本申请要求于2014年3月10日提交的美国临时申请61/950,623的权益，其全部内容通过引用并入本文。
背景
细小病毒B19(红细胞病毒属的一种)可以在胎儿和新生儿中引起严重的、有时是致命的疾病，例如胎儿水肿(hydropsfetalis)，宫内胎儿死亡和儿童的感染性红斑(erythemainfectiosum)(第五疾病(fifthdisease))。患有遗传性疾病(例如镰刀状细胞贫血(sicklecellanemia)或地中海贫血(Thalassemia))或获得性疾病(例如疟疾或贫血(anemia))的较大龄儿童和成人有发生细小病毒B19诱导的红细胞发育不全(redcellaplasia)或死亡的风险。免疫缺陷、器官移植、或HIV患者中的慢性贫血导致细小病毒B19感染。细小病毒B19的一种细胞受体是血型P抗原，这是一种红细胞糖苷酯(globoside)，在红细胞前体(erythroidprecursors)中表达并在成熟红细胞(RBC)上维持。到目前为止，尚无疫苗可用于预防人类红细胞病毒包括细小病毒B19的感染。因此，本发明的一些实施方案包括治疗(例如，预防或疫苗接种以抵抗)红细胞病毒感染(例如细小病毒B19感染和其他红细胞病毒)。
本发明的一些实施方案包括本发明多肽(例如突变的VP2蛋白)和由本发明多肽制备的病毒样粒子。本发明的其它实施方案包括用于治疗(例如，预防)红细胞病毒感染，包括细小病毒B19感染和其他疾病的多种组合物。其它实施方案包括治疗活跃的红细胞病毒感染(包括活跃的细小病毒B19感染)和其它疾病的方法。其它实施方案包括编码本发明多肽的核酸。本文还讨论了本发明的另外的实施例。
概述
在本发明的一些实施方案中，mVLP包含如本文所述的任何突变体VP2。在其它实施方案中，mVLP具有比wtVLP减少的与P抗原的结合，mVLP与P抗原没有可检测的结合，mVLP具有比wtVLP减少的红细胞血凝(hemagglutination)，或mVLP没有可检测的血凝。在其它实施方案中，mVLP具有一个或多个中和表位。在另外的实施方案中，mVLP在动物中诱导抗体(例如高滴度的抗体)的生成，其中所生成的抗体能减少或抑制wtVLP血凝。
本发明的一些实施方案包括包含本文所述任何mVLP的组合物。在一些情况下，所述组合物包含约0.0001％(总组合物重量)至约99％的mVLP量。在一些实施方案中，所述组合物可以进一步包含佐剂(adjuvant)或载物(carrier)。本发明的多个方面还包括包含本文所述任何mVLP的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物可包含约0.0001％(总组合物重量)至约50％的mVLP量。在一些情况下，药物组合物可以进一步包含佐剂或载物。在一些实施方案中，疫苗包含本文所述的任何mVLP。在一些实施方案中，疫苗可包含约0.0001％(以总组合物的重量计)至约50％的量的mVLP。在其他情况下，疫苗还包含佐剂或载物。在一些实施方案中，疫苗还包含角鲨烯(squalene)，IL-2，RIBI佐剂系统，QS21，GM-CSF，明矾水凝胶(alumhydrogel)，单磷酰脂质A(monophosphoryllipidA)，海藻糖二霉菌酸酯(trehalosedimycolate)，Toll样受体配体，Toll样受体激动剂，CpG寡脱氧核苷酸，细胞壁骨架，adjuplex疫苗佐剂，MF59，titermax，或其组合。在另一些实施方案中，疫苗不包含佐剂。
本发明的一些实施方案包括给动物提供mVLP的方法，包括一次或多次给药一种或多种包含本文所述任何mVLP的组合物，其中如果存在多于一次给药，组合物可以相同或不同。在一些方面，所述一种或多种组合物不包含佐剂。在其它方面，一种或多种组合物还包含载物，佐剂，角鲨烯，IL-2，RIBI佐剂系统，QS21，GM-CSF，明矾水凝胶，单磷酰脂质A，海藻糖二霉菌酸酯，Toll样受体配体，Toll样受体激动剂，CpG寡脱氧核苷酸，细胞壁骨架，adjuplex疫苗佐剂，MF59，titermax或其组合。在其它实施方案中，所述一种或多种组合物包含(a)本文所述的任何组合物，(b)本文所述的任何药物组合物，或(c)本文所述的任何疫苗。在其它实施方案中，一种或多种给药可以包括肠胃外给药，粘膜给药，静脉内给药，皮下给药，表面局部(topical)给药，皮内给药，口服给药，舌下给药，鼻内给药，或肌内给药。在一些情况下，如果存在多于一次给药，至少一次给药的至少一种组合物不同于至少一次其它给药的组合物。在其它实施方案中，将所述一种或多种组合物中的至少一种的mVLP以约0.01mgmVLP/kg动物体重至约15mgmVLP/kg动物体重的量给药于动物。在一些情况下，所述动物是人或灵长类动物。
本发明的一些实施方案包括用于产生本文所述任何多肽的方法，包括：培养宿主细胞，所述细胞用包含编码所述多肽的核酸序列的载体转染，以提供表达；然后回收所述多肽。在一些实施方案中，所述载体的制备包括用RNA逆转录或从头合成。在其他方面，宿主细胞是昆虫细胞(例如Sf9细胞)或哺乳动物细胞。其它实施方案包括编码选自下组的多肽的核酸序列：SEQIDNO:3；SEQIDNO:4；SEQIDNO:5；SEQIDNO:6；SEQIDNO:7；SEQIDNO:8；SEQIDNO:9；SEQIDNO:10；SEQIDNO:11；SEQIDNO:12；SEQIDNO:13；SEQIDNO:14；SEQIDNO:15；SEQIDNO:16；SEQIDNO:17；SEQIDNO:18；SEQIDNO:19；SEQIDNO:20；SEQIDNO:21；SEQIDNO:22；SEQIDNO:23；SEQIDNO:24；SEQIDNO:25；和SEQIDNO:26。
本发明的一些实施方案包括用于产生本文所述任何mVLP的方法，包括：培养用包含编码本发明多肽的核酸序列的载体转染的宿主细胞，以提供本发明多肽的表达；然后回收mVLP。在一些实施方案中，所述载体的制备包括用RNA逆转录或从头合成。在其他方面，宿主细胞是昆虫细胞(例如Sf9细胞)或哺乳动物细胞。其它实施方案包括编码选自下组的多肽的核酸序列：SEQIDNO:3；SEQIDNO:4；SEQIDNO:5；SEQIDNO:6；SEQIDNO:7；SEQIDNO:8；SEQIDNO:9；SEQIDNO:10；SEQIDNO:11；SEQIDNO:12；SEQIDNO:13；SEQIDNO:14；SEQIDNO:15；SEQIDNO:16；SEQIDNO:17；SEQIDNO:18；SEQIDNO:19；SEQIDNO:20；SEQIDNO:21；SEQIDNO:22；SEQIDNO:23；SEQIDNO:24；SEQIDNO:25；和SEQIDNO:26。
本发明的一些实施方案包括编码本文所述任何多肽的核酸分子。在其它实施方案中，编码多肽的核酸序列选自SEQIDNO:3；SEQIDNO:4；SEQIDNO:5；SEQIDNO:6；SEQIDNO:7；SEQIDNO:8；SEQIDNO:9；SEQIDNO:10；SEQIDNO:11；SEQIDNO:12；SEQIDNO:13；SEQIDNO:14；SEQIDNO:15；SEQIDNO:16；SEQIDNO:17；SEQIDNO:18；SEQIDNO:19；SEQIDNO:20；SEQIDNO:21；SEQIDNO:22；SEQIDNO:23；SEQIDNO:24；SEQIDNO:25；和SEQIDNO:26。在其他实施方案中，所述核酸序列与SEQIDNO：2具有至少90％的同一性。在其他实施方案中，所述核酸分子在细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、人细胞、或Sf9昆虫细胞中。在其它实施方案中，核酸分子被包括在载体(vector)或质粒中。本发明的一些实施方案包括包含编码本文所述任何多肽的核酸分子的载体。
本文还讨论了本发明的其它实施例。
附图的简要描述
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文给出的具体实施例的描述，可以更好地理解本发明。
图2：B19wtVLPs和mVLPs的电子显微照片。所有电子显微照片具有约72,000X～75,000X的放大倍数。(A)野生型VLP的显微照片。在实施例章节，野生型VLPs仅由野生型B19VP2蛋白制得；不包括其它蛋白。在实施例章节，野生型B19VLP称为wtVLP，也称野生型B19VLP。(B)由构建体A制得的mVLPs的显微照片。在实施例章节，突变的VLP称为mVLP，也称突变的VLP和突变的B19VLP。(C)由构建体B制得的mVLPs的显微照片。(D)由构建体D制得的mVLPs的显微照片。(E)由构建体E制得的mVLPs的显微照片。(F)由构建体F制得的mVLPs的显微照片。(G)由构建体F制得的mVLPs的显微照片。(H)由构建体G制得的mVLPs的显微照片。(I)由构建体H制得的mVLPs的显微照片。由构建体A、B、F、或G制得的mVLPs在形态上与wtVLPs相同。
图3：用人类O型血红细胞进行的血凝试验。进行血凝试验(HA)以确定P抗原结合能力。C-：HA阴性对照，加ADPBS[白蛋白-右旋糖PBS]而不是加wtVP2或mVLP。C+：HA阳性对照，加wtVLP。
图4：兔和小鼠的抗VLP多克隆抗体的血凝抑制试验(HIA)。用血凝抑制试验(HIA)确定小鼠和家兔体内产生的抗wtVLPs或抗mVLPs多克隆抗体对血凝反应的抑制作用。
图5：P抗原结合的卡通画示意图。不希望受卡通画所隐含的任何理论或原理的限制，此卡通画显示了B19病毒体、B19wtVLP、以及一例B19mVLP代表例与红细胞表面上P抗原结合(或无法结合)的实施方案。
图6：血凝现象的卡通画示意图。(A)不希望受卡通画所隐含的任何理论或原理的限制，此卡通画显示了可以在B19感染性病毒和红细胞(RBCs)之间发生以形成血凝作用的反应的实施方案，所述反应有可能在体内发生。(B)不希望受卡通画所隐含的任何理论或原理的限制，此卡通画显示了野生型B19VLPs之间可以发生的反应的实施方案，所述野生型B19VLPs保留了能与RBCs表面P抗原结合的配体，所述反应使得RBCs聚集，阻止B19VLPs被呈递给B细胞。(C)不希望受卡通画所隐含的任何理论或原理的限制，此卡通画显示了B19mVLPs之间可以发生的反应的实施方案，因不能与RBCs表面P抗原结合，导致有丰富的游离B19mVLPs能被呈递给B细胞。
发明详述
细小病毒B19由约5.6kb单链基因组DNA(NCBI序列号NC_000883.2)组成，其编码一种非结构蛋白(NS1)、两种结构蛋白(VP1和VP2)、以及7.5和11KD的蛋白。跨nt2624到nt4969的多个基因编码VP1(次要)和VP2(主要)衣壳蛋白。VP2蛋白(58KD)与VP1的C末端重叠，并且由至少95％的衣壳组成。VP1蛋白(81KD)比VP2长227个氨基酸，仅由5％的衣壳蛋白组成。P抗原是细小病毒B19的细胞受体；Ku80自身抗原和α5β1整合素是细小病毒B19进入细胞时的共同受体。在一些情况下(例如参见图5和图6)，细小病毒B19的P抗原结合可导致血细胞凝集，因此可阻断B细胞接近细小病毒B19；在一些情况下，这种不能接近可以防止免疫应答。
本发明的多肽、核酸分子和组合物
本发明的一些实施方案包括包含VP2多肽的本发明多肽，其中所述VP2多肽相对于野生型VP2(“wtVP2”)具有至少一个氨基酸修饰。术语“VP2多肽”包括突变的VP2多肽(例如对wtVP2多肽有一个或多个修饰)和wtVP2多肽。在一些实施方案中，wtVP2多肽可以是来自细小病毒的野生型VP2多肽、来自红细胞病毒的野生型VP2多肽、或来自细小病毒B19的野生型VP2多肽。在一些情况下，一个或多个修饰可包括插入、缺失、取代、或其组合。在一些实施方案中，对wtVP2的一个或多个修饰可以位于由本发明多肽形成的VLP中的三次对称轴的凹部内或靠近该凹部(例如，靠近可以是约约约约约约约约约约小于约或小于约的距离)。在一些方面，对wtVP2的一个或多个修饰可包括环3中的取代、环3中的缺失、环4中的取代、环4中的缺失、环3上游的取代、环3上游的缺失、环4上游的取代、环4上游的缺失、或其组合。在一些实施方案中，本发明多肽不包括天然存在的多肽。
除非另有说明，本文所用的术语“上游”是指相对于wtVP2中参考氨基酸或二级结构而言的氨基酸位置(例如，氨基酸398的上游或环3的上游)；该相对位置可以是距离所述参考氨基酸或二级结构有1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34或35个氨基酸。该相对位置可以是距离参考氨基酸或二级结构约1至约35个，约5至约30个，约10至约25个，约12至约20个，或约14至约18个氨基酸。该相对位置可以是距离参考氨基酸或二级结构至少约1个，至少约5个，至少约10个，至少约20个，不超过约20个，不超过约25个，不超过约30个，或不超过约35个氨基酸。
在一些实施方案中，一个或多个修饰可发生在wtVP2(例如，B19wtVP2)结合位点或病毒体(例如B19病毒体)结合位点，例如P抗原结合位点。在一些情况下，对wtVP2的一个或多个修饰可包括在Y401处的取代，在Y401处的缺失，在Q399处的取代，在Q399处的缺失，在Q400处的取代，在Q400处的缺失，在Q404处的取代，在Q404处的缺失，在Q368处的取代，在Q368处的缺失，在Q369处的取代，在Q369处的缺失，在Y392处的取代，在Y392处的缺失，或其组合。在其它实施方案中，对wtVP2的一个或多个修饰可包括Y401F，Y401W，Y401A，Q368A，Q369A，Q368N，Q369N，Q399N，Q400N，Q404T，Y392A，Y392F，Q404N，Y401P，T402A，D403A，Q404A，或其组合。在其它实施方案中，本发明的多肽是构建体A，构建体B，构建体C，构建体D，构建体E，构建体F，构建体G，构建体H，构建体I，构建体J，构建体K，构建体L，构建体M，构建体N，构建体O，构建体P，构建体Q，构建体R，构建体S，构建体T，构建体U，构建体V，构建体W，或构建体X(参见表1)。
在一些实施方案中，本发明的多肽可以具有与wtVP2有以下氨基酸序列同一性的多肽序列：约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.1％，约99.2％，约99.3％，约99.4％，约99.5％，约99.6％，约99.7％，约99.8％，约99.9％，约99.95％，约99.99％，小于约100％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，或至少约99.5％。在一些实施方案中，本发明的多肽序列与SEQIDNO：1有以下的氨基酸序列同一性：约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.1％，约99.2％，约99.3％，约99.4％，约99.5％，约99.6％，约99.7％，约99.8％，约99.9％，约99.95％，约99.99％，小于约100％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，或至少约99.5％。氨基酸序列同一性(例如，百分比同一性)可以通过任何合适的方法确定，例如使用BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2或Megalign软件。除非另有说明，氨基酸序列同一性(例如，百分比同一性)用BLAST-2测定。
在一些实施方案中，由本发明多肽制备的mVLP相对于wtVLP具有降低的对P抗原的结合能力。在其他实施方案中，由本发明多肽制备的mVLP没有可测量的与P抗原的结合。
本发明的一些实施方案包括可编码本发明多肽的核酸分子。在某些实施方案中，所述核酸分子包括在载体或质粒中。在某些实施方案中，所述核酸分子位于细胞中，例如昆虫细胞(例如Sf9)或哺乳动物细胞(例如CHO或HEK)。
在一些实施方案中，所述核酸分子序列与wtVP2有约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.1％，约99.2％，约99.3％，约99.4％，约99.5％，约99.6％，约99.7％，约99.8％，约99.9％，约99.95％，约99.99％，小于约100％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，或至少约99.5％的序列同一性。在一些实施方案中，所述核酸分子序列与SEQIDNO：2有约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.1％，约99.2％，约99.3％，约99.4％，约99.5％，约99.6％，约99.7％，约99.8％，约99.9％，约99.95％，约99.99％，小于约100％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，或至少约99.5％的序列同一性。核酸序列同一性(例如，百分比同一性)可以通过任何合适的方法测定，例如使用BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2，或Megalign软件。除非另有说明，核酸序列同一性(例如百分比同一性)用BLAST-2测定。
由于可以在本发明的核酸分子和/或多肽的结构中进行修饰或改变，而获得具有相似或改进特征的分子，故这样的生物功能等同物也包括在本发明的一些实施方案中。在某些情况下，生物功能等同物可包含经过改造而含有不同序列同时保留编码期望的本发明多肽的能力的核酸。这可以由于编码相同氨基酸的遗传密码的简并性(即，存在多个密码子)而实现。在一个实例中，本领域普通技术人员可能希望将限制性内切酶识别序列引入核酸序列中，同时不干扰多核苷酸编码蛋白质的能力。
在另一个实例中，所述核酸分子可以被改造成含有某些序列，导致(并编码)具有更显著变化的生物功能等同物。在一些实施方案中，某些氨基酸可以取代蛋白质结构中的其它氨基酸，而不明显丧失所需功能，该功能例如突变型VP2蛋白之间的分子间相互作用，mVLP的形成，mVLP的P-抗原结合的减少，mVLP血凝反应的减少，mVLP的中和表位，或mVLP中和表位对抗体的诱导。所谓的“保守”变化不破坏蛋白质的所需生物活性，因为该结构变化不影响蛋白质执行其所需功能的能力。本发明的一些实施方案包括可以在本文公开的核酸分子序列和多肽序列中进行的各种改变。
就功能等同物而言，本领域普通技术人员都理解，“生物功能等同的”多肽或多核苷酸的定义中固有的概念是，在该分子指定部位进行改变但同时保留目标生物活性的可接受水平时，所述改变的数量是受限制的，这里提到的目标生物活性的可接受水平例如突变型VP2蛋白之间的分子间相互作用、mVLP形成、mVLP的P-抗原结合的减少、mVLP血凝的减少、mVLP的中和表位、或mVLP中和表位对抗体的诱导。因此，生物功能等同物在本文中定义为一些多肽(和核酸分子)，在它们的结构中指定的氨基酸(或密码子)可能已被取代。
通常，分子的长度越短，能在分子中进行的保持功能的变化越少。较长的域可以具有中间数量的改变。全长蛋白质最能耐受较大量的变化。然而，必须认识到，高度依赖于结构的某些分子或域可能只容许很少的修饰或不容许有修饰。
氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。对氨基酸侧链取代基的大小、形状或类型的分析揭示，精氨酸、赖氨酸或组氨酸都是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸都具有相似的大小；或者，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸都具有大致相似的形状。因此，基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸或组氨酸；丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸；或者，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸；在本文中定义为生物功能等同物。其它氨基酸虽然在此不分组归类，但也可能提供功能等同的多肽。
氨基酸的疏水指数(hydropathicindex)也可以考虑。每个氨基酸按其疏水性或电荷特性分配了一个疏水指数，它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；或精氨酸(-4.5)。氨基酸疏水指数可用于体现(confer)蛋白质在相互作用方面的生物功能。在一些情况下，某些氨基酸可以取代为具有相似疏水指数或分数或仍保持相似生物活性的其他氨基酸。在基于疏水指数进行改变时，可以用疏水指数在±2以内或±1以内或±0.5以内的氨基酸取代。
相似氨基酸的取代也可以基于亲水性进行，特别是在由此产生的生物功能等同多肽或肽打算用于免疫学实施方案中时，如在本发明的某些实施方案中那样。美国专利4,554,101指出，多肽的最大局部平均亲水性受其邻近的各个氨基酸的亲水性掌控，该最大局部平均亲水性可与其免疫原性或抗原性(即，与该多肽的生物特性)关联。
如美国专利4,554,101中详述，各氨基酸残基分配了以下亲水值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水值进行改变时，可以用亲水值在±2以内、或±1以内、或±0.5以内的氨基酸进行取代。
保守取代的序列是指，指定的氨基酸残基被具有相似理化特性的残基替代。保守取代的实例包括一个脂肪族残基取代另一个脂肪族残基，例如Ile、Val、Leu或Ala彼此的取代，或一个极性残基取代另一个，例如Lys与Arg、Glu与Asp、或Gln与Asn之间的取代。其他这样的保守取代包括例如具有相似疏水性特征的整个区域的取代。
尽管讨论集中于由氨基酸变化产生的功能等同多肽，但是应当理解，这些变化可以通过改变编码DNA来实现；还应考虑到遗传密码是简并性的，两个或多个密码子可以编码相同的氨基酸。下面提供了氨基酸及其密码子的列表，用于这类实施方案中，以及用于其他用途，例如探针和引物的设计等等。
表A和B.氨基酸的命名和密码子列表
术语“功能等同的密码子”在本文中用于指编码相同氨基酸的密码子，例如精氨酸或丝氨酸的六个密码子，还指编码生物学等同的氨基酸的密码子(参见上述密码子列表)。
还将理解，氨基酸和核酸序列可以包括另外的残基(例如另外的N端或C端氨基酸或5'或3'序列)但仍然基本上就是本文公开的一个序列，只要该序列满足上述标准，包括考虑多肽表达后维持生物活性。末端序列的添加特别适用于核酸序列，例如可以在编码区的5'或3'侧翼包括各种非编码序列，或者可以包括已知在多种基因中会出现的各种内部序列(即，内含子)。
本发明在一些方面有赖于肽和多肽在细胞中的(incyto)合成，其通过对合适的多核苷酸进行转录和翻译来实施。这些肽和多肽将包括二十个“天然”氨基酸，及其翻译后修饰。然而，体外肽合成允许使用修饰的或不常见的氨基酸。示例性但非限制性的修饰或不常见氨基酸的列表提供在表C中。
本发明公开的主题还包括产生包含VP2多肽突变体的多肽(或VLP，包括自我装配成VLP的多肽)的方法。真核表达系统包括基于植物的系统；借助重组杆状病毒的昆虫细胞系统；借助重组杆状病毒的全昆虫系统；遗传改造的酵母系统，包括但不限于糖酵母物种(Saccharomycessp)和毕赤酵母物种(Picchiaspp)；以及哺乳动物细胞系统，包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞或通常用于重组蛋白的工业规模表达的其它细胞系。在一些实施方案中，有用的基于植物的表达系统可以包括转基因植物系统。在一些实施方案中，有用的基于植物的表达系统可以包括叶绿体转基因植物系统(transplastomicplantsystems)。
在一些实施方案中，产生本发明多肽(其可以自我组装成VLP)的方法包括，提供含有本文所述多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸在表达编码多肽的条件下与启动子可操作地连接；并从宿主细胞中回收多肽。
一种或多种VP2多肽突变体可以是组合物的一部分，并且其含量可以是(以总组合物的重量计)至少约0.0001％，至少约0.001％，至少约0.10％，至少约0.15％，至少约0.20％，至少约0.25％，至少约0.50％，至少约0.75％，至少约1％，至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，至少约99.99％，不超过约75％，不超过约90％，不超过约95％，不超过约99％，或不超过约99.99％，从约0.0001％至约99％，从约0.0001％至约50％，从约0.01％至约95％，从约1％至约95％，从约10％至约90％，或从约25％至约75％。
一种或多种VP2多肽突变体可以纯化或分离至含量为(以总组合物的重量计)至少约0.0001％，至少约0.001％，至少约0.10％，至少约0.15％，至少约0.20％，至少约0.25％，至少约0.50％，至少约0.75％，至少约1％，至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，至少约99.99％，不超过约75％，不超过约90％，不超过约95％，不超过约99％，不超过约99.99％，从约0.0001％至约99％，从约0.0001％至约50％，从约0.01％至约95％，从约1％至约95％，从约10％至约90％，或从约25％至约75％。本发明的一些实施方案包括包含一种或多种VP2多肽突变体的组合物。在某些实施方案中，组合物是药物组合物(例如疫苗)，例如适合给药于动物(例如哺乳动物，灵长类动物，猴，人，犬，猪，小鼠，兔，或大鼠)的组合物。
病毒样粒子和组合物，包括药物组合物
一个或多个mVLP可以是组合物的一部分，并且其含量可以是(以总组合物的重量计)至少约0.0001％，至少约0.001％，至少约0.10％，至少约0.15％，至少约0.20％，至少约0.25％，至少约0.50％，至少约0.75％，至少约1％，至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，至少约99.99％，不超过约75％，不超过约90％，不超过约95％，不超过约99％，或不超过约99.99％，从约0.0001％至约99％，从约0.0001％至约50％，从约0.01％至约95％，从约1％至约95％，从约10％至约90％，或从约25％至约75％。
一种或多种mVLP可以纯化或分离为含量(以总组合物的重量计)至少约0.0001％，至少约0.001％，至少约0.10％，至少约0.15％，至少约0.20％，至少约0.25％，至少约0.50％，至少约0.75％，至少约1％，至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约90％，至少约95％，至少约99％，至少约99.99％，不超过约75％，不超过约90％，不超过约95％，不超过约99％，不超过约99.99％，从约0.0001％至约50％，从约0.01％至约95％，从约1％至约95％，从约10％至约90％，或从约25％至约75％。
本发明的一些实施方案包括包含一种或多种mVLP的组合物。在某些实施方案中，所述组合物是药物组合物(例如疫苗)，例如适于给动物(例如哺乳动物，灵长类动物，猴，人，犬，猫，猪，小鼠，兔，或大鼠)给药的组合物。在一些情况下，所述药物组合物是无毒的，不引起副作用，或两者兼之。在一些实施方案中，可能存在固有的副作用(例如，其可能损害患者或可能对某些患者是在一定程度上有毒的或有害的)。
“治疗有效量”是指有效实现所需和/或有益效果的量。有效量可以在一次或多次给药中给与。为了本发明的一些目的，治疗有效量是适于治疗适应症的量。治疗适应症是指，实现任何期望的效果，诸如减轻、改善、稳定、逆转、减速、或延缓疾病进展，增加生活质量，或延长寿命中的一种或多种。这种实现可以通过本领域已知的任何方法测量，例如抗体滴度的测量。
在某些实施方案中，其它制剂(例如药物组合物的各种制剂)可包括将药物(或控释制剂)掺入食品、食材(foodstuffs)、饲料或饮料中而得的那些。
在一些实施方案中，所述组合物可以包括单位剂量的一种或多种mVLP与药学上可接受的载体的组合，并且另外可以包括其它医疗制剂，药物制剂，载物，佐剂，稀释剂和赋形剂。在某些实施方案中，载物，媒介或赋形剂可以促进组合物的给药、递送和/或改善组合物的保存。在其它实施方案中，一种或多种载物包括但不限于，盐水溶液如生理盐水，林格氏溶液(Ringer'ssolution)，PBS(磷酸盐缓冲盐水)，以及含有或不含糖添加剂如葡萄糖的各种盐(包括钾盐和磷酸盐)的混合物。载物可以包括水性和非水性无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂，杀菌性抗生素，以及使制剂与预期接受者的体液等渗的溶质；还有水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。在其它实施方案中，一种或多种赋形剂可包括但不限于水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等，及其组合。也可以向组合物中加入无毒辅助物质，例如润湿剂，缓冲剂或乳化剂。口服制剂可包括常用的赋形剂，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。
在某些实施方案中，组合物(例如药物组合物或疫苗)的给药诱导免疫应答以预防或改善未来感染的影响。根据预期的给药方式，本发明的组合物可以是各种形式的药物组合物。可以使用制备疫苗和致免疫剂的任何方法，如美国专利4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792；和4,578,770所举例的那些。通常，这样的疫苗被制备为液体溶液或悬浮液形式的注射剂；也可以制备固体形式，是适于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。制剂也可以乳化。此外，如果需要，疫苗可以含有少量辅助物质，例如增强疫苗效力的润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂或佐剂。
肠胃外给药(如果使用的话)通常以注射为特征。无菌注射剂可以制备成常规形式(液体溶液或悬浮液)，适合于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式，或作为乳液。
给药途径和疾病的治疗
本发明的mVLP可以以任意多种合适的给药途径或制剂给药于动物。本发明的mVLP也可用于治疗动物的各种疾病。动物包括但不限于哺乳动物，灵长类动物，猴(例如猕猴(macaque)，恒河猴(rhesusmacaque)或猪尾猕猴(pigtailmacaque))，人，犬，猫，牛，猪，禽(例如小鸡)，小鼠，兔和大鼠。本文中，术语“受试者”是指人和动物受试者。易受细小病毒感染，红细胞病毒感染或B19细小病毒(例如人)感染的受试者可以是人或动物受试者。
本发明mVLP的给药途径可以是任何合适的途径。给药途径可以是但不限于口服途径，胃肠外途径，皮肤途径，鼻道途径，直肠途径，阴道途径和眼部途径。在其它实施方案中，给药途径可以是肠胃外给药，粘膜给药，静脉内给药，皮下给药，表面局部给药，皮内给药，口服给药，舌下给药，鼻内给药或肌内给药。给药途径的选择可取决于mVLP特性(例如，mVLP的物理和化学性质)以及动物的年龄和体重，特定疾病和疾病的严重性。当然，可以根据需要组合多种给药途径来给药。
本发明的一些实施方案包括向受试者提供包含本文所述mVLP的组合物(例如药物组合物)的方法，所述方法包括一次或多次给药一种或多种所述组合物；如果存在多于一次给药，则组合物可以相同或不同。
在一些情况下，对于每个接受者，必需的疫苗总量可以从用其它疫苗免疫的方案推导。在一些实施方案中，所需的mVLP的确切量可以在不同受试者中有不同，取决于受试者的物种，年龄，体重和一般状况，所用的具体融合蛋白，其给药方式，等等。在其它实施方案中，剂量将接近其它疫苗的给药的典型剂量，并且可以是约1ng/kg至约1mg/kg体重，约10ng/kg至约15mg/kg，或约10ng/kg至约100mg/kg。
在一些实施方案中，儿童(即，约0至约18岁)可以在他们进入小学之前(即，从约0至约13岁)接种疫苗。在其它实施方案中，可以给处于风险的动物免疫。处于危险中的动物包括但不限于，已经输血、器官移植的动物，具有感染性疾病(例如，HIV或疟疾)的动物，有孩子(例如，18岁以下孩子)的怀孕动物(例如，人类妇女)，被细小病毒B19感染的动物，生活在疟疾流行地区的动物(例如儿童)，免疫缺陷动物(例如器官移植受体，经历化疗的动物，经历骨髓移植的动物，或HIV阳性动物)，或具有自身免疫疾病(例如，系统性红斑狼疮；SLE，脑膜脑炎和纤维肌痛)的动物。
在一些实施方案中，本文公开的治疗可包括使用其它药物(例如抗生素)或治疗疾病的疗法。例如，抗生素可用于治疗感染，并可与mVLP组合以治疗疾病(例如感染)。在其它实施方案中，静脉内免疫球蛋白(IVIG)疗法可以作为细小病毒感染(例如红细胞病毒感染或细小病毒B19感染)的治疗方案的一部分(即，不仅仅是给药mVLP)。
实施例
介绍和设计和生成B19VP2突变体
突变的VP2基因每一个都通过双重PCR法产生。为此，N末端和C末端DNA片段使用两组引物分别产生，这两种片段退火后，用能使VP2ORF的5'和3'末端退火的引物进行另一PCR，由此生成全长VP2基因。将全长PCR产物克隆到pFASTBac1中，生成重组杆状病毒(rBac)。然后使用rBac在Sf9昆虫细胞中表达VP2。
克隆并表达突变的B19VP2基因
以杆状病毒的密码子优化型VP1迷你基因(IntegratedTechnologies，Iowa)的基因型1(NCBI参考序列NC_000883.2)作为模板，通过对它的双重PCR产生定点突变。用高保真TagDNA聚合酶(PlatinumTagDNApolymeraseHighFidelity,LifeTechnologies,CA)扩增多个全长VP2基因片段，进行凝胶纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒；Qiagen，CA)，克隆至pCR-XL-Topo(LifeTechnologies，CA)质粒，全面测序，再亚克隆至pFASTBac1，从中产生重组bacimids并进而产生杆状病毒，操作过程遵循试剂盒(Bac-to-Bac杆状病毒表达系统；LifeTechnologies，CA)制造商提供的程序。mVP2在Sf9昆虫细胞中的表达首先用免疫荧光(IF)和免疫印迹(IB)(Ghimetal.Virology(1992)vol.190,No.1,pp.548-552)检测。将专为克隆mVP2基因而产生的重组大肠杆菌和具有正确的VP2蛋白的重组杆状病毒接种物都予以冷冻，以备将来研究。
表1:B19VP2多肽野生型和突变体
用电子显微镜检查B19VP2多肽形成B19病毒样粒子(VLP)的能力。
为了纯化B19wtVLPs(B19野生型VLP)和B19突变VLP(B19mVLPs)，在rBac感染的72小时后收集(750rpm，10分钟)细胞，悬浮在Tris缓冲液(20mMTris，0.25MNaCl，pH8.5)中，匀浆(downshomogenized)，45℃温育10分钟。将pH调至7.2，密度调至1.30g/ml，然后在SW15Ti(BeckmanCoulter，MO)中以32,000rpm超速离心过夜。收集VLP条带，在Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中透析。测量VLP储液的蛋白质浓度(Bio-RadProteinAssay；BioRad，CA)。
为进行电子显微镜检，将纯化的VLPs和mVLPs加载到涂覆formvar-碳的300目铜网上，用2％磷钨酸(pH6.8)染色，在透射电子显微镜(EM:100S,JEOLLtd.,Tokyo,JPN)下观察。
仅使用突变的B19VP2蛋白尝试构建突变的B19VLPs(mVLPs)；这些mVLPs中不包括其他蛋白质。尽管少数VP2突变体未形成mVLPs，大多数形成了在形态上类似于野生型VLPs的mVLPs(例如，见图2A-图2I)，但是产率各不相同；VLP组装的紧密度也不同。
血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HAI)
纯化的B19VLPs的血凝试验用人RBC进行，以研究与P抗原结合的能力(参见图5和图6，其代表P抗原结合引起的血凝反应的一些实例及其可能造成的效果)。HIA试验确定抗VLPs抗体对血凝反应的抑制，所述VLP由野生型B19VP2蛋白生成(“野生型VLPs”或“wtVLPs”)或由突变的B19VP2多肽生成(“突变VLPs”或“mVLPs”)；HIA试验用于确认能诱导中和抗体的构象表位存在的证据。
兔和小鼠的免疫：兔皮下免疫，Balb/c小鼠腹膜内免疫。兔和小鼠以两周的间隔注射两次，每次100μg，使用了Titermax或Adjuplex疫苗佐剂(Sigma-Aldrich，MO)，然后在一个月后进行末次加强注射。如果需要，在末次加强注射后的一周至10天时进行最大放血。
ELISA试验：为了进行ELISA试验，将稀释在PBS(pH7.2)中的VLPs在ELISA板(ImmunolonII，Dynatech)上37℃包被1小时。板用含有5％牛血清白蛋白的PBS(5％PBSA)37℃保温1小时而饱和后，添加用1％PBSA稀释的一抗，37℃再保温1小时。用碱性磷酸酶标记的二抗和Sigma104底物(Sigma-Aldrich，MO)检测所结合的一抗。
血凝试验(HA)：简言之，将100μlVLP液(在ADPBS[白蛋白-右旋糖PBS；0.05MPBS，pH6.3，0.2％牛血清白蛋白，5g/L右旋糖]中的0.01至0.5μg/ml)置于圆底微量滴定板的孔中，再添加50μl在ADPBS中的2％hRBC(人类红细胞，经野生型VLP预先测试存在P抗原，作为抗原：人类O型血；InnovativeResearch，MI)，4℃保温2小时。读取结果。
血凝抑制试验(HIA)：将50μl在ADPBS中连续稀释的抗体与50μl在ADPBS中稀释的VLPs一起于室温(RT)温育30分钟。加入50μl2％hRBCs，4℃保温2小时，然后读取血凝结果。
HA和HIA试验的结果：图3显示wtVLPs或mVLPs的血凝试验(HA)结果。该HA中使用人类O型红细胞。图4包括抗B19VLPs多克隆兔或小鼠抗体的血凝抑制试验的结果，所述B19VLPs含有野生型VP2或mVP2。该试验中使用人类O型红细胞和野生型VLPs。
表2提供了各种构建体和相应mVPLs的一些特征的概述。
表2.B19VP2突变分析和一部分特征的总结
构建体J、K、M和N在这些条件下不产生纯化的mVLPs。
1小鼠免疫原性：wtVLPs不导致鼠红细胞凝集。然而，不能确定它们之间绝对没有弱结合。因此，该结果不一定反映人类中mVLPs的免疫性。
2HIA(血凝抑制试验)：抗mVLPs抗体抑制wtVLPs的血凝反应。该测试使用鼠多克隆抗体进行。采用TiterMax佐剂进行免疫。
表3显示抗B19野生型VLPs或抗B19mVLPs的兔血清的交叉反应性。抗体稀释至1/4000，它们的反应性用直接ELISA测量。用碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG抗体作为二抗，光密度在410nm处测量。
表3-交叉反应
<-表示抗该抗原的抗体
表4显示抗B19野生型VLPs或抗B19突变VLPs的小鼠多克隆抗体的滴定。抗体滴度用ELISA测量。野生型VLPs已知在小鼠中无免疫原性。用于产生每种多克隆抗体的免疫原被用作该分析的抗原。OD在410nm测量。所有抗体当与作为阴性对照抗原的牛白蛋白反应时，产生小于0.200的OD。
表4.抗体稀释至1/500。ODs超过1.00用粗体表示。
由构建体F制备的mVLPs是HA阴性的，在小鼠中有免疫原性(表2和图3)，诱导了能抑制wtVLPs的HA的抗体(图4)。
针对野生型VLPs产生的兔抗血清能识别构建体AmVLPs和构建体BmVLPs，是在ELISA试验中确定的，这再次证实了在这些mVLPs表面存在交叉反应性表位。
HTYFPN中Y突变而产生HTFFPN(构建体I)导致形成良好的mVLPs，这些mVLPs能使RBC部分地凝集，但是它们在小鼠中的免疫原性较低。
本问使用的标题不意味着暗示与该标题有关的所有公开都在从该标题开始的部分内找到。对于任何主题的公开可以在整个说明书中找到。
应当注意，诸如“优选”，“通常”和“常常”等术语在本文中使用不是为了限制所要求保护的发明的范围或暗示某些特征对于所要求保护的发明的结构或功能是关键的、必要的、或甚至是重要的。而是，这些术语仅旨在强调可以在本发明的具体实施方案中使用或不使用的多个备选特征或附加特征。
除非另有说明，否则在本公开中使用的“一个”(“a”or“an”)是指一个或多于一个。如权利要求中所使用的，当与词语“包括”联用时，词语“一个”或“一种”是指一个或多于一个，除非另有说明。如在本公开或权利要求中所使用的，“另一”是指至少第二个或更多个，除非另有说明。如在本公开中所使用的，短语“诸如”，“例如”和“(缩写的)例如”表示“例如但不限于”，意思是后文所列出的术语提供了一些例子，但是所列不一定是全面的列出而不再包含其它。词语“包括”意指在词语“包括”之后的项目可以包括另外的未记载的元件或步骤；即“包括”不排除额外的未列举的步骤或元件。
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本文提供了一个或多个实施方案的详细描述。然而，应当理解，本发明可以以各种形式实施。因此，本文公开的具体细节(即使表明是优选的或有利的)都不应被解释为限制性的，而是用作权利要求的举例说明，并且作为教导本领域技术人员以任何适当方式应用本发明时的代表例。实际上，除了本文所描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说从前面的描述和附图中将变得显而易见。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。
序列表
<110>路易斯维尔大学研究基金会有限公司(UniversityofLouisvilleResearchFoundation,Inc.)
Ghim,Shin-je
Jenson,A.Bennett
Trent,JohnO.
<130>35783.04055
<150>US61/950,623
<151>2014-03-10
<160>76
<170>PatentIn版本3.5
<210>1
<211>554
<212>PRT
<213>细小病毒B19
<400>1
MetThrSerValAsnSerAlaGluAlaSerThrGlyAlaGlyGlyGly
151015
GlySerAsnProValLysSerMetTrpSerGluGlyAlaThrPheSer
202530
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354045
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505560
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115120125
LysAspValThrAspLysThrGlyGlyGlyValGlnValThrAspSer
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275280285
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<210>2
<211>1665
<212>DNA
<400>2
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<210>3
<213>人工序列
<220>
<223>构建体A
<400>3
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<210>4
<223>构建体B
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<223>构建体C
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<223>构建体D
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<223>构建体F
<400>8
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<223>构建体G
<400>9
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<223>构建体H
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<223>构建体I
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<223>构建体L
<400>14
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