一种泛包膜病毒抑制剂候选广谱包膜病毒药候选
α-抗肌营养不良糖蛋白的N端是一种针对SARS-CoV-2和包膜病毒的广谱抗病毒剂
Theα-dystroglycanN-terminusisabroad-spectrumantiviralagentagainstSARS-CoV-2andenvelopedviruses
doi.org/10.1101/2023.11.06.565781;
MariaGiuliaBigotti*1,2,KatjaKlein*3,EstherS.Gan4,MariaAnastasina5,6,SimonAndersson5,
OlliVapalahti7,8,PekkaKatajisto5,6,9,10,MaximilianErdmann3,AndrewD.Davidson3,SarahJ.
Butcher5,6,IanCollinson2,EngEongOoi4,11,12,GiuseppeBalistreri5,6,7,AndreaBrancaccio*2,13,
YoheiYamauchi*3,14,15
摘要：
COVID-19大流行凸显了开发有效的治疗手段以应对可能对人类健康构成重大威胁的未来病毒疫情的重要性。作为天然化合物的抗病毒候选药物，我们聚焦于α-抗肌营养不良糖蛋白（α-DGN），这是一种高度糖基化的基底膜蛋白，能够将细胞外基质与胞内细胞骨架相连。本研究显示，在大肠杆菌中产生的不含任何翻译后修饰的α-DGN的N端片段能够阻断SARS-CoV-2在细胞培养、人原代肠道类器官以及表达人血管紧张素I转化酶2（hACE2）的人源化转基因小鼠肺部的感染。预防性和治疗性使用α-DGN均能降低SARS-CoV-2在小鼠肺中的滴度，并保护小鼠免受呼吸系统症状和死亡的影响。重组α-DGN还能体外阻止一系列包膜病毒的感染，包括四种登革病毒血清型、甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、蜱传脑炎病毒，但不能阻止非包膜的人腺病毒的感染。本研究表明，可溶性的重组α-DGN是一种广谱的、天然化合物候选治疗药物，可用于对抗包膜病毒。
（这个候选生物制药是一个蛋白的N端而不是完全的蛋白）
关键词：
细胞外基质、α-抗肌营养不良糖蛋白、SARS-CoV-2、冠状病毒、包膜病毒、广谱抗病毒。
我们使用大肠杆菌生产来自小鼠（mα-DGN，残基50-313）和人类（hα-DGN，残基52-315）的重组α-DGN（图1B），这些蛋白被克隆进pHis-Trx表达载体14中，要么保持原始形式，要么按照材料与方法中描述的方式进行修改。为了稳定蛋白结构，我们将位于连接免疫球蛋白样结构域和S6样结构域的环区的一个精氨酸残基（mα-DGN中的R166和hα-DGN中的R168）替换成了组氨酸（图1A，右；图S1A）。两种α-DGN蛋白在序列上有92.7%的一致性（图1B），在电泳中表现为同质纯化的条带，表观分子量约为30kDa（图1C）。通过电喷雾离子化液相色谱质谱进一步确认了蛋白样品的同质性（图S1B）。根据尿素介导变性下的内在色氨酸荧光测定，蛋白表现出了良好的稳定性（图1D）。
图1A
左侧：
右侧：
α-DGN的三维结构的卡通表示(PDB:1U2C)。图中显示了两个域(N-末端Ig样结构域，用青色表示；C-末端S6样结构域，用紫红色表示，并且完全包含在一个圆圈中)以及连接这两个域的灵活未定义环(FUL)的位置。
图S1B
图1C和D
我们测试了小鼠α-DGN(mα-DGN)和人α-DGN(hα-DGN)对囊泡性口炎病毒(VSV)假型化感染Caco-2细胞的抗病毒活性，这些VSV被伪型化为人冠状病毒（CoVs）的刺突（S）蛋白，包括SARS-CoV-2、SARS-CoV、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和人冠状病毒229E(HCoV-229E)。mα-DGN和hα-DGN对所有测试的假病毒均显示出强大的抗病毒活性。SARS-CoV-2-S、SARS-CoV-S、MERS-CoV-S和HCoV-229E-S的IC50值分别为1.99μM、4.58μM、2.74μM和1.85μM（mα-DGN），以及2.18μM、3.86μM、3.69μM和2.76μM（hα-DGN）（图1E-H和I）。从大肠杆菌中重组表达的ECM蛋白聚集素用作非特异性蛋白对照。这些结果表明α-DGN对带有不同冠状病毒刺突的VSV假病毒具有广泛的抗病毒活性。
Dose-responsecurves（剂量反应曲线）:这些曲线展示了针对不同冠状病毒（SARS-CoV-2,SARS-CoV,MERS-CoV,和HCoV-229E）的刺突蛋白（Spikeprotein），使用mα-DGN、hα-DGN或mS6预处理过的Caco-2细胞的感染抑制效果。
mα-DGN,hα-DGN,mS6:这些可能是不同的抗体或化合物，它们被用来预处理Caco-2细胞，以研究它们对病毒感染的影响。
VSVpseudotypedparticles:用冠状病毒的刺突蛋白包膜的水泡性口炎病毒（VSV）假型颗粒。这种技术用于研究病毒进入细胞的能力而不引起完整的病毒复制周期。
Infectionquantification:感染程度通过检测绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞来量化。GFP通常与病毒基因组一起被包装到假型颗粒中，因此可以作为感染指标。
%inhibitionnormalizedtoanunrelatedproteincontrol:感染抑制百分比相对于一个无关蛋白的对照组进行标准化。这通常是为了消除背景信号并确保数据的可比性。
IC50values:半数抑制浓度（IC50）是导致50%最大效应（在这个案例中为感染抑制）所需的药物浓度。这些值通过非线性回归计算得出，并基于三次独立实验的数据。
Immunofluorescenceimages:免疫荧光图像显示了经过mα-DGN、hα-DGN、mS6或溶剂对照处理后的感染细胞。GFP阳性的感染细胞呈绿色，而细胞核则用Hoechst染色呈蓝色。
Scalebar:图像中的比例尺为200微米。
基于我们之前生产mα-DGN缩短版本的经验[8]，我们将mα-DGN分解为其两个主要结构域，即免疫球蛋白样（Ig-like）结构域和S6样结构域，以分析它们可能的抑制活性。我们将这些结构域分别克隆到pHisTrx(TEV)表达载体中，并按照全长蛋白的生产方式制备。由于稳定性较低，免疫球蛋白样结构域无法高效纯化。然而，纯化的S6样结构域（以下简称mS6）在溶液中作为约15kDa的蛋白稳定存在，并进一步测试了其抗病毒活性。mS6以IC50值分别为1.64μM、2.54μM、1.15μM和1.49μM抑制了带有SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV和HCoV-229E刺突蛋白的VSV的感染（图1E-H）。这表明mS6以与全长mα-DGN相当的效力阻止了带有冠状病毒刺突的VSV假病毒的感染。
α-DGN阻止不同SARS-CoV-2变异株在敏感细胞系中的感染
图S2A
(A)mα-DGN对SARS-CoV-2感染HEK293T细胞的剂量依赖性抑制活性。图中显示的是mα-DGN（1μM至10μM）对表达人ACE2和TMPRSS2的HEK293T细胞中SARS-CoV-2感染的百分比抑制，该数据相对于缓冲液处理的对照组进行标准化（平均值+标准差，n=3）
图2A和2B
(A)α-DGN抑制不同SARS-CoV-2变异株对细胞的感染。VeroE6-TMPRSS2细胞在感染SARS-CoV-2原始株、Gamma株、Delta株、OmicronBA.1株或OmicronBA.2株（MOI=0.1）之前，先用10μM的鼠源α-DGN预处理。使用病毒核衣壳蛋白(N蛋白)染色来量化感染情况（n=3次独立实验）。条形图代表平均值+标准误(SEM)。比例尺，200μm。p值通过单因素方差分析(One-wayANOVA)与多重比较相对于对照组确定。p***<0.001,p**<0.01。
(B)代表性免疫染色图像：显示了未经处理的对照组或用鼠源α-DGN处理过的VeroE6-TMPRSS2细胞，这些细胞被不同SARS-CoV-2变异株感染（病毒核衣壳蛋白[N蛋白]呈绿色，细胞核用Hoechst染色呈蓝色）。
α-DGN在病毒感染早期阶段发挥作用
当hACE2表达的HeLa细胞预先与mα-DGN孵育后再加入病毒时，与缓冲液对照组相比，SARS-CoV-2的结合被减少了50%（图2C和D）。用4μMAlexaFluor-648标记的mα-DGN在低温下与AAT或Caco-2-ACE2细胞孵育30分钟后，观察到α-DGN与细胞表面结合（图S3A和B）。无论是在AAT还是Caco-2-ACE2细胞中都观察到了α-DGN的结合，这表明α-DGN与细胞的结合不是细胞类型特异性的。
图S2(C)SARS-CoV-2复制子RNA转染的VTN细胞经10μMmα-DGN、溶剂对照或1μM瑞德西韦处理18小时后的相对发光单位(RLU)表达水平。
图S2(D)VTN细胞转染SARS-CoV-2复制子RNA并在10μMmα-DGN、溶剂对照或1μM瑞德西韦处理18小时后固定并进行双链RNA(dsRNA)染色。图中显示的是mα-DGN或瑞德西韦处理后dsRNA阳性细胞的百分比，相对于溶剂对照处理的细胞进行标准化。
类器官是利用特定组织类型的干细胞或成人细胞在体外组装而成的微型三维器官。在COVID-19患者中，SARS-CoV-2感染消化道，并在小肠、结肠和回肠中被检测到[18]。因此，人原代肠道类器官被用作SARS-CoV-2研究的模型系统，因为它们比二维细胞培养模型更好地模拟了人类组织和器官在生理和病理条件下的复杂性[18]。为了分析mα-DGN在这些类器官中的抗病毒活性，我们首先将人捐赠者的十二指肠组织样本在体外培养成三维多嵴类器官。机械破坏以暴露细胞的顶端表面后，肠道类器官被用于抑制研究。用10μMmα-DGN预处理SARS-CoV-2毒株芬兰/1/2020后，感染的类器官数量减少了74.9%（从缓冲液对照组的20.7%降至mα-DGN处理的类器官中的5.2%）（图2E和F）。这表明mα-DGN在类器官模型中有效地抑制了SARS-CoV-2的感染。
(E)mα-DGN阻止SARS-CoV-2对人原代肠道类器官的感染。类器官用1或10μMmα-DGN或缓冲液对照处理，并在MOI为1的情况下感染SARS-CoV-248小时后进行固定。图中显示的是被感染（双链RNA阳性）的类器官百分比，相对于缓冲液处理的对照组进行标准化（平均值+标准差，n=4）。
(F)代表性免疫染色图像：显示了用不同浓度的mα-DGN或溶剂对照（PBS）处理的人肠道类器官，并感染SARS-CoV-2（双链RNA呈紫红色，细胞核用Hoechst染色呈青色）。图像代表每个图像堆栈（共180个光学切片）中类器官中段的5个光学切片的最大Z投影。比例尺，30μm。DGN在人源化ACE2小鼠中抑制SARS-CoV-2
mα-DGN对伪型冠状病毒和SARS-CoV-2变异株感染性的抑制效果促使我们进一步探究其对其他人类病毒的广谱抗病毒潜力。具体而言，我们进一步测试了mα-DGN对其他包膜病毒的抗病毒活性：甲型流感病毒（IAV）X-31（H3N2）、呼吸道合胞病毒（RSV）、桑塔纳森林病毒（SFV）、蜱传脑炎病毒Kuutsalo-14株（TBEV）、囊泡性口炎病毒（VSV）和登革病毒（DENV），以及非包膜的人腺病毒5型（hAdV5）。
感染实验采用多重格式进行，并使用自动共聚焦荧光显微镜和图像分析来确定感染细胞的比例。通过使用针对IAV病毒核蛋白、TBEV膜蛋白[20]或通过反向遗传工程插入每个病毒基因组中的绿色或红色荧光报告基因（具体来说：SFV[21]、RSV[22]和VSV[23]中的GFP，以及hAd5中的RFP，后者由赫尔辛基大学的VincenzoCerullo博士慷慨提供）的特异性抗体的免疫染色来识别感染细胞。mα-DGN（10μM）减少了所有包膜病毒的感染，例如IAV减少了80%，RSV减少了91%，SFV减少了57%，TBEV减少了90%，VSV减少了99%（图4A-E）。mα-DGN通过qRT-PCR检测降低了登革病毒1、2、3和4型的复制，分别减少了57%、58%、50%和42.5%（图4G-J）。mα-DGN还阻止了登革病毒4型在人原代单核细胞中的感染达91.3%（图S4）。mα-DGN对非包膜病毒hAdV5没有抑制作用（图4F）。我们的观察表明α-DGN是一种广谱抑制剂，针对包膜病毒。
图4
讨论
关于抗肌营养不良糖蛋白复合体参与病毒感染的第一个证据来自于α-DG被鉴定为LhssaFeverP4病毒病毒（LFV）和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）等沙粒病毒的细胞受体[4]。α-DG与沙粒病毒的相互作用仅限于旧世界和C群新世界沙粒病毒，并依赖于α-DG所谓的粘液样区域上的糖基化壳[24]。粘液样区域由连接α-DGC端和N端球形结构域的氨基酸组成（图1A，左）。它高度装饰着长线性链的重复碳水化合物单元，这些单元总称为matriglycan，最近已经详细描述了LASV对其的识别[5]，并且证明这是病毒进入的关键。在我们的研究中，我们使用了在大肠杆菌中生产的重组非糖基化的α-DGN端球形结构域（α-DGN）。因此，抗病毒机制独立于其糖基化。
COVID-19大流行促使我们探索α-DGN作为SARS-CoV-2抑制剂的潜力。deGreef等人先前证明了缺乏编码α-DG和β-DG的Dag1基因的转基因小鼠比对照小鼠更容易受到甲型流感病毒PR8（H1N1）的肺部感染[13]。重组α-DGN抑制了鸡红细胞上的IAV血凝素介导的血凝现象[13]，可能是通过阻止IAV与红细胞表面的结合，类似于对SARS-CoV-2进入的抑制（图2D）。腺病毒过度表达α-DGN或给予重组α-DGN降低了小鼠肺部IAVPR8的滴度[13]。
(i)易于生产。重组α-DGN的生产成本低廉，无论是小鼠还是人类形式在室温下溶液中都是稳定的，并且可以轻松扩大规模进行大规模生产。
(ii)发现15kDa活性域S6。与mα-DGN相比，mS6较小的尺寸对于转化研究可能是一个优势。
(iii)弱免疫原性潜力。α-DGN是由宿主细胞作为多肽产生的。这一特性加上物种间高度保守的氨基酸序列以及不存在翻译后修饰，使得α-DGN作为治疗剂时不太可能引发免疫反应[27]。我们在大肠杆菌中生产的重组mα-DGN和hα-DGN没有潜在的免疫原性翻译后修饰，当给予人细胞系、人肠道类器官或小鼠时没有引起任何不良反应。
(iv)α-DGN具有与其它抗病毒化合物相当或更优的IC50值。mα-DGN、hα-DGN和mS6显示出强大的广谱抗病毒活性。对于所有测试的病毒，IC50值都在低微摩尔范围内。这些值高于病毒刺突中和单克隆抗体（nmAbs）的IC50值，后者通常在低纳摩尔范围内。然而，基于mAb的治疗方法导致缺乏广谱活性，这一点通过相同mAb对抗新兴SARS-CoV-2变异株的改变效能得以证明[28]。α-DGN的抗病毒功效与目前用于对抗SARS-CoV-2感染的小分子抗病毒化合物相似，如瑞德西韦、莫努匹拉韦或尼马特雷韦，它们的IC50值也处于低微摩尔范围[29]。另一种具有广谱抗病毒效应的自然化合物——吡啶酸，在细胞培养中对IAVPR8的IC50值为0.5mM[30]，大约比α-DGN对冠状病毒的IC50值高200倍。
(v)在低剂量时观察到体内抗病毒功效。我们使用K18-hACE2小鼠的体内研究表明，在一个致死挑战模型中，SARS-CoV-2肺部病毒载量显著降低。这些小鼠中α-DGN的日剂量为0.3mg/kg（单一剂量治疗和每日一次预防治疗），这比其他研究中通过鼻内途径使用的莫努匹拉韦（200mg/kg，每日两次）和尼马特雷韦（300mg/kg，每日两次）低1333-2000倍[31]。
结论
我们已经将α-DGN，一种天然存在的蛋白质，表征为一种强大的广谱抗病毒化合物，它能阻止SARS-CoV-2在人细胞系、人肠道类器官模型和小鼠感染模型中的感染。α-DGN的抗病毒活性广泛存在于临床上重要的包膜病毒中，这些病毒可导致致命的人类感染，如甲型流感病毒（IAV）、呼吸道合胞病毒（RSV）和登革病毒（DENV）。我们得出结论，α-DGN及其活性域S6样结构域是一种有前景的先导化合物，未来可用于研究和开发成为泛包膜病毒抗病毒药物。