N-（6-苯基硫烷基-1H-苯并咪唑-2-基）氨基甲酸甲酯对遍在蛋白-蛋白酶体途径的损害导致肿瘤细胞中有效的细胞毒作用
一种具有潜在治疗意义的新型抗增殖剂
来自印度潘吉布大学国家人类基因组研究与研究中心，印度昌迪加尔160014
关键词：抗癌药物，细胞凋亡，细胞生长，ER应激，p53，蛋白酶体，活性氧（ROS）
介绍
蛋白酶体是主要的蛋白水解复合物，负责真核生物中许多细胞蛋白的降解。蛋白酶体在细胞质和细胞核中都很丰富，它们催化短寿命调节蛋白的ATP依赖性蛋白水解以及错误折叠，受损和异常蛋白质。癌细胞积累更多氧化或突变/受损的蛋白质，这些蛋白质被蛋白酶体有效地去除。因此，它们很可能是更加依赖蛋白酶体的活性与正常细胞（比较1，2）。有了这个理由，蛋白酶体已成为治疗人类癌症的目标。Bortezomib是美国食品和药物管理局批准用于治疗晚期恶性血液病患者的第一种蛋白酶体抑制剂。不幸的是，治疗的功效仅限于狭窄的治疗窗口。硼替佐米作为单一药剂在非小细胞肺癌的活性有限，并且在前面已经报道具有在H460异种移植物没有抗肿瘤活性（3，4）。因此，寻找可以优先根除癌细胞的新型蛋白酶体抑制剂对于有效治疗疾病具有高度优先性。
在本研究中，我们报道用芬苯达唑（FZ）3治疗人肺癌细胞系诱导凋亡细胞死亡，而培养中的原代正常细胞仍然广泛不受影响。FZ可能通过干扰蛋白酶体功能和诱导未折叠蛋白反应发挥其细胞毒性，最终通过细胞凋亡的内在途径导致癌细胞死亡。
细胞培养和化学品所有细胞系在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中培养，所述培养基补充有10％热灭活的胎牛血清（FBS）和1x青霉素/链霉素抗生素（100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素）。根据各种实验的需要，用芬苯达唑，环己酰亚胺，MG132，NAC，TNFα，Z-VAD-FMK，Tiron或秋水仙碱处理细胞。
FZ;3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）;秋水仙碱;MG132;放线菌酮;JC-1（5,5'，6,6'-四氯-1,1'，3,3'-四乙基-苯并咪唑羰基酞菁碘化物）;Hoechst33342;碘化丙锭;N-半胱氨酸;TNFα;Z-VAD-FMK;蛋白酶体和半胱天冬酶底物;钛铁试剂;抗β肌动蛋白;抗乙酰Kip1泛素;抗GFP;anti-p27;抗Bcl2;抗小鼠IgG-荧光素异硫氰酸酯（FITC）;辣根过氧化物酶（HRP）-缀合的抗小鼠，抗兔和抗山羊IgG;并且所有细胞培养试剂均购自Sigma。IKK抑制剂wedelolactone从Calbiochem获得。抗p53（Bp53-12和DO1），抗p21，抗MDM-2，抗细胞周期蛋白B1，抗Bax，抗细胞色素c抗-IκBα和抗磷酸-JNK购自SantaCruzBiotechnology，Inc。（SantaCruz，CA）。
Hoechst/（染色碘化丙啶PI）在FZ处理后，将Hoechst33342和PI以100ng/ml浓度添加到培养基中15分钟，然后用预热的PBS洗涤细胞，并在荧光显微镜下检查以检测凋亡细胞。
TdT分析将H460细胞以亚汇合密度接种在35-mm组织培养板中的盖玻片上。接种后24个小时，细胞不处理或暴露于1μ米秋水仙碱FZ或130纳摩尔24小时。加尾反应物如由Gold所述进行（20）。简言之，在处理后，用PBS洗涤细胞并固定在1：3乙酸甲醇中。固定后，用PBS冲洗细胞，并在潮湿的室中于37℃孵育0.25单位/mlλ外切核酸酶10分钟。再次用PBS洗涤细胞，并在5μl50nmol生物素-dUTP存在下，在潮湿的室中与20单位/mlTdT酶一起在37℃温育1小时。然后通过在室温下在甲醇中的3％过氧化氢中温育15分钟来阻断内源过氧化物酶活性。最后使用来自ABC试剂盒（Vector）和3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐底物（Sigma）的抗生物素蛋白-生物素复合物进行检测。
DNA片段化分析如前所述进行DNA片段化测定（17）。用冷PBS洗涤对照和FZ处理的细胞。将细胞沉淀在裂解缓冲液（10mMTris（pH7.4），10mMEDTA（pH8.0）和0.5％TritonX-100）中裂解，并在4℃下孵育10分钟，然后与200μg一起孵育。/mlRNaseA在37°C下保持1小时。离心后，将上清液与200μg/ml蛋白酶K在50℃下孵育30分钟。接着，DNA片段用0.5沉淀米NaCl和50％的异丙醇，和将样品装入2％琼脂糖TBE凝胶，并用溴化乙锭染色。
免疫荧光细胞在盖玻片上生长，并用1μ处理米FZ或130纳摩尔秋水仙碱24小时的。处理后，用PBS洗涤细胞，并用4％多聚甲醛固定剂固定。再次用PBS洗涤细胞，并在4℃下与p53抗体一起温育过夜。第二天，在用PBS洗涤数次后，将细胞在FITC-缀合的二抗中于37℃温育1小时。在荧光显微镜下观察染色的细胞。
线粒体膜电位和细胞色素释放的测量c将A549细胞以亚汇合密度接种在35-mm组织培养板中的盖玻片上。24个小时后，将细胞暴露于指定剂量FZ的24个小时或10μ米12个小时MG132，它们被孵育5μ以下米中的COJC-1染料30分钟2培养箱中培养。在用预热的PBS洗涤数次后，使用568nm滤光器在荧光显微镜下定性评价线粒体膜电位。
使用免疫荧光染色检查细胞色素c的定位。如前所述，用盖玻片或MG132处理在盖玻片上生长的细胞。处理后，用PBS洗涤细胞两次，用PBS中的4％多聚甲醛固定20分钟，用PBS中的0.05％TritonX-100透化5分钟，充分洗涤，然后用PBS中的山羊血清封闭30分钟。一抗（抗细胞色素c）孵育在4℃下进行过夜。用PBS洗涤几次后，将细胞与FITC缀合的二抗在37℃温育2小时，洗涤数次，并在荧光显微镜下观察。
RT-PCR和定量PCR用FZ处理细胞，并使用硫氰酸胍法分离总RNA（22）。简而言之，处理后，将细胞用PBS洗涤并裂解，并在400微升溶液d（4收集米硫氰酸胍，0.75米的柠檬酸钠，10％
-laurylsarcosine，和0.1米β巯基乙醇）。这之后通过加入40μl的2米乙酸钠（pH4.0），400μl水饱和的苯酚和40μl49：1氯仿/异戊醇。然后将其混合并在冰上温育15分钟并在4℃下以9000rpm离心10分钟。用等体积的异丙醇沉淀RNA，重悬于焦碳酸二乙酯处理的水中，并使用分光光度计定量。最后，使用oligo（dT）18引物逆转录RNA，并进行RT-PCR分析。对于定量PCR，使用来自Eppendorf的RealMasterMixSYBRROX试剂盒。根据EppendorfMastercyclerRealplex实时PCR仪中的制造商说明设置反应。
组蛋白H1激酶测定市售纯化的组蛋白H1（Sigma公司）用CDK2从H460全细胞提取物相当于总蛋白的100微克在50μl激酶反应缓冲液中进行免疫沉淀（50米孵育米的Tris，pH7.2的10米米的MgCl2，1米米DTT，5μCi[γ-32P]ATP）在25℃下保持10分钟。通过SDS-PAGE分析样品，然后进行放射自显影。
电泳迁移率变动分析EMSA用不同剂量的FZ处理H460细胞4小时，然后根据Schreiber制备核提取物（25）。简言之，用冷PBS洗涤2×106个细胞，并悬浮于0.4ml裂解缓冲液（10MHEPES，pH7.9,10mMKCl，0.1mMEDTA，0.1MEGTA，1mMDTT，0.5）中。米米苯甲基磺酰氟，2.0μg/ml亮抑酶肽，2.0μg/ml抑肽酶和0.5mg/ml苯甲脒）。使细胞在冰上溶胀15分钟，然后加入12.5μl10％NonidetP-40。然后将管在涡旋机上剧烈混合10秒，并将匀浆物离心30秒。将核沉淀重悬于25μl冰冷的核提取缓冲液（20mMHEPES，pH7.9,0.4MNaCl，1mMEDTA，1MEGTA，1mMDTT，1mM）中苯甲基磺酰氟，2.0μg/ml亮抑酶肽，2.0μg/ml抑肽酶和0.5mg/ml苯甲脒），将管在冰上温育30分钟，间歇混合。然后将其在4℃下离心5分钟，立即使用上清液（核提取物）或在-70℃下储存备用。通过Bradford（23）的方法测量蛋白质含量。
通过将6μg核提取物与16fmol32P末端标记的45-mer双链NFκB寡核苷酸5'-TTGTTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGCGTGG-3'（26）在37℃温育30分钟来进行EMSA。孵育混合物由2-3μg聚（dI-dC）的结合缓冲液（25mMHEPES，pH7.9,0.5mMEDTA，0.5mMDTT，1％NonidetP-40,5％甘油和50mMNaCl）。将形成的DNA-蛋白质复合物与5％天然聚丙烯酰胺凝胶上的游离寡核苷酸分离，然后干燥凝胶。通过使用过量的未标记的寡核苷酸进行竞争来确定结合的特异性。
ER应激的分泌碱性磷酸酶（SEAP）测定将293T细胞接种在96孔板中，第二天用pSEAP-con质粒（Clontech）转染，其组成型表达SEAP。转染后24小时，将细胞保持未暴露或在含有1％FBS的新鲜培养基中暴露于不同浓度的指定药物。孵育24小时后，取出10μl条件培养基，并根据制造商（Clontech，PaloAlto，CA）描述的方案使用4-MUP底物评估SEAP活性。简言之，将10μl培养基与15微升5×SEAP测定缓冲液（0.5混合米为50微升，在96孔板中的总体积的Tris，pH值9.0，和0.5％BSA）并在65℃温育30分钟灭活内源性SEAP活性。将板在冰上冷却2分钟。然后25μl的1mM向各孔中加入4-甲基伞形酮磷酸酯底物，并在37℃下孵育2小时。使用96孔荧光板读数器（PerkinElmerMultilabelreaderVictorX3）测定SEAP的活性，激发设定为355nm，发射波长为460nm。一式三份进行三次独立实验。
活性氧（ROS）活性A549细胞生长于在35毫米培养皿中的盖玻片并用5μ处理米FZ或10μ米4小时MG132。在药物前2小时加入NAC（10mM）。为了测量活性氧物种的，处理后，将细胞洗涤并在37℃温育1μ中号DCF-DA在无血清培养基不含酚红1个小时。洗涤两次后，用100瓦汞灯照射样品，用尼康荧光显微镜上的FITC滤光片观察，观察DCFDA荧光。对于定量分析，在Victor3X荧光计（PerkinElmerLifeSciences）中在485nm激发后，在530nm处测量荧光强度。
报告分析p53和NFκB基因转录通过分别使用pWWP-Luc（27）或NFκB-Luc构建体的荧光素酶测定法测量FZ对p53-和NFκB-依赖性报道基因转录的影响。对于p53转录活性，在96孔板中用pWWP-luc和pCMV载体或pCMV-p53（WT）共转染H1299细胞。根据制造商的方案使用Lipofectamine2000（Invitrogen）进行转染。24小时后转染，细胞未处理或者用1μ处理米FZ24小时。类似地，对于NFκB报道分子测定，用携带NFκB结合位点和pRL-SV40的NFκB-Luc载体共转染A549细胞。次日，将细胞用5μ处理米FZ为4小时，然后是30ng/mlTNFα1小时，如图所示。在两种情况下，然后制备细胞提取物，并使用来自Promega的DualLuciferase测定试剂盒按照制造商的说明监测荧光素酶活性。使用96孔荧光板读数器（PerkinElmerLifeSciencesMultilabelreaderVictorX3）测定荧光素酶活性。pRL-SV40Renilla载体在所有情况下用于共转染以使数据标准化，并且其以较低浓度转染（比报告荧光素酶质粒低5倍）。数据表示为相对荧光素酶活性（萤火虫与Renilla值的比率）。实验一式三份进行。
统计分析除非另有说明，否则所有结果均表示为平均值±SD。学生t检验用于计算显着性，接受p<0.05作为显着性水平。
NSCLC细胞用FZ的温育导致核缩合和凋亡的核形态的碎片特性（图2，和b）。用Hoechst33342和PI双重染色细胞以检查它们的核形态和质膜完整性。与对照未处理细胞相比，48小时FZ处理的细胞具有显着数量的凋亡细胞核。其中许多呈现橙红色，是晚期凋亡的特征（图2A，cd）。用TdT介导的dUTP缺口末端标记系统进一步标记细胞核以验证细胞死亡的细胞凋亡性质。
TUNEL阳性细胞的数目显著观察后48小时治疗FZ（图2），然后将其定量（图2乙）。从处理过的细胞中提取的DNA表现出明显的梯状图案，这是凋亡细胞死亡的特征（图2D）。
当我们进行流式细胞术分析，结果表明，FZ处理导致细胞在G中积累2/M细胞周期，随后在分G的百分比的显著增加的阶段1凋亡人口，指示DNA降解的（图2E）。这可能是由于FZ诱导的G2/M检查点调节分子的稳定化，这有助于增强细胞毒性。细胞周期延迟G2/M可能是由于CDK2磷酸化的加速和延长以及细胞周期蛋白B1，p53和p21的稳定，这些都与G2/M检查点的控制有关（28）。CDK2激酶的磷酸化状态控制Cdc2-细胞周期蛋白B1复合物的活性，其负责有丝分裂的发生。因此，通过蛋白质印迹分析进一步检查参与G2/M转换的蛋白质水平。
。。。。。。。。。。。。。。。
。。。。。。。。。。。。。。。。。
。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。
中间部分图片太多难以编辑，对试验感兴趣的可以上网搜索或直接联系我们查看原文，下面直接上结论
。。。。。。。。。。
FZ属于一类广谱驱虫药，苯并咪唑类，具有高治疗指数。苯并咪唑作为有效驱虫剂成功的关键因素可归因于它们对蠕虫的选择性毒性和对正常人细胞的高度安全性。由于其结构的改进或通过在代谢和哺乳动物和目标寄生虫（之间的差异解毒途径由苯并咪唑寄生微管蛋白的选择性靶向：该先前已两种不同现象的基础上，说明10-12，38）。早些时候，一些属于这一类的化合物已被证明可作为有效的抗肿瘤药物，尽管分子机制仍然难以捉摸。在本研究中，我们显示芬苯达唑可作为生长抑制剂，并在人肺癌细胞系中引起凋亡细胞死亡。
泛素-蛋白酶体系统是细胞蛋白质稳态的组成部分。越来越多的人认识到这种途径对正常细胞功能和疾病的根本重要性已经促使人们深入研究选择性阻断这些途径功能的小分子抑制剂。因此，我们提出FZ作为靶向泛素-蛋白酶体途径并有效杀死癌细胞的新型候选药物。