土霉素主要用于治疗支原体、衣原体感染引起的疾病，对溶血性链球菌、肺炎链球菌等细菌也有抗菌作用。此外，还具有抑制霉菌的作用，在农业生产中也常用作杀菌剂来防治多种病虫害。
一、人用药物
1.呼吸道感染：如急性咽炎、扁桃体炎、鼻窦炎和支气管炎等上呼吸道感染；2.皮肤软组织感染：如毛囊炎、疖肿、蜂窝织炎及伤口感染等；3.泌尿生殖系统感染：如膀胱炎、肾盂肾炎、非复杂性尿路感染以及由淋病奈瑟菌所致的单纯性尿道炎或阴道炎等；4.其他：也可用于百日咳、梅毒、布鲁菌病、鼠咬热、回归热、霍乱、破伤风等多种疾病的治疗。
二、兽用药物
1.敏感菌引起肠炎、败血症、关节炎、滑膜炎、脑膜炎、子宫内膜炎、乳腺炎、结膜炎、角膜溃疡、皮下脓肿等全身各组织器官化脓性感染性疾病：2.敏感菌引起心包炎、肝周炎、关节积液、关节软骨炎、关节周围炎、关节纤维素溶解征(痛风)、关节坏疽、腱鞘炎、滑膜鞘炎、滑膜囊炎、滑膜囊肿、滑膜血管瘤、滑膜肉瘤、滑膜肿瘤、滑膜肉芽肿、滑膜脂肪样肉瘤、滑膜绒毛乳头状瘤、滑膜肥大、滑膜囊肿、滑膜皱襞综合征、滑膜炎、滑膜肉瘤、滑膜癌等各种滑膜病变性疾病；3.敏感菌引起眼睑、耳部、眼部、鼻窦、口腔、咽喉、泪腺、副鼻窦、睾丸、附睾、卵巢、输卵管、子宫、输精管、精囊、前列腺、输尿管、直肠、肛门、胆囊、胰腺、胸腹水、关节腔、关节囊、关节软骨、关节滑膜、关节软骨、关节囊、关节滑膜囊、关节软骨囊肿、关节软骨肉瘤、关节软骨癌等各种囊肿、肿瘤性疾病；4.敏感菌引起各种顽固难治的感染性疾病：5.土霉素还可作为预防用药，防止动物因传染病而发生继发感染导致死亡。
三、农业用途
1.防治线虫病：可与甲基萘唑合用，制成复方制剂进行喷雾防治。
2.防治螨虫病：常与杀螟松一起配成混合剂，喷洒在棉花苗期防治棉红蜘蛛。
3.防治介壳虫：可将土霉素溶液浸泡在棉花蕾期使用的药壶里，然后均匀地喷洒到棉花叶面，以达到防虫目的。
4.防治根尖腐烂病：可用0.6%的土霉素悬浮剂灌根防治花生根尖腐烂病。
5.防治黄曲跳石蚕：土霉素有较好的抑菌效果，可用于防治黄曲跳石蚕。
四、其他方面
土霉素对家禽蛔虫卵外膜有特殊亲和力，能选择性地吸附于虫卵外膜表面，使卵内外渗透压改变，从而影响其发育，最终杀死幼虫。因此，土霉素是理想的驱虫药之一，广泛应用于鸡、鸭、鹅、鸽子等动物的肠道寄生虫病的治疗。
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