisa
将cos7细胞接种于6孔板中，其中每板具有50万个细胞，并且第二天使用lipofectamine用2ug各质粒转染。转染后两天，收获上清液并通过elisa测试ova含量。使用的质粒如下：(1)具有内部弗林蛋白酶识别位点的抗原(li/fur/int)；(2)具有c末端弗林蛋白酶识别位点的抗原(li/fur/c)；(3)具有内部tace融合蛋白酶识别位点的抗原(li/tace/int)；(4)具有c末端tace识别位点的抗原(li/tace/c)；天然lichova充当非切割对照(lichova)，且pgk和未转染细胞(未转染细胞)充当阴性对照。显示不同稀释物(倍数10，倍数100和倍数1000)的吸光度。可以看出，弗林蛋白酶识别位点导致ova抗原的分泌，而tace识别位点不能有效地导致ova抗原的分泌(图17)。
参考文献
becker等人(1994)useofrecombinantadenovirusformetabolicengineeringofmammaliancells.methodscellbiol43pta,161-189
cham等人(2008).asemi-automatedmultiplexhigh-throughputassayformeasuringiggantibodiesagainstplasmodiumfalciparumerythrocytemembraneprotein1(pfemp1)domainsinsmallvolumesofplasma.malarj7,108
colloca等人(2012)vaccinevectorsderivedfromalargecollectionofsimianadenovirusesinducepotentcellularimmunityacrossmultiplespeciessci.transl.med.4:1-9
diebold等人(2001).mhcclassiipresentationofendogenouslyexpressedantigensbytransfecteddendriticcells.genether.8:487-493.
hugo等人(1993)fibroblastscaninducethymocytepositiveselectioninvivo.procnatlacadsciusa90,(21),10335-10339
mittendorf等人,(2009)cd4+tcellsinantitumorimmunity:utilityofanli-keyher2/neuhybridpeptidevaccine(ae37)expertopin.biol.ther.,9:71-78
morris等人(2004).associationofintracellularproteinswithfoldedmajorhistocompatibilitycomplexclassimolecules.immunol.res.30:171-179.
pieters(1997).mhcclassiirestrictedantigenpresentation.curr.opin.immunol.9:89-96.
roy等人(2004)completenucleotidesequencesandgenomeorganizationoffourchimpanzeeadenovirusesvirol.324:361-372
roy等人(2010)creationofapanelofvectorsbasedonapeadenovirusisolatesj.ofgenemed.13:17-25
sambrook等人,编,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,2ndedition,coldspringharbor,n.y.,1989.
strubin等人(1986)alternativesplicingandalternativeinitiationoftranslationexplainthefourformsoftheiaantigen-associatedinvariantchainembojournal,5:3483–3488
strumptner-cuvelette,p.,和p.benaroch.(2002).multiplerolesoftheinvariantchaininmhcclassiifunction.biochem.biophys.acta.,1542:1-13。