本发明涉及一种猫杯状病毒假病毒的制备方法，属于基因工程。
背景技术：
1、猫杯状病毒(felinecalicivirus，fcv)属于杯状病毒科疱疹病毒属成员，为大部分猫科动物的高致病性的病原体，在猫科动物中广泛的流行，且呈世界性分布。fcv能通过鼻、口腔和关节等途径感染猫科动物，传染性很强，其主要感染猫，能够引起典型的呼吸道症状和口腔溃疡，此外还可以感染包括狮子、老虎、猎豹等在内的猫科野生动物，对猫以及珍稀野生动物的健康造成了很大的威胁。近期一些报道认为fcv病毒的致病性呈逐渐增强趋势，fcv强毒变异株不断爆发，不仅会引起上呼吸道疾病，还可引起脾脏、肝脏的病变，更严重的会引起致命的全身性疾病。
2、在对猫杯状病毒进行科学研究和药物筛选时，需要直接使用fcv病毒，但由于fcv病毒致病性高、传染性强，因此急需开发安全有效的fcv研究手段。假病毒是指一种反转录病毒能够整合另外一种不同种类病毒的囊膜糖蛋白，形成的具有外源性病毒的囊膜，而基因组保持着反转录病毒本身基因组特性的病毒。假病毒由于核酸分子的缺陷性而只有一个细胞感染周期，因此具有较高生物安全性，被广泛应用于病毒的研究、抗病毒制剂的筛选和疫苗的研发等方面，在病毒核酸检测时还可作为阳性对照标准品和内控标准品。
3、目前，尚无有关猫杯状病毒假病毒的构建方面的报道。
技术实现思路
1、本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一种猫杯状病毒假病毒的制备方法。
2、技术方案
3、一种猫杯状病毒假病毒的制备方法，包括如下步骤：
4、(1)设计引物进行pcr扩增获得gp2基因，然后通过bp反应将其连接pdonr221载体，得到含有gp2基因序列的入门克隆载体pdown-{fcv-gp2}；
5、(2)将携带启动子的pup-ef1a载体、含有gp2基因序列的入门克隆载体pdown-{fcv-gp2}以及plv.des2d.c/egfp:t2a:puro骨架载体通过lr反应进行重组，得到重组表达载体plv[exp]-egfp:t2a:puro-ef1a>{fcv-gp2}；
6、(3)将重组表达载体plv[exp]-egfp:t2a:puro-ef1a>{fcv-gp2}和慢病毒包装质粒共转染hek293t细胞，结束后离心，收集上清并过滤，得到滤液；
7、(4)将滤液进一步离心，弃上清，得到猫杯状病毒假病毒。
8、进一步，步骤(1)中，所述pcr扩增的引物包括pd-220915-1567wtt-pf1和pd-220915-1567wtt-pr1，pd-220915-1567wtt-pf1的序列如seqidno.1所示，pd-220915-1567wtt-pr1的序列如seqidno.2所示。
9、pd-220915-1567wtt-pf1：
10、ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgtgctcaacctgcgctaacg(seqidno.1)
11、pd-220915-1567wtt-pr1：
12、ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatagtttagtcattgtgctcctaatattc(seqidno.2)
13、进一步，步骤(1)中，所述gp2基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。
14、进一步，步骤(2)中，所述pup-ef1a载体、含有gp2基因序列的入门克隆载体pdown-{fcv-gp2}和plv.des2d.c/egfp:t2a:puro骨架载体的质量比为(1-2)：(1-2)：(5-10)。
15、进一步，步骤(3)中，所述慢病毒包装质粒为pmd2.g和pspax2，转染时，pmd2.g、pspax2和plv[exp]-egfp:t2a:puro-ef1a>{fcv-gp2}的质量比为1:1:2。
16、进一步，步骤(3)中，所述转染方法采用的是阳离子脂质体法。
17、进一步，步骤(3)中，离心条件为：4℃，2000g离心30min。
18、进一步，步骤(4)中，所述离心条件为：50000g离心2h。
19、本发明的有益效果：
20、本发明先设计引物通过pcr扩增获得gp2基因，然后采用bp反应构建得到含有gp2基因序列的入门克隆载体pdown-{fcv-gp2}，接着采用lr反应将携带启动子的pup-ef1a载体、pdown-{fcv-gp2}以及plv.des2d.c/egfp:t2a:puro重组，得到重组表达载体plv[exp]-egfp:t2a:puro-ef1a>{fcv-gp2}，将其和慢病毒包装质粒共转染hek293t细胞，得到猫杯状病毒假病毒颗粒。与现有技术相比，本发明方法制备得到的猫杯状病毒假病毒无复制活性、生物安全性高、稳定性好，能够为猫杯状病毒的研究、抗病毒制剂和疫苗评价提供强有力的筛选工具,还可在猫杯状病毒核酸检测时作为阳性对照标准品，具有广泛的应用价值。
1.一种猫杯状病毒假病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述猫杯状病毒假病毒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述pcr扩增的引物包括pd-220915-1567wtt-pf1和pd-220915-1567wtt-pr1，pd-220915-1567wtt-pf1的序列如seqidno.1所示，pd-220915-1567wtt-pr1的序列如seqidno.2所示。
3.如权利要求1所述猫杯状病毒假病毒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述gp2基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。
4.如权利要求1所述猫杯状病毒假病毒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述pup-ef1a载体、含有gp2基因序列的入门克隆载体pdown-{fcv-gp2}和plv.des2d.c/egfp:t2a:puro骨架载体的质量比为(1-2)：(1-2)：(5-10)。
5.如权利要求1所述猫杯状病毒假病毒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述慢病毒包装质粒为pmd2.g和pspax2，转染时，pmd2.g、pspax2和plv[exp]-egfp:t2a:puro-ef1a>{fcv-gp2}的质量比为1:1:2。
6.如权利要求1所述猫杯状病毒假病毒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，离心条件为：4℃，2000g离心30min。
7.如权利要求1至6任一项所述猫杯状病毒假病毒的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述离心条件为：50000g离心2h。