由于新型冠状病毒肺炎的大流行，我国的集中检测能力有所提高，未来TB的快速分子筛查可能受益于这些进步。
基金项目：杭州市医药卫生科技一般项目(A20210265)；杭州市医药卫生科技计划重大项目(Z20220032)
作者：彭利君，方婷婷，蔡龙
作者单位：浙江大学医学院附属杭州市胸科医院临床医学检验实验中心，杭州310003
通信作者：蔡龙，
doi:10.19982/j.issn.1000-6621.20220228.
开放科学(资源服务)标识码(OSID)的开放科学计划以二维码为入口,提供丰富的线上扩展功能,包括作者对论文背景的语音介绍、该研究的附加说明、与读者的交互问答、拓展学术圈等。读者“扫一扫”此二维码即可获得上述增值服务。
摘要
为实现“2035终止结核”的目标，开发新的检测方法迫在眉睫。结核分枝杆菌cfDNA（MycobacteriumtuberculosiscfDNA，MTB-cfDNA）可表明病原体的存在，是结核病（tuberculosis，TB）诊断和治疗监测有吸引力的生物标志物。易于获取的尿液和（或）血液中的MTB-cfDNA可实现对任何年龄组的肺结核和肺外结核的检测。在胸腔积液、腹腔积液和脑脊液等体液样本中检测MTB-cfDNA对TB的诊断性能高于GeneXpertMTB/RIF等基因组DNA检测。但cfDNA作为TB生物标志物的研究仍处于起步阶段，未来需要更大型、纳入患者类型更全面的临床研究来评估其在TB诊断中的效用。随着检测方法的进一步优化，cfDNA检测有可能改善TB诊断并成为“游戏规则的改变者”。
关键词：分枝杆菌，结核；基因，细菌；诊断；综述文献（主题）
正文
2022PUBLISH
当前，结核病（tuberculosis，TB）仍然是严重危害人类健康的重大传染病，特别是新型冠状病毒肺炎的全球大流行给全球TB的防控带来了新的挑战。据估计约有40%的TB患者由于诊断率过低而未能及时确诊和报告。因此，TB的快速诊断对于患者早诊断、早治疗、临床预后和传播极为重要。结核分枝杆菌循环游离DNA（MycobacteriumtuberculosiscirculatingfreeDNA，MTB-cfDNA）可表明病原体的存在，是TB诊断和治疗监测有吸引力的生物标志物。本文将对血液、尿液及胸、腹腔积液和脑脊液标本的检测现状进行综述，综合评价MTB-cfDNA对TB的诊断效果，并对基于cfDNA的TB检测开发的主要挑战进行总结。
一、常用TB检测方法和新的cfDNA检测
分枝杆菌培养是TB诊断的金标准，但检测周期较长；痰涂片显微镜检查和血清结核抗体便宜、简单、快速，且后者生物风险低，但两者敏感性均较低；γ-干扰素释放试验的敏感度和特异度良好，但结果易受宿主年龄、疾病和免疫状态的影响，也不能确定是否为活动性TB。而尚处于研究阶段的血清蛋白检测因与其他慢性肺部疾病有重叠，缺乏诊断特异性，通常需要检测一组蛋白才能进行结核病诊断。近年来，已经开发了较多针对MTB基因组DNA的快速分子检测方法，例如实时定量PCR，以及世界卫生组织认可的环介导等温扩增技术、GeneXpertMTB/RIF和XpertUltra等。然而，这些方法通常检测痰液等呼吸道标本，对难以提供痰液的肺结核（pulmonarytuberculosis，PTB）患者（如儿童、长期卧床等咳痰困难患者）和通常需要侵入性活检的非呼吸道标本的肺外结核（extrapulmonarytuberculosis，EPTB）患者的适用性有限，而现有的诊断方法并未针对这些样本进行优化。
cfDNA也被称为细胞游离DNA（cell-freeDNA）或无细胞DNA，于1948年首次在人类血液中被发现。cfDNA是存在于人体血液和其他体液的无细胞部分的核酸片段，即将死亡的人类细胞和微生物分解时将cfDNA释放入血液，随着血液循环进入体液的各个组分，可通过PCR或测序进行分析。cfDNA的特征和数量可在不同的生理和疾病条件下发生改变，这可能是由于宿主细胞在恶性肿瘤、生理状态（如妊娠）和存在传染源（如病毒、细菌或寄生虫）等情况下的过度损伤或更替导致。cfDNA在癌症检测、器官移植监测、产前基因筛查等方面的应用已较为成熟，如早在1999年就有使用cfDNA检测EB病毒筛查鼻咽癌的报道，在诊断侵袭性真菌、寄生虫和HIV等感染方面也有报道。对于TB诊断，cfDNA是一种很有潜力的生物标志物，在胸腔积液、腹腔积液和脑脊液等体液样本中检测MTB-cfDNA显示出比GeneXpertMTB/RIF等基因组DNA更高的TB诊断准确度，而血液和尿液中检测MTB-cfDNA适用于任何年龄组患者，尤其是无痰的PTB患者和EPTB患者。
二、血液标本的MTB-cfDNA检测
三、尿液标本的MTB-cfDNA检测
70%以上的血浆cfDNA小于300bp，峰值长度为160~167bp，这将允许其穿过肾小球屏障进入尿液中，且尿液中的MTB-cfDNA平均片段长度（19~52bp）明显短于人基因组cfDNA（42~92bp）。尿液MTB-cfDNA诊断TB的敏感度和特异度分别为43%~83.7%和89%~100%的范围内，且检测的敏感度随着扩增产物长度的减少而增加。但不同的提取方法在捕获尿液中短、微量cfDNA的能力上存在较大差异，其中Oreskovic和Lutz、Oreskovic等开发的一种超灵敏探针杂交方法表现优异。该方法使用固定在磁珠上的序列特异性寡核苷酸捕获探针来提取10ml尿液样本中的MTB-cfDNA，有效捕获和扩增短至25bp的片段，检测限可达0.5copies/ml，敏感度和特异度分别达到了83.7%和100%。
四、胸、腹腔积液和脑脊液标本的MTB-cfDNA检测
胸、腹腔积液和脑脊液cfDNA诊断TB的敏感度为53%~100%，特异度为96%~100%，其敏感度高于培养和GeneXpertMTB/RIF约2~4倍，可能由以下两个原因造成：首先，胸、腹腔积液和脑脊液处于相对封闭的环境，大部分MTB被体内免疫细胞吞噬后，经溶酶体降解释放出大量的cfDNA，由于胸膜和腹膜都有半透膜特性，cfDNA不易透过，使得cfDNA浓度较高；而GeneXpertMTB/RIF检测的是沉淀中完整菌体的基因组DNA，相对MTB-cfDNA而言浓度更低，这可能是其敏感度低于MTB-cfDNA检测的主要原因。其次，GeneXpertMTB/RIF检测的是RNA聚合酶rpoB基因的81bp耐药决定区的单拷贝基因，而MTB-cfDNA检测的是MTB特异性多拷贝重复插入序列IS6110。Haldar等研究表明，结核性脑膜炎患者脑脊液的沉淀物检测MTB的敏感度较滤液低2~3倍，提示滤液较沉淀物是更好的诊断疑似结核性脑膜炎的分子检测样本。
五、综合评价MTB-cfDNA对TB的诊断效能
考虑到是世界卫生组织发布的目标产品的特性，推荐非痰标本生物标志物检测的最低可接受敏感度和特异度分别为65%和98%、最佳敏感度和特异度分别为80%和98%，依据目前研究的性能结果，MTB-cfDNA未来极有可能成为TB检测主要的生物标志物。表1总结了国内外MTB-cfDNA诊断TB研究的性能评估，数据显示不同样本类型的MTB-cfDNA诊断敏感度不同，用途也可能不同。对于获得呼吸道样本有困难的人群，检测其尿液和血液的MTB-cfDNA会更有优势，预测未来尿液样本的cfDNA检测有可能用于常规TB筛查，而血液cfDNA检测有可能在LTBI筛查方面有所突破；另外，相比于GeneXpertMTB/RIF等基因组DNA诊断TB，检测胸、腹腔积液和脑脊液的cfDNA看起来是更好的选择。
六、开发基于cfDNA诊断TB检测方法的主要挑战
cfDNA广泛用于临床需要进一步提高其敏感度，面临的挑战主要包括以下几个方面：
样本离心取上清或用0.22μm滤膜过滤的前处理步骤可以避免提取到沉淀中的基因组DNA稀释cfDNA。目前市售的提取试剂盒对MTB-cfDNA的提取都是非特异性的，参考Oreskovic和Lutz、Oreskovic等开发的特异捕获病原cfDNA的核酸富集方式，为提高以cfDNA为靶标诊断其他疾病的敏感度提供了新的思路。Murugesan等对影响血液和尿液中病原体cfDNA分析前的变量的研究表明，对于血液标本最好使用K2EDTA抗凝的采血管，而尿液标本最好使用Tris-EDTA作为防腐剂。使用防腐剂后血液和尿液标本可以在室温下延迟处理24h。在-80℃保存24周后，新鲜和解冻血浆与尿液间没有观察到显著差异，且使用更大的样本量能获得更多cfDNA。EIMessaoudi等建议血液样本进行两次离心，而Murugesand等发现两次离心（第一次500×g、第二次16000×g）会使血液样本的cfDNA浓度下降，这可能是由于第二次离心力过大导致白细胞基因组DNA释放，降低cfDNA的比例，造成cfDNA被稀释。这些发现表明，使用防腐剂后延迟24h处理大容量单次离心的K2EDTA血浆和Tris-EDTA尿液可能会优化cfDNA检测。此外，也需要MTB-cfDNA标准品作为质量控制，以验证cfDNA不同的检测方法，最终实现以检测体液MTB-cfDNA浓度来进行临床诊断和治疗监测。
2.需要大规模的临床验证：从患者数量来看，既往研究的患者数量不多，需要更大规模的队列研究进行临床验证来评估MTB-cfDNA在TB中的应用价值。从研究人群来看，在特定人群中的研究，特别是基于MTB-cfDNA的HIV感染者诊断的研究数量有限，针对儿科患者的研究更是极少。对于这些难以留取痰液的人群，更适合检测体液中MTB-cfDNA进行诊断，因此更需要进行大规模的临床验证。
七、展望
由于新型冠状病毒肺炎的大流行，我国的集中检测能力有所提高，未来TB的快速分子筛查可能受益于这些进步。cfDNA可以识别身体任何部位的结核感染，并有可能检测出目前传统微生物学方法无法识别的疾病状态（如LTBI）。除了检测MTB外，分析cfDNA还可以使我们更深入地了解其遗传特征，如耐药基因等，以指导临床用药。但值得注意的是，病原体cfDNA不如基因组DNA稳定，尤其在患者治疗后，其体内病原体cfDNA会很快被免疫细胞清除，若仍可检测到MTB-cfDNA，则很可能是新释放到体液循环中的MTB，故认为检测MTB-cfDNA可用于反映当前的疾病状况，对治疗有监测作用。
总之，cfDNA作为TB诊断生物标志物的研究仍处于起步阶段，未来需要更大型、纳入患者类型更全面的临床研究来评估其效用。随着检测cfDNA方法的进一步优化，其敏感度和特异度将进一步提高，有助于改善TB诊断，并很可能使其成为“游戏规则的改变者”。
参考文献略
编辑：孟莉
审校：范永德
发布日期：2022-10-18
不感兴趣
看过了
取消
人点赞
人收藏
打赏
我有话说
0/500
同步到新浪微博
进群即领
扫码加入
扫码进群
您的申请提交成功
意见反馈
下载APP
健康界APP
了解更多
返回顶部
您已认证成功，可享专属会员优惠，买1年送3个月！开通会员，资料、课程、直播、报告等海量内容免费看！