(1.上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海201306；2.中华人民共和国大连出入境检验检疫局，辽宁大连116600)
关键词:中华草龟；恩诺沙星；急性毒性；慢性毒性；血液毒理；组织毒理
中华草龟Chinemysreevesiis为濒危物种，在中国是非常受欢迎的养殖品种，不仅可以食用、药用，而且当做宠物已有悠久历史。然而，人工养殖常导致龟类疾病频发，且多数为细菌性疾病，如肺炎[1]、眼病[2]、甲壳皮肤溃疡[3]等。目前，抗生素是治疗龟类细菌性疾病的首选药物，但抗生素容易引发药源性疾病的产生。使用抗生素对养殖龟鳖疾病的治疗用药量仍不明确，效果也不显著，制约了产业的发展，因此，针对龟鳖个体的临床医学技术研究十分迫切。
急性毒性试验用60只3月龄人工养殖中华草龟，体质量为20g左右，慢性毒性试验用16只人工养殖中华草龟，体质量为100g左右，均为雄性，同批购于江苏省苏州市某养殖场。由于龟类无明确的健康指标参考，因此，本研究中以吃食好、活力强、无明显外伤、无异常行为、无明显临床症状的视为正常个体，用作试验动物。
试验器材和试剂主要包括:全自动血液生化分析仪BS－200，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；拜有利(5%恩诺沙星注射液)，四川动物保健有限公司；血生化试剂盒，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；H.E.染色试剂。
试验前，所有中华草龟驯养2～3周，使其适应试验条件。采血前停食1d，养殖水温保持在25℃左右。
1.2.1急性毒性试验将试验用中华草龟随机分为6组，每组10只，根据预试验结果设定，对每组龟逐个从后腿基部肌肉注射不同剂量的恩诺沙星注射液，6组注射剂量分别为649.9、484.1、360.5、268.5、200.0mg/kg(体质量)，对照组注射同体积的生理盐水，每次每只龟注射容积控制在0.3mL，注射后分别在30min、1h、4h持续观察其行为变化，并在注射后14d内持续观察其中毒反应。统计14d内每组龟的死亡总数[17－19]，用Bliss法计算得出半数致死剂量(LD50)[19－20]。急性毒性试验期间，将死亡龟立刻进行解剖，同时随机取对照组3只解剖，将各内脏器官组织于福尔马林试剂中保存，制作组织毒理切片，用H.E.染色，镜检、拍照。
1.2.2慢性毒性试验将中华草龟随机分为4组，每组4只(编号为1～4号)，对照组每天注射0.25mL生理盐水，低、中、高剂量组根据临床使用量和急性毒性试验结果注射恩诺沙星剂量分别为10、30、50mg/kg(体质量)，每次每只龟注射容积控制在0.25mL。每天16:00～17:00注射，连续注射30d，后停药30d，并观察其食量、行为变化。
血生化指标检测:分别于注射后第0、2、13、28、40、50、60d的9:00～10:00时抽取每只龟0.4mL(不超过体质量的1%)血样于含肝素锂血生化管中，以4000r/min离心15min，取血浆并于4℃下保存，24h内检测其总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、总胆红素、血糖、尿素氮、尿酸、肌酐含量。
组织毒理学检查:对50mg/kg剂量组试验期间死亡的龟及时进行解剖；在试验结束时，随机选取对照组、10mg/kg组、30mg/kg组各两只龟剖检。将各内脏器官组织于福尔马林试剂中保存，制作组织毒理切片，用H.E.染色，镜检、拍照。
试验数据用SPSS19.0软件进行处理，用Duncan法进行多重比较，显著性水平设为0.05。
2.1.1注射后14d内中华草龟行为及食欲观察
649.9mg/kg剂量组:注射后15min，有半数龟出现躁动、伸长脖子呼吸、呕吐现象，30min时均四肢张开、缩头、不动；1h时已有3只龟出现四肢无力，头部下垂，呈濒死状态，2只龟出现口吐黏液现象，4只龟前后肢扭曲僵硬；24h时有7只龟死亡；48h时有9只龟死亡。
484.1mg/kg剂量组:注射后30min，龟开始躁动不安，2只龟出现呕吐；1h时有4只龟出现呼吸困难，2只龟四肢无力、头部扭曲；24h时有5只龟死亡；48h时有8只龟死亡。
360.5mg/kg剂量组:注射后1h，有3只龟出现呕吐，其中1只伸头张嘴呼吸；4h时1只龟后肢僵直，2只头部抽动；24h时1只龟四肢无力；48h时有2只龟死亡，其余均存活，但均不吃食。
268.5、200.0mg/kg剂量组:注射后1h，龟出现少量呕吐，但并无明显不良表现；5d时龟活动较弱，仅少量吃食；7d时大多数龟恢复食欲。
对照组龟每日吃食良好，较活跃。
2.1.2半致死剂量(LD50)LD50结果见表1，并建立以下方程:
回归方程Y＝－20.908＋9.8213lgD，
50%致死剂量LD50＝434.45mg/kg，
LD50(Feiller校正)95%的可信限为378.7～500.82mg/kg，
5%致死剂量LD5＝295.43mg/kg，
表1注射恩诺沙星对中华草龟急性毒性试验Tab.1AcutetoxicitytestofenrofloxacininjectiontoChinesepondturtleChinemysreevesiis
剂量(D)/(mg·kg－1)dose回归机率单位(Y)returnprobabilityunit649.92.812810990.006.28176.7178484.12.684910880.005.84155.4616360.52.556910220.004.15854.2042268.52.42891000.00—2.9474200.02.30101000.00—1.6911剂量对数(lgD)logarithmicdose动物数量/ind.number死亡数量/ind.deadnumber死亡率/%percentmortality试验机率单位(yem)probabilityunit
95%致死剂量LD95＝638.88mg/kg。
2.1.3急性毒性试验中龟组织毒理学结果临床解剖结果显示，注射高浓度(649.9mg/kg)恩诺沙星的组龟肝脏体积增大，有严重淤血，胃肠壁红肿，布满血丝(图1)。
组织毒理学检验发现:注射高浓度(649.9mg/kg)恩诺沙星的组龟肝组织的肝索结构混乱，细胞核、细胞质体积增大，并有部分细胞破裂，淤血严重，嗜酸性粒细胞浸润；胃肠壁组织有明显水肿；其他组织未见明显病变(图2)。
图1恩诺沙星急性毒性试验中华草龟解剖学结果Fig.1AnatomyofChinesepondturtleChinemysreevesiisinacutetoxicityofenrofloxacin
注:A，高剂量组(649.9mg/kg)龟肝脏大量瘀血()；B，高剂量组龟胃肠壁红肿，有血丝()；C，对照组龟的肝和胃肠Note:A，extravasatedbloodinliveroftheturtleinhighdosegroup(649.9mg/kg)()；B，bloodshot，redandswollengastrointestinalwallintheturtleinhighdosegroup(649.9mg/kg)()；C，liver，stomachandintestineoftheturtleincontrolgroup
图2恩诺沙星急性毒性试验中华草龟组织毒理学结果Fig.2HistotoxicologyofChinesepondturtleChinemysreevesiisinacutetoxicityofenrofloxacin
注:A，高剂量组(649.9mg/kg)龟肝组织的肝索结构混乱，大量瘀血，组织间隙嗜酸性粒细胞浸润()，肝细胞的细胞核、细胞质扩张、破裂()(200×，小图1000×)；B，高剂量组龟胃有明显水肿(▲)(100×)；C，高剂量组龟肠有明显水肿(▲)(100×)；D，对照组肝脏组织，轻微淤血，肝索结构完整(200×)；E，对照组龟胃(100×)；F，对照组龟肠(100×)Note:A，disorderarchitectureofhepaticcord，extravasatedbloodinliver，organizationclearanceeosinophilinfiltration()，livernucleusandcytoplasmexpansion，andrupture()intheturtleinhighdosegroup(649.9mg/kg)(200×，insert1000×)；B，stomachedemaintheturtleinhighdosegroup(649.9mg/kg)(▲)(100×)；C，intestineedemaintheturtleinhighdosegroup(▲)(100×)；D，structurallycompleteliverwithmildcongestioninthecontrolgroup(200×)；E，stomachintheturtleincontrolgroup(100×)；F，intestineintheturtleincontrolgroup(100×)
2.2.1中华草龟吃食和行为变化第1天注射恩诺沙星后30min，除对照组外，10、30、50mg/kg剂量组龟均出现呕吐现象，之后未有呕吐行为。
对照组:基本保持吃食良好，反应灵活，力气大。
10mg/kg剂量组:注射后，龟食欲均较好，10d时龟陆续吃食减少、进食缓慢，22d时少数不食，停止注射后龟逐渐恢复食欲但食量较少。注射过程中少数龟喜躲避，行动不灵活，多数龟活跃、力气大。
30mg/kg剂量组:注射后，龟食欲均较好，3d时陆续停食，停止注射后龟食欲依然未有改善。注射后10d时龟活力差，力气小，胆小，常躲藏在阴暗处，18d时4号样品龟在水中倒翻并死亡。
50mg/kg剂量组:注射后，龟食欲均较好，3d时龟停食。注射后1d时龟活力开始变差，力气小，16d时4号样品龟在水中倒翻并死亡，之后其中的两只龟陆续死亡。
血清AST活性随着注射剂量的增大呈显著升高，从第13天开始，一直保持30mg/kg组显著高于10mg/kg组且二者均显著高于对照组的情况(P＜0.05)，连续注射过程中，每组AST活性均呈先上升后下降的趋势，50mg/kg组仅剩的1只龟AST变化趋势与30mg/kg组相似。停止注射后，10mg/kg组AST活性恢复到初始水平，而30、50mg/kg组依然保持较高水平(图3)。
2.2.3临床解剖结果50、30mg/kg组中华草龟肝脏密度小，在福尔马林固定液中呈漂浮状态，而10mg/kg和对照组肝脏密度较大，在福尔马林固定液中下沉；50mg/kg组胃内充满黄色黏稠液体，而10、30mg/kg组和对照组胃内未有黏稠液体；50、30mg/kg组注射部位明显肿起，肌肉部分坏死、颜色发黑，而10mg/kg组和对照组未见肿起，肌肉颜色红润。
图3注射不同剂量恩诺沙星时中华草龟血清AST活性的变化Fig.3ChangesinserumASTactivityinChinesepondturtleChinemysreevesiisinjectedwithdifferentdosesofenrofloxacin
图4注射不同剂量恩诺沙星时中华草龟血清T－bil的变化Fig.4ChangesinserumT－billevelinChinesepondturtleChinemysreevesiisinjectedwithdifferentdosesofenrofloxacin
2.2.4组织毒理学结果
肝脏:50mg/kg组死亡的3只中华草龟肝脏均出现大小不一的空泡变性，肝细胞坏死，肝小叶和肝索结构已分辨不出；30、10mg/kg组肝脏也出现较严重的空泡变性并有淤血，细胞坏死，但肝索结构仍存在；对照组肝脏也有一定的空泡变性，但肝小叶和肝索结构完整(图5)。
肺:50mg/kg组肺脏严重缺血，并有不同程度的组织结构混乱，部分细胞破裂、坏死，而对照组肺脏结构完整，血细胞充盈(图5)。
胃肠:50mg/kg组4只龟胃的病变并不完全一致，1只出现水肿，1只则为固有膜混乱，胃壁均明显变薄；30mg/kg组胃亦有轻微水肿；而对照组胃则结构完整未有明显病变。50mg/kg组肠壁明显变薄，水肿，肠绒毛结构不完整，而对照组和10、30mg/kg组均未见有明显病变(图6)。
图5恩诺沙星慢性毒性试验中华草龟肝脏和肺组织毒理学结果Fig.5HistotoxicologyofliverandlunginChinesepondturtleChincmysreevesiisinacutetoxicitytestofenrofloxacin
注:A～C，高剂量组(50mg/kg)龟肝脏组织，细胞坏死界限不清、大小空泡()，中央静脉界限不清、缺血(▲)(200×)；D～F，高剂量组(50mg/kg)龟肺组织细胞坏死、结构混乱(▲)(200×)；G，对照组龟肝组织(200×)；H，对照组龟肺组织(200×)Note:A－C，liverofChinesepondturtleinhighdosegroup(50mg/kg)，showingcellnecrosiswithunclearboundaryanddegenerationofvacuoles()，unclearandischemiaincentralvenousline(▲)(200×)；D－F，lungofChinesepondturtleinhighdosegroup(50mg/kg)，showingcellnecrosisanddisorderofstructure(▲)(200×)；G，liveroftheturtle(200×)incontrolgroup；H，lungoftheturtle(200×)incontrolgroup
图6恩诺沙星慢性毒性试验中华草龟胃肠、肾脏和肌肉组织毒理学结果Fig.6Histotoxicologyofstomach，intestines，kidneyandmuscleofChinsespondturtleChincmysreevesiisinacutetoxicityofenrofloxacin
注射部位肌肉组织:50mg/kg组注射部位严重水肿、变性，30mg/kg组有大量红细胞和嗜酸性粒细胞浸润，而对照组肌纤维清晰，结构正常(图6)。
肾脏:50mg/kg组肾小球结构基本完整，部分肾小管出现颗粒变性、浑浊，细胞界限不清，主要结构完整，30、10mg/kg组与50mg/kg组结果基本一致，对照组肾小管颗粒变性比50mg/kg组更加严重，主要结构完整(图6)。
目前，中国养殖龟鳖群体给药方法主要与鱼类相似，一般为浸泡、泼洒或拌饲，但这些方式在龟鳖治疗中有较大的局限性。浸泡和泼洒用药多，且药量不明确，基本只能起到预防作用，拌饲也只能针对病情较轻、吃食较好的个体，而多数龟类患病时食欲下降甚至停食而无法得到治疗。个体给药方式为强制口服和肌肉注射，注射治疗既能有效控制药量也便于操作。因此，本试验中选择注射方式给药，也为龟鳖临床治疗提供了可行性方法。
急性和慢性毒性试验结果均显示，恩诺沙星对中华草龟有较强肝毒性，这和中华鳖药源性肝病结果一致[12]，且对胃肠道有一定刺激，但存在一定的差异。急性毒性试验肝脏组织有较严重淤血、炎性细胞浸润、细胞破裂坏死、无空泡变性，慢性毒性试验肝脏组织则缺血、有严重的空泡变性；急性毒性试验胃肠组织水肿但肠绒毛完整，而慢性毒性试验除水肿外还出现肠壁变薄、肠绒毛结构不完整现象。
龟类疾病的治疗具有疗程长的特点，长期用药较容易造成慢性中毒，甚至药源性疾病，根据本试验结果，对人工养殖中华草龟长期注射10mg/kg便可能造成一定程度的肝损伤，再结合已有的肌注恩诺沙星对几种龟的药代动力学研究[6－7]，推断恩诺沙星在临床中的注射剂量应为5～10mg/kg，可供人工养殖水龟、半水龟类治疗参考。
本试验中还发现，注射前人工养殖中华草龟血清AST、T－bil与野生陆龟[25－26]、黄喉拟水龟[27]、海龟[28－29]相比处于较高水平，且对照组肝脏组织也有病变，这可能与人工养殖水龟的长期温室养殖环境和饲料种类有关[30]，也可能是养殖龟鳖的普遍性问题。因此，在用恩诺沙星治疗人工养殖水龟疾病前应对其进行肝功能检查，若发现已有肝损伤，则应适当减少用量或选用替代药物。此外，大量注射会导致其肌肉损伤，因此，使用恩诺沙星肌肉注射时应尽量避免长期在同一位置注射。
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AcuteandchronictoxicologicaleffectsofcontinuousintramuscularinjectionofenrofloxacinonChinesepondturtle
ZHANGYu－si1，PANLian－de1，HONGBin2(1.KeyLaboratoryofExplorationandUtilizationofAquaticGeneticResources，MinistryofEducation，ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China；2.DalianEntry－ExitInspectionandQuarantineBureau，Dalian116600，China)
Keywords:Chincmysreevesii；enrofloxacin；acutetoxicity；chronictoxicity；hematotoxicology；tissuetoxicology
中图分类号:Q954.4
文献标志码:A
DOI:10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.06.002
收稿日期:2017－03－28
基金项目:水产动物遗传育种上海市协同创新中心(ZF1206)
作者简介:章宇思(1990—)，女，硕士研究生。E－mail:1181517073＠qq.com
通信作者:潘连德(1960—)，男，教授。E－mail:ldpan＠shou.edu.cn