分类号C12N15/86;C12N7/04;C07K14/14;C12N15/62;A61K38/17;
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法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2012-08-29
专利权的终止
2007-12-12
2003-03-12
公开
发明背景
人呼吸道合胞病毒(HRSV)是世界范围内严重儿科呼吸道疾病的首要病毒(Collins等，FieldsVirology2：1313-1352，1996)。作为1岁以下婴儿中肺炎和支气管炎的发病原因，RSV位列所有其他微生物病原体之前。事实上到2岁时所有儿童均受过感染，而且在年龄较大的儿童和青年中再感染频率也很高(Chanock等，inViralInfectionsof人s，3rded.，A.S.Evans，ed.，PlenumPress，N.Y.，1989)。在因呼吸道疾病住入儿童医院的患者中，1/5以上由RSV引起的，仅在美国每年导致近100,000人住院和4,500例死亡。(Heilman，J.InfectDis161：402-6，1990)。另外，有证据表明在生命早期的严重呼吸道感染可能引起或加剧哮喘(Sigurs等，Pediatrics95：500-5，1995)。
尽管通常认为人RSV是在儿童人群中，但也认识到它是老年人中的一种严重疾病(Falsey等，J.Infect.Dis.172：389-394，1995)。在特定的免疫受损个体例如骨髓移植受体中，人RSV还会引起威胁生命的疾病(Fouillard，etal.，BoneMarrowTransplant9：97-100，1992)。
为了治疗人RSV，使用了一种化疗药物三氮唑核苷。但是其效力和应用受到质疑。还有被许可的用于RSV干扰的产品，它们是由集池的供体IgG(Groothuis等，NEnglJMed329：1524-30，1993)或者是人源化RSV特异性单克隆抗体组成。这些产品作为被动的免疫预防剂施用给高危个体。尽管这些产品是有用的，但其高成本和其他因素，例如缺乏长期效果使这些产品不适宜广泛使用。其他缺点包括可能转移血液携带的病毒，而且制备和贮存困难，费用高。此外，控制传染病，特别是病毒性疾病的历史表明疫苗是最重要的。
尽管数十年来致力于开发抗RSV的有效疫苗，但尚未得到可预防与RSV感染有关的严重发病率和显著死亡率的安全有效的疫苗。不能成功地开发疫苗部分原因是由于婴儿已降低了对RSV抗原的血清和分泌性抗体反应。因此，这些个体遭受更严重的RSV感染，而累积性免疫似乎可保护年龄较大的儿童和成人抵御这种病毒更严重的冲击。
开发活RSV疫苗的一个障碍是在减毒和免疫原性之间很难达到适宜的平衡，这部分是由于一些减毒病毒的遗传不稳定性，细胞培养中的RSV相对很难生长，以及病毒颗粒的不稳定性。；另外，由天然感染诱导的免疫对以后的感染没有完全的保护作用。这可能由许多因素造成，包括免疫系统在呼吸道腔表面上限制病毒感染的免疫系统相对无效、局部粘膜免疫的短期性质、快速和广泛的病毒复制、在青年人中由于免疫不成熟性而产生的免疫反应降低、由经胎盘衍生的母体血清抗体的免疫抑制，以及所述病毒的特定性质例如G蛋白的高度糖基化。另外，下文还将描述人RSV作为A和B两种抗原亚型存在，抗一个亚型的免疫会降低抗另一亚型的效果。
尽管在一生中RSV可再感染多次，但由于以前感染诱导的保护性免疫使得再感染的严重性通常会降低，因此，免疫预防是可行的。经鼻内施用活减毒RSV疫苗以启动中等程度的免疫感染。这与胃肠外途径相比既简单又安全。还提供了直接刺激局部呼吸道免疫，其在针对RSV的抗性中起主要作用。这样还消除了RSV-特异性母体衍生的血清抗体(常见于很小的婴儿体内)的免疫抑制作用。另外，尽管胃肠外施用RSV抗原有时能产生免疫病理学并发症(Murphy等，疫苗8(5)：497-502，1990)，这在用活病毒时从未观察到。
在60年代中期检测了福尔马林灭活的病毒疫苗对RSV的作用，但所述病毒疫苗不能抵御RSV感染或疾病，而且实际上随后的病毒感染还加剧了症状。(Kim等，Am.J.Epidemiol.，89：422-434，1969；Chin等，AmJ.Epidemiol.，89：449-463，1969；Kapikian等，Am.J.Epidemiol.，89：405-421，1969)。
最近RSV疫苗的开发集中在减毒RSV突变株。Friedewald等(J.Amer.Med.Assoc.204：690-694，1968)报道了冷传代的RSV突变株(cpRSV)，该突变株似乎是足够减毒的，可以作为候选疫苗。该突变株与野生型(wt)亲本病毒相比，在26℃生长效率有所提高，但其复制既不是温度敏感型的，也不是显著冷适应型的。但是所述冷传代的突变株对于成年人是减毒的。尽管对以前已感染过RSV的婴儿和儿童(即血清反应阳性个体)有令人满意的减毒和免疫原性，但cpRSV突变株对血清反应阴性婴儿的上呼吸道保留了低水平毒力。
相似地，Gharpure等(J.Virol.3：414-421，1969)报道了分离同样有前途作为疫苗候选对象的温度敏感型RSV(tsRSV)突变株。在实验室和自愿者中广泛地评估了一个突变株，ts-1。该突变株在成人自愿者中产生无症状感染，并在免疫后45天赋予对野生型病毒攻击的抗性。另外，尽管血清反应阳性婴儿和儿童经历了无症状感染，但血清反应阴性婴儿却产生鼻炎和其他轻微症状。此外，检测到ts表型不稳定。尽管表现部分或完全丧失稳定敏感型的病毒代表了一小部分可从疫苗回收的病毒，但其与轻微鼻炎以外的疾病症状无关。
这些及其他研究表明某些冷传代和稳定敏感型RSV菌株是减毒不够的，会在某些疫苗接种者，特别是血清反应阴性婴儿中引起轻微的疾病症状，而其他的是减毒过度的，因此不能充分复制以便引发保护性免疫反应，(Wright等，Infect.Immun.，37：397-400，1982)。此外，候选疫苗突变株的遗传不稳定性导致丧失了其温度敏感型表型，进一步阻碍了开发有效的RSV疫苗。通常参见(Hodes等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.145：1158-1164，1974；McIntosh等，Pediatr.Res.8：689-696，1974；和Belshe等，J.Med.Virol.，3：101-110，1978)。
作为另一种活减毒RSV疫苗，研究人员还用纯化的RSV包膜糖蛋白检测了亚单位疫苗候选物。在棉鼠肺中所述糖蛋白诱导对RS病毒感染的抗性，(Walsh等，J.Infect.Dis.155：1198--1204，1987)，但所述抗体有很弱的中和抗性，而且用纯化的亚单位疫苗免疫啮齿动物会产生疾病增强作用(Murphy等，Vaccine8：497-502，1990)。
另外还探究了表达F或G包膜糖蛋白的重组牛痘病毒疫苗。这些重组体表达不能区别于真正病毒对应物的RSV糖蛋白，用牛痘-RSVF和G重组体皮内感染的啮齿动物会产生高水平的能中和病毒感染力的特异性抗体。事实上，用牛痘-F重组体感染棉鼠在下呼吸道中刺激了几乎对复制RSV的完全抗性以及在上呼吸道中的显著抗性。(Olmsted等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：7462-7466，1986)。但是，用牛痘-F和-G重组体免疫黑猩猩对在上呼吸道的RSV攻击几乎没有保护作用(Collins等，Vaccine8：164-168，1990)，而且在下呼吸道只有易变的保护作用(Crowe等，Vaccine11：1395-1404，1993)。
尽管尽了许多努力去开发有效的RSV疫苗，但迄今为止经注册许可的疫苗还未得到批准。以前方法未完成的愿望使得不需要采用新的策略来开发RSV疫苗，具体地说是操作重组RSV以掺入遗传改变在活减毒RSV重组体中产生新表型的方法。但是迄今为止，操作RSV的基因组RNA和其他非区段的负义RNA病毒证明是困难的。这方面主要障碍包括这些病毒裸基因组RNA的非感染性、在组织培养中病毒生长不足、长复制循环、病毒体的不稳定性、复杂的基因组以及基因产物的难以改变的结构。
但是所述被批准的疫苗在没有母体抗体的较大年龄血清反应阴性婴儿中仍有轻微的反应原性，因此，正在开发基于英国牛轮状病毒株的第二代詹纳尔氏疫苗以取代RRV疫苗。还探索了用詹纳尔氏方法开发用于1型副流感病毒和甲型肝炎病毒的疫苗(Emerson等，J.Infect.Dis.173：592-7，1996；Hurwitz等，Vaccine15，533-40，1997，所述文献在此引入作为参考)。用詹纳尔氏方法用于开发A型流感病毒的活减毒疫苗，但不能生产用于人类的持续减毒的疫苗(Steinhoff等，JournalofInfectiousDiseases163：1023-1028，1991，在此引入作为参考)。
基于前面的发展，现在可以从cDNA回收感染性RSV并设计和完成针对RSV克隆子的各种遗传操作以构建新疫苗候选对象。此后，可评估并调整减毒水平和表型稳定性，以及其他所需的表型特征。由此保留的攻击开发广泛多样的可使用的遗传操作菜单，所述遗传操作可单独或与其他类型的遗传操作结合使用，以构建有广泛疫苗应用的感染性的减毒RSV克隆子。在本发明中本领域迫切需要允许进行生产安全有效疫苗的另外工具和方法以缓解由RSV引起的严重的健康问题。令人惊奇的是，本发明通过提供用于构建感染性、减毒RSV疫苗候选对象的其他工具满足了这种需要。
发明概述
本发明的嵌合人-牛RSV是通过重组改造以便掺入来自人和牛RSV病毒株的核苷酸序列，从而产生感染性的嵌合病毒或其亚病毒颗粒。在这种方式中，用重组技术生产候选疫苗病毒以便在对目的病原体易感的哺乳动物宿主，包括人和非人灵长目中，引出抗RSV或另一病原体的免疫反应。
本发明作例征的人-牛嵌合RSV掺入含人和牛多核苷酸序列以及主要核壳(N)蛋白质、核壳磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)和RNA聚合酶延长因子的嵌合RSV基因组或反基因组。在各种不同组合中可包括其他RSV蛋白质以提供各种感染性亚病毒颗粒，最多可提供完整的病毒颗粒或含额外的蛋白、抗原决定基或其他组分的病毒颗粒。
本发明的嵌合人-牛RSV包括衍生于或仿造自与不同RSV病毒株或亚型病毒的一个或多个异源基因或基因组区段组合的人或牛RSV病毒株或亚型病毒的部分或完整“背景”RSV基因组或反基因组以形成人-牛嵌合RSV基因组或反基因组。在本发明的特定方面，嵌合RSV掺入与来自人RSV的一个或多个异源基因或基因组区段组合的部分或完整牛RSV背景基因组或反基因组。在本发明的另一方面，嵌合RSV掺入与人RSV的一个或多个异源基因或基因组区段组合的部分或完整牛RSV背景基因组或反基因组。
在作例证的实施方案中，本发明涉及感染性嵌合呼吸道合胞病毒(RSVs)，所述RSVs含有主要的核壳(N)蛋白、核壳磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)、RNA聚合酶延长因子，以及与不同RSV的一个或多个异源基因和/或基因组区段组合的人或牛RSV的部分或完整RSV背景基因组或反基因组以形成人-牛嵌合RSV基因组或反基因组。可用于本发明的异源基因和/或基因组区段包括一个或多个RSVNS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F或G基因或基因组区段。或者，掺入人-牛嵌合RSV中的异源基因和基因组区段可包括RSV基因组的前导序列、非转录尾区或基因间区或其区段。
在更详细的实施方案中，本发明的人-牛嵌合RSV掺入编码RSVF、G和/或SH糖蛋白或其免疫原性结构域或其表位的一个或多个异源基因和/或基因组区段。或者，人-牛嵌合RSV可掺入含有同时人和牛糖蛋白结构域或免疫原性表位的嵌合糖蛋白。例如通过将编码在适当阅读框架中的糖蛋白胞外结构域的异源基因组区段和编码牛基因组或反基因组中相应糖蛋白的功能剩余部分的基因组区段掺入到牛背景基因组或反基因组中以构建后一种类型的嵌合体，由此所得的嵌合病毒表达功能性的嵌合糖蛋白。
在本发明的其他实施方案中，提供人-牛嵌合RSV，其中通过掺入一个所选的牛基因、基因组区段或多数个基因或基因组区段而使人RSV减毒。在特定的实施方案中，将来自BRSV的所选的异源基因组合共同转移到HRSV背景基因组或反基因组中。从单个的或共同转移的基因组中可选择牛RSV基因包括RSVN、P、NS1、NS2、M2-1和M基因，所述基因在人RSV背景基因组或反基因组中可由来自牛RSV的一个或多个异源基因单个取代或者以任何组合取代以产生减毒的嵌合衍生物。在更详细的方面，用来自牛RSV的相应N和P基因共同取代人RSV的N和P基因。RSV基因组中特定基因间的功能协同性有助于这种共同的基因取代，在基因组中相邻基因对的情况下这样的情形会经常出现。因此，在其他可选择的实施方案中，用来自牛RSV的相应NS1和NS2基因取代人RSV的NS1和NS2基因。在其他实施方案中，用牛RSV的相应基因取代HRSV的M2-1、M2-2和L基因中的两个或多个。对于本发明中需要高水平宿主范围限制的特定疫苗候选株来说，用来自牛RSV的相应N、P、NS1、NS2、M2-1和M基因分别取代每一个人RSV的N、P、NS1、NS2、M2-1和M基因。
本发明的其他人-牛嵌合RSV掺入选自F、G和SH的一个或多个人RSV糖蛋白基因，在与部分或完整牛RSV背景基因组或反基因组内相应基因或基因组区段的野生型基因顺序位置相比更靠近启动子的位置将所述人RSV糖蛋白基因加入或替换。在一个这样的实施方案中，用两个人RSV糖蛋白基因G和F分别在基因顺序位置1和2代替在部分牛RSV背景基因组或反基因组中分别在野生型位置7和8缺失的相应G和F糖蛋白基因。在实施例中描述的携带这些特征的作例证的人-牛嵌合RSV是rBRSV/A2G1F2。
″基因组区段″指来自RSV基因组的任何长度的连续核苷酸，它可以是部分ORF、部分基因或基因外区域，或其组合。
部分或完整背景基因组或反基因组通常作为受体骨架或载体，人或牛RSV对应物的异源基因或基因组区段引入其中。来自人或牛RSV对应物的异源基因或基因组区段代表“供体”基因或多核苷酸，这些“供体”基因或多核苷酸与背景基因组或反基因组组合，加入或被替换到其中从而产生与一种或两种起作用的RSV相比表现出新表型特征的嵌合RSV。例如在所选的受体RSV株内加入或代替异源基因或基因组区段与未修饰的受体和/或供体的相应表型相比会导致减毒作用的增强或降低、生长变化、免疫原性改变或另一种所需的表型的改变。
在本发明中可选用作异源插入或加入的基因或基因组区段包括编码NS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F或G蛋白质或其部分的基因或基因组区段。也可考虑调节区，例如基因外前导或非转录尾区。在本发明优选的实施方案中，嵌合RSV掺入编码RSVF、G或SH糖蛋白的一个或多个异源基因。或者，嵌合RSV可掺入编码RSVF、G或SH糖蛋白的胞质结构域、跨膜结构域、胞外结构域或免疫原性表位的基因组区段。这些免疫原性蛋白、结构域和表位在人-牛嵌合RSV中特别有用，因为它们在所免疫的宿主中产生新的免疫反应。具体地说，G和F蛋白、免疫原性结构域和表位在其中提供主要中和和保护性抗原。另外，可将编码非RSV蛋白，例如在流行性腮腺炎和SV5病毒中发现的SH蛋白的基因和基因组区段掺入本发明的人-牛PIV内。调节区例如基因外3′前导或5′非转录尾区以及基因-起始、基因-终止、基因内区域或3′或5′非编码区也可用作异源取代物或加入物。
例如，加入或代替来自人RSV亚型或病毒株的一个或多个免疫原性基因或基因组区段至或在牛受体基因组或反基因组内产生能够抗人供体病毒，包括一种或多种特异性人RSV亚型或病毒株的免疫反应的重组、嵌合病毒或亚病毒颗粒，同时牛骨架赋予减毒表型使所述嵌合体可作为疫苗开发的有用的候选病毒株。在一个作例证的实施方案中，一个或多个人RSV糖蛋白基因F、SH、和/或G被加入或取代部分或完整的牛基因组或反基因组以产生减毒的感染性人-牛嵌合体，所述嵌合体在易感宿主中引发抗人RSV的免疫反应。在其他实施方案中，人-牛嵌合RSV还掺入编码来自多个人RSV病毒株的编码免疫原性蛋白、蛋白结构域或表位的基因组或基因组区段，例如来自RSV亚型A和B的两个F或G蛋白或其免疫原性部分。在其他实施方案中，人-牛嵌合RSV基因组或反基因组编码具有人和牛糖蛋白结构域或免疫原性表位的重组病毒和亚病毒颗粒中的嵌合糖蛋白。例如，可将编码人RSVF、SH或G糖蛋白的糖蛋白胞外结构域的异源基因组区段与编码在背景牛基因组或反基因组中相应牛F、SH或G糖蛋白的糖蛋白胞质结构域和胞外结构域的基因组区段相连。
根据本发明的方法，通过用异源基因或基因组区段取代部分RSV背景基因组或反基因组中的对应基因或基因组区段可构建人-牛嵌合RSV。或者，可将异源基因或基因组区段作为额外的基因或基因组区段与完整(或部分，如果另一基因或基因组区段被缺失)RSV背景基因组或反基因组结合。例如，可包括两个人RSVG或F基因或基因组区段，分别来自RSVA和B亚型。
在本发明提供的其他方法中，可以在部分或完整RSV背景基因组或反基因组内对应于相应基因或基因组区段的野生型基因顺序位置上将异源基因或基因组区段加入或替换。在其他实施方案中，在与背景基因组或反基因组内相应基因或基因组区段的野生型基因顺序位置相比更靠近或更远离启动子的位置将异源基因或基因组区段加入或替换以分别提高或降低所述异源基因或基因组区段的表达。
在本发明的一般方面，可将牛基因或基因组区段加入或替换在人RSV背景中以形成减毒的人-牛嵌合RSV。或者所述嵌合体可由一个或多个人基因或基因组区段组成，用该基因或基因组区段加入或替换在牛RSV背景中从而形成减毒的RSV疫苗候选株。在本发明中，嵌合RSV基因组或反基因组是由部分或完整牛RSV背景基因组或反基因组与来自人RSV的异源基因或基因组区段组合形成的。由此形成的嵌合RSV可掺入来自A亚型或B亚型人RSV或来自特定人RSV病毒株的异源基因或基因组区段。在优选的方面，用一个或多个人RSV糖蛋白基因F、G和SH或编码人RSV糖蛋白基因之胞质结构域、跨膜结构域、胞外结构域或免疫原性表位的基因组区段替换牛RSV背景基因组或反基因组内对应的基因或基因组区段。
在作例证的实施方案中，用一个或两个人RSV糖蛋白基因F和G代替牛RSV背景基因组或反基因组内一个或两个对应的F和G糖蛋白基因。在下文所述的具体实施例中，同时用人RSV糖蛋白基因F和G替换牛RSV背景基因组或反基因组中对应的F和G糖蛋白基因。在平行的方式中，可很容易地设计本发明的嵌合人-牛RSV以掺入来自不同RSV病毒株或亚型，例如A和B亚型人RSV两者的抗原决定基。
在本发明的其他方面，通过导入体现所得病毒或亚病毒颗粒的减毒表型的一个或多个减毒突变进一步修饰嵌合基因组或反基因组，从而生产减毒的人-牛嵌合RSV。可根据常规设计诱变策略重新产生并这些减毒突变并检测减毒效果。或者在现有的生物学衍生的突变RSV中鉴定减毒突变，然后掺入到本发明的人-牛嵌合RSV中。
本发明提供了用于使抗RSV和其他病原体的活病毒疫苗减毒的新基础，所述减毒作用部分是基于宿主范围作用。早期的研究涉及用来自HRSV(44个核苷酸)的对应序列调换BRSV(45个核苷酸)的外前导区(Buchholz等，J.Virol.73：251-259，1999)。这两个序列均不编码蛋白质，也没有观察到显著的表型效果。本发明通过在HRSV和BRSV间导入基因组区段、完整基因或多基因而提供了减毒的嵌合RSV。
用于掺入到本发明人-牛嵌合RSV中的减毒突变可被选在供体或受体RSV基因的编码部分或者非编码区例如顺调节序列。作例证的非编码突变包括在基因起始序列中的单个或多碱基改变，例如例证中在M2基因起始序列中核苷酸7605(在重组序列中核苷酸7606)中的单个或多碱基替换。
本发明的感染性嵌合RSV可掺入异源的编码或非编码核苷酸序列，这些序列来自任何RSV或RSV样病毒，例如人、牛、鼠(小鼠肺炎病毒)或鸟(火鸡鼻气管炎病毒)肺炎病毒或者来自另一个被膜病毒例如副流感病毒(PIV)。作例证的异源序列包括在人-牛嵌合RSV中来自一种人RSV病毒株的RSV序列与来自不同人RSV病毒株的序列的组合。例如，本发明的嵌合RSV可掺入来自2个或多个野生型或突变RSV病毒株，例如选自cptsRSV248、cpts248/404、cpts248/955、cptsRSV530、cpts530/1009或cpts530/1030的突变株。或者，人-牛嵌合RSV可掺入来自2个或多个野生型或突变人RSV亚型的序列，例如人RSVA亚型与B亚型序列的组合。在其他方面，用来自异源RSV和非RSV病毒的对应序列，单独或所选减毒突变的一个或多个组合，例如cp和/或ts突变，取代一个或多个人RSV编码或非编码多核苷酸以产生新型减毒的疫苗病毒株。
掺入在本发明嵌合cDNAs、载体和病毒颗粒中的突变可以是单个或者组合导入全长人-牛嵌合RSVcDNA，含所导入突变的获救病毒的表型很容易测定。在作例证的实施方案中，氨基酸改变由减毒的、生物学衍生的病毒对野生型RSV展现出来。例如由cpRSV或tsRSV表现的改变可以组合的方式掺入重组人-牛嵌合RSV中以达到所需的减毒水平。
在本发明的其他方面，可很容易地将嵌合人-牛RSV设计为″载体″以掺入抗原决定基，这些抗原决定基来自不同病原体，包括不同RSV病毒株或类(例如人RSVA和RSVB亚型)、包括HPIV3、HPIV2和HPIV1的人副流感病毒(HPIV)、麻疹病毒以及其他病原体(参见例如美国临时专利申请序列号60/170,195；美国专利申请号09/458,813；以及美国专利申请号09/459,062，每篇文献在此引入作为参考)。在不同实施方案中，牛-人嵌合基因组或反基因组含有部分或完整RSV“载体基因组或反基因组”，该载体基因组或反基因组与一个或多个异源基因或基因组区段相组合，该异源基因或基因组区段编码一个或多个异源病原体的一个或多个抗原决定基。异源病原体可以是异源RSV(即不同病毒株或亚型的RSV)，而且所述异源基因或基因组区段可编码RSVNS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F或G蛋白质或其片段(例如免疫原性结构域或表位)。例如，载体基因组或反基因组可以是部分或完整RSVA基因组或反基因组，而且所述异源基因或基因组区段可编码RSVB亚型病毒的抗原决定基。
在其他实施方案中，人-牛嵌合RSV载体基因组或反基因组可以是部分或完整BRSV基因组或反基因组，而且编码抗原决定基的异源基因或基因组区段是一个或多个HRSV。例如，部分或完整BRSV基因组或反基因组中可掺入一个或多个编码一个或多个选自F、G和SH的HRSV糖蛋白基因的基因或基因组区段，或者一个或多个编码HRSVF、G和/或SH的胞质结构域、跨膜结构域、胞外结构域或免疫原性表位的基因组区段。
在其他实施方案中，用于携带异源抗原决定基的设计为“载体”的人-牛嵌合RSV中掺入非RSV病原体例如人副流感病毒(HPIV)的一个或多个抗原决定基。在一个作例证的实施方案中，将编码一个或多个HN和/或F糖蛋白或抗原结构域或其片段或表位的一个或多个HPIV1、HPIV2或HPIV3基因或基因组区段加入或掺入至部分或完整HRSV载体基因组或反基因组内。在更详细的实施方案中，将含HPIV1、HPIV2或HPIV3HN或F基因的读码框(ORF)的转录单位加入或掺入嵌合HRSV载体基因组或反基因组中。
在其他可选择的实施方案中，载体基因组或反基因组含有部分或完整HRSV或BRSV基因组或反基因组，而且异源病原体选自麻疹病毒、A和B亚型呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、1型和2型人免疫缺陷型病毒、单纯性疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、EB病毒、线状病毒、布尼亚病毒、黄热病病毒、虫传病毒和流感病毒。以此候选病原体的作例证目录为基础，所选的异源抗原决定基可选自麻疹病毒HA和F蛋白质，A和B亚型呼吸道合胞病毒F、G、SH和M2蛋白质，流行性腮腺炎病毒HN和F蛋白质，人乳头瘤病毒LI蛋白质，1型或2型人免疫缺陷型病毒gp160蛋白，单纯性疱疹病毒和巨细胞病毒gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL及gM蛋白，狂犬病病毒G蛋白，EB病毒gp350蛋白；线状病毒G蛋白，布尼亚病毒G蛋白，黄热病病毒E和NS1蛋白，以及虫传病毒E蛋白，和其抗原结构域、片段和表位。在一实施方案中，异源病原体是麻疹病毒，而异源抗原决定基选自麻疹病毒HA和F蛋白及其抗原结构域、片段和表位。为了获得所述嵌合构建体，可将含麻疹病毒HA基因的读码框(ORF)的转录单位加入或掺入HRSV载体基因组或反基因组内。
本发明提供人-牛嵌合RSV克隆、多核苷酸表达构建体(也称为载体)以及颗粒，这些可掺入到以所选的组合导入嵌合基因组或反基因组中的多表型—特异性突变中，从而产生减毒的感染性病毒或亚病毒颗粒。与常规表型评估联用的该方法提供了具有如减毒、温度敏感性、改变的免疫原性、冷适应性、小噬菌斑、宿主范围限制等所需特征的人-牛嵌合RSV。将由此鉴定的突变编辑到″菜单″中，然后导入不同的组合以校准疫苗病毒达到所选的减毒水平、免疫原性和稳定性。
在本发明的其他方面，构建含有或不含有减毒突变的人-牛嵌合RSV，以使其具有核苷酸修饰，从而产生所需的表型、结构或功能改变。通常，所选的核苷酸修饰将确定表型改变，例如在生长特征、减毒、温度敏感性、冷—适应性、噬菌斑大小、宿主范围限制或免疫原性方面的改变。在本发明中结构改变包括为便于操作和鉴定，将限制位点导入或切除编码CDNAs的RSV中。
在优选的实施方案中，人-牛嵌合RSV的核苷酸改变包括通过缺失基因或切除其表达来修饰病毒基因。在本发明中用于突变的靶基因包括吸附(G)蛋白、融合(F)蛋白、小疏水(SH)、RNA结合蛋白(N)、磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)、转录延长因子(M2ORF1)、RNA调节因子M2ORF2、基质(M)蛋白以及两个非结构蛋白NS1和NS2。可将这些蛋白质中的每一个，全部或部分、单独或与其他所需的修饰结合，选择性地缺失、替换或重排以获得新的嵌合RSV重组体。
可选择的核苷酸修饰包括在人-牛嵌合体中缺失、插入、增加或重排所选基因的顺式作用调节序列。在一实施例中，将一RSV基因的顺式作用调节序列改变成相应的异源调节序列，它可以是不同RSV中相同基因的对应顺式作用调节序列或不同RSV基因的顺式作用调节序列。例如，通过转变或替换成在相同RSV病毒株中不同基因的基因终止信号可修饰基因终止信号。在其他实施方案中，核苷酸修饰可在嵌合基因组或反基因组内包括插入、缺失、替换或重排翻译起始位点，例如以便切除所选蛋白质形式的其他翻译起始位点。在一实施例中，切除了RSVG蛋白质的分泌形式的翻译起始位点以修饰这种形式的G蛋白的表达，由此产生所需的体内效果。
另外，在人-牛嵌合RSV基因组或反基因组中可单独或与一种或多种采纳自生物学衍生的突变RSV的减毒突变一起产生多种其他的遗传改变。例如，可全部或部分插入来自非RSV源的基因或基因组区段。或者，改变基因的顺序、除去基因重叠或者用其反基因组对应物替换RSV基因组启动子。在嵌合基因组或反基因组中可进行不同的或另外的修饰以便有利于操作，例如在不同基因间区域(例如在G和F基因间的特有StuI位点)或在别处插入特有的限制位点。可除去非翻译基因序列以提高插入的外源序列的能力。在其他方面，能修饰编码嵌合RSV基因组或反基因组的多核苷酸分子或载体以编码非-RSV序列，例如细胞因子、T辅助细胞表位、限制位点标记或者一种能够在所需宿主中引发保护性免疫反应的微生物病原体(例如病毒、细菌或真菌蛋白。在一所述实施方案中，构建掺入了副流感病毒(PIV)的基因或基因组区段，例如PIVHN或F糖蛋白或其免疫原性结构域或表位的人-牛嵌合RSV。
在人-牛嵌合RSV基因组或反基因组内的所有前述修饰，包括产生点突变的核苷酸插入、重排、缺失或替换、点特异性核苷酸改变以及包含整个基因或基因组区段的改变均可用于异源供体基因或基因组区段或者受体背景基因组或反基因组。在每种情况中，这些改变优选将确定在所得重组RSV中的一个或多个表型改变，例如导致减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬菌斑、宿主范围限制、基因表达改变或免疫原性表位改变的表型改变。
在一实施方案中，提供了含有编码人-牛嵌合RSV基因组或反基因组的经分离的多核苷酸分子的表达载体。还提供了相同或不同的表达载体，该载体含有一个或多个编码N、P、L和RNA聚合酶延长因子蛋白的经分离的多核苷酸分子。然后可从所述基因组或反基因组cDNA中直接表达蛋白质。该载体在细胞或无细胞溶解产物中优先表达或共表达，由此产生感染性人-牛嵌合RSV颗粒或亚病毒颗粒。
通过相同或不同的表达载体可共表达RSV基因组或反基因组和N、P、L和RNA聚合酶延长因子(优选RSV的M2(ORF1)的产物)蛋白。在某些情况下，N、P、L和RNA聚合酶延长因子蛋白是各自被不同的表达载体编码。编码人-牛嵌合RSV基因组或反基因组的多核苷酸分子是可操作相连的人和牛多核苷酸序列的嵌合体，以便由此可生产感染性病毒或病毒颗粒。在本发明其他方面，人-牛嵌合RSV基因组或反基因组可包括来自多种人RSV病毒株或亚型(A和B)的序列以及其他非人(例如鼠)RSV序列。在其他方面，人-牛嵌合RSV基因组或反基因组可掺入非-RSV序列，例如含有与编码PIV或另一负链RNA病毒的点突变、蛋白质、蛋白质结构域或免疫原性表位可操作相连的人和牛RSV的序列的多核苷酸。
用于生产人-牛嵌合RSV的上述方法和组合物产生感染性病毒或亚病毒颗粒，或其衍生物。感染性病毒类似真正的RSV病毒颗粒是感染性的。它可以直接感染新鲜细胞。感染性亚病毒颗粒通常是在适宜条件下可引起感染的病毒颗粒的亚组分。例如，含基因组或反基因组RNA和N、P、L和M2(ORF1)蛋白质的核壳就是亚病毒颗粒的实例，如果导入到细胞胞质中它可引起感染。本发明中提供的亚病毒颗粒包括缺少对感染性非必需的一种或多种蛋白质、蛋白质片段或其他病毒组分的病毒颗粒。
在其他实施方案中，本发明提供含表达载体的细胞或无细胞溶解产物，一种表达载体含有编码上述人-牛嵌合RSV基因组或反基因组的分离的多核苷酸分子，和另一种表达载体(相同或不同载体)还可含有一个或多个编码RSVN、P、L和RNA聚合酶延长因子蛋白的分离的多核苷酸分子。还可从基因组或反基因组cDNA中表达这些蛋白质中的一种或多种。表达后，基因组或反基因组与N、P、L和RNA聚合酶延长因子蛋白组合产生感染性人-牛嵌合RSV病毒或亚病毒颗粒。
本发明减毒的人-牛嵌合RSV能够在所感染的人宿主中引发有效的免疫反应，该嵌合RSV还是充分减毒的以便在所免疫的宿主中不会引起不可接受的严重呼吸疾病症状。所述减毒嵌合病毒或亚病毒颗粒可存在于细胞培养上清液中，从培养液中分离，或者部分或完整纯化。还可将所述病毒冻干，与各种其他组分组合便于按需要贮存或传递给宿主。
本发明进一步提供了含生理学可接受载体和/或佐剂以及分离的减毒人-牛嵌合RSV的新疫苗。在一实施方案中，所述疫苗由含有至少一种，优选两种或多种上述减毒突变或其他核苷酸修饰的人-牛嵌合RSV组成。可将所述疫苗配制成103-106剂量PFU的减毒病毒。所述疫苗可含有引发针对一种RSV病毒株或抗原亚型，例如A或B或者针对多种RSV病毒株或亚型的免疫反应的减毒嵌合病毒。就此而言，本发明的人-牛嵌合RSV可单独引发非特异性免疫反应或者针对多种RSV病毒株或亚型的多特异性免疫反应。可将人-牛嵌合RSV与其他具有不同免疫原性特征的嵌合RSV或非嵌合RSV组合在疫苗制剂中以便产生针对一种或多种RSV病毒株或亚型的更有效的保护作用。
附图简述
图1A和1B描述了用人RSV(HRSV)病毒株A2的G和F基因替换重组(r)牛RSV(BRSV)病毒株ATue51908的G和F基因以产生重组嵌合病毒rBRSV/A2。
图1A是rBRSV的基因组图，说明用HRSV的F和G基因替换F和G基因。读码框(ORFs)的位置用阴影(BRSV)或空白(HRSV)长方形表示。G和F基因为扩展部分，其中基因终止/多腺苷酸化信号由棒形表示，基因起始信号为实心三角，作为遗传标记或作为替换的限制片段边界的合成限制位点的位置由箭头与下方所示的在完整反基因组序列中的位置一起表示。括号中表示由标记限制位点构成的片段大小。左侧表示重组病毒的基因组长度。罗马数字(I、II和III)指图1B中展开的基因间区域。
图1B说明生物学衍生的BRSV病毒株ATue51908(顶线)的SH/G(I)、G/F(II)和F/M2(III)基因间区域的排列；重组版本rBRSVATue51908(第二条线)、重组嵌合病毒rBRSV/A2(第三条线)和生物学衍生的HRSV病毒株A2(底线)。图1B，I组：SH/G基因间区域：ATue51908(顶线)(SEQIDNO：1)；rBRSV(第二条线)(SEQIDNO：2)；rBRSV/A2(第三条线)(SEQIDNO：3)；HRSV病毒株A2(底线)(SEQIDNO：4)。图1B，II组：G/F基因间区域：ATue51908(顶线)(SEQIDNO：5)；rBRSV(第二条线)(SEQIDNO：6)；rBRSV/A2(第三条线)(SEQIDNO：7)；HRSVA2(底线)(SEQIDNO：8)。图1B，3组：F/M2基因间区域：ATue51908(顶线)(SEQIDNO：9)；rBRSV(第二条线)(SEQIDNO：10)；rBRSV/A2(第三条线)(SEQIDNO：11)；HRSVA2(SEQIDNO：12)。将序列表示为DNA正链。缺口用点表示，基因起始和基因终止信号用阴影表示，翻译起始密码子用黑体字表示。斜条纹标记表示核苷酸同一性。通过将识别序列划为阴影来表示限制位点。Orf是读码框。数字指基因组位置(对于BRSV，病毒株ATue51908：GenBank登记号为：AF092942；对于HRSV病毒株A2：GenBank登记号为：M74568)。
图2A-2C说明在生物学衍生的BRSV(ATue51908)；其重组版本rBRSV、和重组嵌合体rBRSV-A2的基因组中的标记限制位点。用所示的病毒感染BSRT7/5细胞的总RNA完成RT-PCR。对PCR产物进行限制分析，然后在2％(图2A，2B)或3％琼脂糖凝胶(图2C)上分析。以计算的大小估计核苷酸长度。在所有情况下，当省略了RT步骤时就不用检测PCR产物。标记为梯度1kb的DNA(LifeTechnologies，Gaithersburg，Maryland)。一些标记片段的大小显示在右侧。
图2A表示对应于位置3612-4886(ATue51908和rBRSV)或位置3612-4885(rBRSV/A2)和包含在重组病毒分离物的SH/G基因间区域中的SalI位点(位置4673)的RT-PCR产物分析。用SalI消化对应于预测大小约为1,273-1,274bp的PCR产物。酶切消化不会切开生物学衍生的ATue51908，因它缺乏一种导入的位点，而对于重组病毒，酶切消化会产生1,061bp(两种病毒)和213bp(rBRSV)或212bp(rBRSV/A2)的带。
图2B表示对应于位置5372-5964(ATue51908和rBRSV)或位置5452-6062(rBRSV/A2)的，含重组病毒中的G/F基因间区域和相应标记限制位点(在rBRSV位置5539的SphI位点或者在rBRSV-A2位置5619的StuI位点)的RT-PCR产物的分析。PCR产物的预期大小约为592(ATue51908和rBRSV)或610(rBRSV/A2)。按照预测，SphI仅消化rBRSV，产生425bp和167bp的片段；而StuI仅消化rBRSV/A2，产生443bp和167bp的片段。
图2C表示跨位置7218-7852(ATue51908和rBRSV)或7316-7939(rBRSV/A2)的，含F/M2基因间区域的RT-PCR产物的分析。按照预测，用Xhol消化不会切开ATue51908，但在rBRSV和rBRSV/A2的情况下，产生395bp(两种病毒)和267bp(rBRSV)或256bp(rBRSV/A2)的片段。这表明在重组病毒的基因组中存在导入的Xhol位点(rBRSV位置7471，rBRSV-A2位置7558)。
图4A提供了选用戊二醛固定，再用免疫金标记并负染的(一般观察和放大)重组BRSV的病毒体的电子显微镜检查。图4B提供了在超薄切片中检测的病毒体的电子显微镜检查。通过制备技术保存在病毒体表面上的长丝状病毒体形状和抗原表位。(图4A棒：2μ，放大：棒：100nm，图4B棒：150nm.)。
图5表示利用单克隆抗体与HRSVF和BRSVF蛋白(A、C和E组)或仅仅与HRSVF蛋白(B、D和F组)反应的免疫金标记。rBRSV(A和B组)、rBRSV/A2(C和D组)以及HRSV病毒株Long(E和F组)的制备物标记。棒：150nm。
图6表示利用单克隆抗体与BRSVG蛋白质(A、C和E组)或HRSVG蛋白(B、D和F组)反应的免疫金标记。rBRSV(A和B组)、rBRSV/A2(C和D组)以及HRSV病毒株Long(E和F组)的制备物标记。棒：150nm。
图7A和7B描述了用HRSV病毒株Long的F基因替换rBRSV病毒株ATue51908的F基因以产生重组嵌合病毒rBRSV/LongF。
图7A是rBRSV基因组的示意图，表示用HRSV病毒株Long的F基因替换F基因。读码框(ORFs)的位置用阴影(BRSV)或空白长方形(HRSV)表示。将F基因放大表示，其中基因终止/多腺苷酸化信号用棒表示，基因起始信号用实心三角表示，作为遗传标记或作为替换的限制片段边界的合成限制位点的位置由箭头与下方所示的在完整反基因组序列中的位置一起表示。括号中表示由标记限制位点构成的片段大小。左侧表示重组病毒的基因组长度。罗马数字(I、II和III)指图8B中展开的基因间区域。
图7B说明生物学衍生的BRSV病毒株ATue51908(顶线)的SH/G(I)、G/F(II)和F/M2(III)基因间区域的排列；重组版本rBRSVATue51908(第二条线)、重组嵌合病毒rBRSV/LongF(底线)。图1B，图7B注解如下：I组：SH/G基因间区域：ATue51908(顶线)(SEQIDNO：1)；rBRSV(第二条线)(SEQIDNO：2)；rBRSV/LongF(第三条线)(SEQIDNO：2)。图7B，II组：G/F基因间区域：ATue51908(顶线)(SEQIDNO：5)；rBRSV(第二条线)(SEQIDNO：6)；rBRSV/LongF(第三条线)(SEQIDNO：13)。图7B，3组：F/M2基因间区域：ATue51908(顶线)(SEQIDNO：9)；rBRSV(第二条线)(SEQIDNO：10)；rBRSV/A2(第三条线)(SEQIDNO：11)。
图9提供了rBRSV/LongF的表面蛋白的免疫电子显微镜分析。A组：BRSVG蛋白的mabG66；B组：BRSVG蛋白的mab021/21G；C组：与HRSV和BRSV的F蛋白均反应的mab2F；以及D组：HRSVF蛋白特异性的mab44F。棒：150nm。
图12表明用rBRSV/A2-G1F2、rBRSV/A2或rA2感染的HEp-2细胞的间接免疫荧光。在0.1MOI时感染细胞，在37℃保温96小时，用丙酮固定，透化，然后与HRSVG蛋白特异性的单克隆抗体021/1G或者与HRSVF蛋白特异性的单克隆抗44F反应。通过与标记的对鼠IgG特异性抗体反应肉眼观察抗体结合。
图13含HRSV的M、G和F基因的嵌合rBRSV/HRSV的详细构建。BRSV基因用阴影表示；HRSV基因用空白表示。指称HRSV基因的序列位置编号有下划线。图13，A组描述了rBRSV/A2的修饰，从而在P和M基因间的基因间区域(P-MIG)，在位置3204含有一个独特MluI位点。用表明源核苷酸排列的小写字母表示IG序列。有下划线的字母表示由5个核苷酸替换产生的MluI位点。核苷酸序列位置编号是相对于完整rBRSV反基因组(Buchholz等，J.Virol.73：251-259，1999；Buchholz等，J.Virol.74：1187-1199，2000；GenBank登记号：AF092942或在Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：11563-11567，1995中的完整rHRSV反基因组)；指称HRSV序列的序列位置数字有下划线。图13，B组说明对rBRSV/A2的修饰产生rBRSV/A2-MGF。切割含BRSVM和SH基因的MluI-SalI片段，然用含HRSVM基因的MluI-SalI片段替换。用方框表示含HRSVM基因的MluI-SalI片段。还列出了包括BRSVP基因终止序列的MluI位点紧靠上游的序列(SEQIDNO：17)，以及包括M个基因的基因间序列(M-GIG)的SalI位点紧靠下游的序列(SEQIDNO：18)，HRSVG基因起始信号和作为GORF起点的ATG(黑体字，斜体)。图13，C组描述了rBRSV/A2-MGF基因组的结构。
具体实施方案的描述
本发明提供了克隆为人和牛RSV基因组或反基因组序列的嵌合体用以产生人-牛嵌合RSV的重组呼吸道合胞病毒(RSV)。人-牛RSV的嵌合构建产生在哺乳动物，特别是人中有感染性的，并对生成免疫原性组合物应用于临床有用的病毒颗粒或亚病毒颗粒。本发明还提供了用于设计和生产减毒的人-牛嵌合RSV的新方法和组合物，以及用于预防和治疗RSV感染的方法和组合物。根据本发明人-牛嵌合RSV和免疫原性组合物可引发针对特异性RSV亚型或病毒株的免疫反应，或者它们可引发针对多种RSV亚型或病毒株的多特异性反应。
RSV的一般特征是副粘病毒家族的被膜非片段负链RNA病毒(Collins等，FieldsVirology2：1313-1352，1996)。其基因组，对于熟知的A2病毒株的长度为15222核苷酸，可转录成编码11种蛋白质的10种mRNA。(Collins等，FieldsVirology2：1313-1352，1996；Atreya等，J.Virol.72：1452-61，1998；Bukreyev等，J.Virol.71：8973-82，1997；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：81-5，1996；Teng和Collins，J.Virol.72：5707-16，1998；Teng和Collins，J.Virol.73：466-473，1999；Whitehead等，J.Virol.73：3438-42，1999，每篇文献在此引入作为参考)。其中的4种是核壳/聚合酶蛋白，即主要核壳N蛋白、磷蛋白P和聚合酶蛋白L以及转录反终止蛋白M2-1。3种是表面糖蛋白，即粘附G蛋白、负责穿透与合胞体形成的融合F糖蛋白以及未知功能的小疏水SH蛋白。基质M蛋白是一种与病毒体形成有个的内病毒体蛋白。还有两种功能未知的非结构蛋白NS1和NS2。最后，在编码RNA调节因子M2-2的M2mRNA中有第二个读码框(ORF)。
G和F蛋白是主要的中和和保护性抗原(Collins等，FieldsVirology2：1313-1352，1996；Connors等，J.Virol.66：1277-81，1992)。对RSV再感染的抗性很大程度上是由特异性抗这些蛋白质的血清和粘膜抗体介导的。RSV-特异性细胞毒T细胞也是由RSV感染诱导的而且可以针对许多不同的蛋白，但尚未表明这种效应对于对再感染的长期抗性来说是一种重要的因素。但是，CD8+和CD4+细胞可能在免疫反应的调节中是重要的，而且两者均与病毒发病机理有关(Johnson等，J.Virol.72：2871-80，1998；Srikiatkhachorn和Braciale，J.Exp.Med.186：421-32，1997)。因此，F和G是最重要的抗原决定基，但其他蛋白质在免疫反应中可能也起重要作用。
通过与单克隆抗体的反应性可将RSV分离物分成两个抗原亚型，A和B(Anderson等，J.Infect.Dis.151：626-33，1985；Mufson等，J.Gen.Virol.66：2111-24，1985)。这两种亚型在基因组上有差异，但最大的差异在G蛋白的胞外结构域，其中氨基酸序列不同的百分比超过50％，而基于单特异性多克隆抗血清的抗原差异为95％(Johnson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5625-9，1987；Johnson等，J.Virol.61：3163-6，1987)。在RSVA与B两个亚型间，F蛋白的氨基酸序列有约10％的差异，而抗原差异为50％(Johnson等，J.Virol.61：3163-6，1987；Johnson和Collins，J.Gen.Virol.69：2623-8，1988)。因此，这两种亚型都应在疫苗中表现。
牛RSV(BRSV)与人RSV(HRSV)有关，而且是牛呼吸道疾病的普遍存在的、商业上重要的因素(Mohanty等，Am.J.Vet.Res.36：417-9，1975；VanderPoel等，J.Infect.29：215-28，1994)。BRSV与HRSV间的序列差异量约为上述HRSVA与B亚型间差异的2倍。因此，BRSV与HRSV间F蛋白质的氨基酸差异约为20％，而G蛋白的差异约为70％(Lerch等，J.Virol.64：5559-69，1990；Lerch等，Virology181：118-31，1991；Mallipeddi和Samal，J.Gen.Virol.74：2001-4，1993；Mallipeddi和Samal，Vet.Microbiol.36：359-67，1993；Samal等，Virology180：453-456，1991；Samal和Zamora，J.Gen.Virol.72：1717-1720，1991；Zamora和Samal，VirusRes.24：115-121，1992；作者同上，J.Gen.Virol.73：737-741，1992；Mallipeddi和Samal，J.Gen.Virol.73：2441-2444，1992；Pastey和Samal，J.Gen.Virol.76：193-197，1995；Walravens等，J.Gen.Virol.71：3009-3014，1990；Yunnus等，J.Gen.Virol.79：2231-2238，1998，分别在此引入作为参考)。从cDNA生产感染性HRSV的能力已延伸到允许生产重组BRSV，由此可生产感染性重组病毒(Buchholz等，J.Virol.73：251-9，1999)。
本发明为提供了基于HRSV与BRSV间嵌合体开发活减毒RSV疫苗候选株。通过cDNA中间体和以cDNA为基础的回收系统构建嵌合体。从cDNA制备的重组病毒可独立复制，并按照它们生物学衍生的相同的方式增殖，而且确实仅通过已特异性插入的突变使其与生物学衍生的病毒区别开。嵌合HRSV/BRSV疫苗候选株优选在通过存在一个或多个BRSV基因而减毒的背景中携带一个或多个HRSV的主要抗原决定基。另外，本发明的人-牛嵌合RSV可被进一步修饰以掺入特异性的减毒突变，以及各种其他突变和核苷酸修饰以产生所需的结构或表型效果。
在更详细的方面，前述引入的文献描述了在本发明中用于诱变、分离和表征RSV的方法和过程以获得减毒的突变病毒株(例如温度敏感型(ts)、冷传代的(cp)、冷适应的(ca)、小噬菌斑(sp)以及宿主范围限制的(hr)突变病毒株)以及用于鉴定说明减毒表型的遗传改变。与这些方法结合，前述文献详细描述了在被接受的模型系统，包括鼠和非人灵长类模型系统中，测定生物学衍生的和重组生产的减毒人RSV，包括人RSVA和B亚型的复制、免疫原性、遗传稳定性以及保护效力的方法。另外，这些文献描述了一般方法，用来开发和检测用于预防和治疗RSV感染的免疫原性组合物，包括单价和双价疫苗。
从cDNA产生感染性RSV的能力提供了经cDNA中间体将预定改变导入感染性病毒的方法。已表明该方法产生了许多感染性、减毒的RSV衍生物，例如在病毒蛋白中含一个或多个氨基酸替换的重组疫苗候选株，缺失一个或多个基因或删除基因表达和/或在顺式作用RNA信号中的一个或多个核苷酸替换，以对病毒表型产生所需的影响(参见例如Bukreyev等，J.Virol.71：8973-8982，1997；Whitehead等，J.Virol.72：4467-4471，1998；Whitehead等，Virology247：232-239，1998；Bermingham和Collins，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：11259-11264，1999；Juhasz等，Vaccine17：1416-1424，1999；Juhasz等，J.Virol.73：5176-5180，1999；Teng和Collins，J.Virol.73：466-473，1999；Whitehead等，J.Virol.73：871-877，1999；Whitehead等，J.Virol.73：3438-3442，1999；以及Collins等，Adv.VirusRes.54：423-451，1999，分别在此引入作为参考)。
在前述引入的参考文献中还公开了各种其他类型的突变，而且这些突变可很容易地被加工到本发明的重组人-牛嵌合RSV中以校准减毒作用、免疫原性或提供其他有力的结构和/或表型效果。例如，用常规方法将限制位点标记导入人-牛嵌合基因组或反基因组中以便有利于cDNA构建和操作。在所引入的参考文献中还描述了各种核苷酸修饰而非点或位点特异性突变，这些突变在本发明中有用。例如公开了用于生产表达其他外源基因，例如氯霉素乙酰转移酶(CAT)或荧光素酶基因之重组RSV的方法和组合物。这些重组体通常表现出与所插入基因有关的生长下降。这种减毒作用似乎随所插入基因的长度而提高。外源基因插入到重组RSV中降低复制水平而且在体外传代过程中稳定，这一发现提供了另一种有效使减毒RSV用于疫苗的方法。通过插入其他所需的基因，例如细胞因子例如γ干扰素、白细胞介素-2、白细胞介素-4和GM-CSF及其他因子可获得类似或提高的效果。
在前述参考文献中公开的用于掺入到本发明重组人-牛嵌合RSV中的另一些核苷酸修饰包括部分或全部缺失或切除所选的RSV基因。因此，可缺失RSV基因或基因组区段，包括部分或全部缺失RSVNS1、NS2、N、P、M、G、F、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)和/或L基因的读码框和/或顺式作用调节序列。在一实施例中，产生一重组RSV，其中通过除去编码SHmRNA和蛋白质的多核苷酸序列而删除了SH基因的表达。缺失SH基因不仅产生了可回收的、感染性RSV，而且在感染性病毒的产率和噬菌斑大小基础上在组织培养中基本上表现出改进的生长的RSV。通过SH缺失说明的在组织培养中的生长改善。为开发人—牛嵌合RSV疫苗提供了有用的工具，例如通过克服培养中RSV产率低的问题。此外，这些缺失针对遗传回复是高度稳定的，使得由此衍生的RSV克隆特别适宜作为疫苗剂。
SH-负RSV重组体还在小鼠上呼吸道表现出位点特异性减毒作用，这对于疫苗开发提供了新的优势。正在评估作为活病毒疫苗的现有RSV菌株，例如cp突变体在组织培养中没有显著地改变生长。这些是宿主范围突变，而且它们限制在黑猩猩和人呼吸道中的复制，在下呼吸道中限制大约100倍。由于从上呼吸道至下呼吸道体温梯度增加，另一作例证型突变，ts突变倾向于优先限制病毒在下呼吸道中复制。与这些cp和ts突变体相反，SH-负RSV突变体有截然不同的表型，即它们在上呼吸道中有较大限制。这对于用于很小的婴儿的疫苗病毒来说是特别理想的，因为需要在上呼吸道中的复制限制以确保在该易受伤害的年龄组中安全施用疫苗，该年龄组的婴儿主要是通过鼻呼吸。此外，在任何年龄组，在上呼吸道减少复制将会减少因中耳炎引起的发病率。除这些优点外，SH缺失突变的性质，包括例如近400个核苷酸并除去了全部mRNA，代表了对回复高度顽固的一类突变。
在本发明SH基因修饰部分还讨论了比较不同RSV，包括人和牛RSV以及其他肺炎病毒的SH基因以便为生产有用的RSV重组疫苗提供另外工具和方法。例如，两种RSV抗原亚型A和B在特定SH结构域显示有相对高度的保守性。在两个所述结构域中，RSVA和B的N-末端区域和推测的跨膜结构域在氨基酸水平有84％同一性，而C末端推测的胞外结构域有较大差异(约50％同一性)。比较两个人RSVB亚型病毒株，8/60与18537的SH基因，仅有一个氨基酸不同(Anderson等，同上)。人对牛RSV的SH蛋白有约40％相同，并共有主要结构特征包括(i)保守残基的不对称分布；(ii)很相似的疏水性外形；(iii)存在两个N相连的糖基化位点，两个位点分别在疏水区的两侧；和(iv)在每个SH蛋白的中心疏水区的C末端侧有一个半胱氨酸残基。(Anderson等，同上)。通过评估这些和其他序列相似性和不同，可筛选出能替换或插入感染性人-牛嵌合RSV克隆中的异源序列，例如以产生具有多特异性免疫原性效果或者择一或者另外所需效果例如减毒作用的疫苗。
在本发明基因缺失还公开了改变基因位置的效果。例如缺失SH基因在更靠近启动子位置的下游基因位置导致有效的改变。这可能是与重组病毒中下游基因转录的增加有关。因此，还提供通过改变基因在基因组或反基因组中的顺序或位置来改变RSV基因表达水平的方法。预期下游基因表达水平的降低将具体说明减毒表型，而表达增加能在允许的宿主例如黑猩猩和人中的重组RSV中获得相反的效果。
引入的参考文献还描述了通过改变作例证的基因，例如NS1和NS2的顺式作用转录信号来调整重组RSV的表型。这些核苷酸修饰的结果与通过改变顺式调节元件例如以降低连读mRNA的水平并提高下游基因的蛋白质表达来修饰基因表达是一致的。所得重组病毒将优选表现出生长动力学提高且噬菌斑增大。对顺式作用调节序列作例证的修饰包括修饰与RSV基因有关的基因终止(GE)和基因起始(GS)信号。本发明中，作例证的改变包括改变NS1和NS2基因的GE信号，使这些信号与RSVN基因的天然发生的GE信号相同。所得的重组病毒表现出生长动力学提高且噬菌斑增大，因此提供了有益修饰人-牛嵌合RSV疫苗候选株的表型的其他方法。
部分或完整BRSV背景基因组或反基因组与来自HRSV的异源基因或基因组区段结合成的嵌合牛-人RSV可掺入来自HRSVA或B亚型、来自HRSVA和B亚型或者来自一种或多种特异性HRSV病毒株的异源基因或基因组区段。在本发明中作例证的HRSV病毒株包括熟知的RSVA2和Long。在优选的方面，一个或多个HRSV糖蛋白基因F、G和SH或编码HRSV糖蛋白基因的胞质结构域、跨膜结构域、胞外结构域或免疫原性表位的基因组区段可替换BRSV背景基因组或反基因组内的对应基因或基因组区段。在其他实施方案中，一个或两个HRSV糖蛋白基因F和G替换BRSV背景基因组或反基因组中的一个或两个对应的F和G糖蛋白基因。在下文所述的具体实施例中，将来自HRSVLong的F基因替换到rBRSV病毒株ATue51908中替换对应的BRSVF基因的位置。在另一实施例中，两种HRSV病毒株A2的HRSV糖蛋白基因F和G都替换BRSVATue51908病毒株背景基因组或反基因组中对应的F和G糖蛋白基因。在其他实施方案中，本发明的嵌合人-牛RSV掺入来自一个以上RSV病毒株或亚型，例如两种人RSVA和B亚型的抗原决定基中。
因此，在上述引入的参考文献中提供的方法和组合物使得允许生产包含来自两种RSVA和B亚型之序列的减毒人-牛嵌合RSV疫苗病毒以产生RSVA或B疫苗或双价RSVA/B疫苗(参见例如1999年4月13日由Collins等提交的美国专利申请号09/291,894，在此引入作为参考)。在本发明中，人-牛嵌合RSV可含有编码HRSVA与HRSVB亚型的抗原决定基的多HRSV基因或基因组区段被导入的BRSV。然后通过按上述系统掺入减毒突变可将该病毒减毒至所需的水平。例如，已掺入至嵌合RSVA/B病毒中的具体减毒突变包括：(i)5种cp突变中的3种，即在N(V267I)和两个L(C319Y和H1690Y)中的突变，但在F中没有2个，因为通过用B1F基因替换除去了；(ii)已在减毒A2病毒株中鉴定的248(Q831L)、1030(Y1321N)以及任选的404-L(D1183E)突变；(iii)在M2基因的基因起始信号中的位置9的单一核苷酸替换，和(iv)SH基因的缺失。在携带RSVA和/或RSVB基因或基因组区段的人-牛嵌合RSV中其他可立即利用的突变，包括但不限于NS1、NS2、G或M2-2基因缺失，以及530和1009突变，可以是单独的或组合的。
在本发明的其他方面，用人-牛嵌合RSV作为异源病原体保护性抗原的“载体”，包括其他RSV和非RSV病毒和非病毒病原体。在这些方面内，牛-人嵌合基因组或反基因组含有部分或完整RSV“载体基因组或反基因组”，组合了一个或多个编码一种或多种异源病原体的一个或多个抗原决定基的异源基因或基因组区段(参见例如美国临时专利申请序列号60/170,195；美国专利申请号09/458,813；和美国专利申请号09/459,062，每篇文献在此引入作为参考)。在本发明中该异源病原体可以是异源RSV(例如不同RSV病毒株或亚型)，异源基因或基因组区段可选择编码一种或多种上述鉴定的RSV蛋白质以及其蛋白质结构域、片段和免疫原性区域或表位。由此构建的RSV载体疫苗可引发多特异性免疫反应并可同时施用或者与其他疫苗剂协同施用。
作为其他病原体载体改造的人-牛嵌合RSV可含有部分或完整HRSV基因组或反基因组的载体基因组或反基因组，它可与编码一种或多种异源RSV，包括选有HRSVA或HRSVB的异源HRSV的抗原决定基的一个或多个异源基因或基因组区段组合或经修饰后掺入其中。在其他方面，该载体基因组或反基因组是部分或完整HRSV基因组或反基因组，而且编码抗原决定基的异源基因或基因组区段是一种或多种非RSV病原体。通常，嵌合基因组或反基因组掺入具体说明减毒作用的一个或多个BRSV基因或基因组区段。或者，该载体病毒可包括掺入一个或多个HRSV基因或基因组区段的部分或完整BRSV背景基因组或反基因组，其中对该人-牛嵌合RSV载体进行修饰以包括编码非RSV病原体之抗原决定基的一个或多个供体基因或基因组区段。
因此，在本发明的特定详细的方面，提供人-牛嵌合RSV作为各种非-RSV病原体的载体(参见例如美国临时专利申请序列号60/170,195；美国专利申请号09/458,813；以及美国专利申请号09/459,062，分别在此引入作为参考)。用于本发明这些方面的载体基因组或反基因组可含有分别掺入异源HRSV或BRSV基因或基因组区段的部分或完整BRSV或HRSV基因组或反基因组，而且该异源病原体可选自麻疹病毒、A和B亚型呼吸道合胞病毒、HPIV1、HPIV2、HPIV3流行性腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、1型和2型人免疫缺陷型病毒、单纯性疱疹病毒、巨细胞病毒病毒、狂犬病病毒、EB病毒、线状病毒、布尼亚病毒、黄热病病毒、虫传病毒和流感病毒。
例如，用于构建本发明牛—人嵌合RSV的HRSV或BRSV载体基因组或反基因组可掺入选自麻疹病毒HA和F蛋白质或其抗原结构域、片段或表位的异源抗原决定基。在作例证实施方案中，含麻疹病毒HA的读码框(ORF)的转录单位被加入或掺入到BRSV或HRSV3载体基因组或反基因组中。或者可用本发明的牛-人嵌合RSV作为载体以掺入来自副流感病毒(PIV)的异源抗原决定基，例如通过掺入编码HPIV1、HPIV2、或HPIV3HN或F糖蛋白或其免疫原性结构域或表位的一个或多个基因或基因组区段。
导入异源免疫原性蛋白、结构域和表位以产生嵌合RSV对于在所免疫的宿主中产生新型免疫反应特别有用。将来自一供体RSV亚型或病毒株的免疫原性基因或基因组区段加入或替换至不同RSV亚型或病毒株的受体基因组或反基因组内可产生针对抗供体亚型或病毒株、受体亚型或病毒株或者供体和受体亚型或病毒株的免疫反应。为了达到该目的，还可构建人-牛嵌合RSV，该嵌合RSV表达嵌合蛋白，例如具有对融合了不同RSV胞外结构域的RSV特异性的胞质尾和/或跨膜结构域的免疫原性糖蛋白以提供例如人-牛融合蛋白或者掺入了来自两种人RSV亚型或病毒的结构域的融合蛋白。在一优选的实施方案中，人-牛嵌合RSV基因组或反基因组编码具有人和牛糖蛋白结构域或免疫原性表位的重组病毒或亚病毒颗粒中的嵌合糖蛋白。例如，可将编码人RSVF、SH或G糖蛋白的糖蛋白胞外结构域的异源基因组区段与编码相应牛F、SH或G糖蛋白胞质和内结构域的多核苷酸序列(即基因组区段)相连以形成人-牛嵌合RSV基因组或反基因组。
在其他实施方案中，可方便地修饰用于疫苗制剂的人-牛嵌合RSV以在循环病毒中容纳抗原漂移。通常该修饰将在G和/或F蛋白中。来自一RSV病毒株，完整G或F基因或编码特定免疫原性区域的其基因组区段通过替换不同RSV病毒株或亚型之受体克隆中的相应区域，或者通过增加一个或多个拷贝的所述基因而被掺入嵌合RSV基因组或反基因组中，以便代表数种抗原形式。从修饰的RSV克隆产生的子代病毒可用在抗新出现的RSV病毒株的接种疫苗方案中。
本发明的各种其他实施方案包括将目的供体基因的一部分加入或替换到受体基因组或反基因组中。通常，非编码核苷酸例如顺式作用调节元件和基因间序列不需要与供体基因编码区一起转移。因此，可将特定基因的编码序列(例如部分或完整读码框(ORF))加入或替换至在与供体序列相比对应基因或不同基因之异源启动子(例如存在于背景基因组或反基因组中的启动子)控制下的部分或完整背景基因组或反基因组中。各种其他基因组区段为包含在嵌合基因组或反基因组内提供有用的供体多核苷酸以表达具有新型有用特性的嵌合RSV。例如，异源基因组区段可编码来自人或牛RSV的所选蛋白质的部分或全部糖蛋白胞质尾区，跨膜结构域或胞外结构域、表位位点或区域、结合位点或含结合位点的区域、活性位点或含活性位点的区域等。可将这些或其他基因组区段加至完整背景基因组或反基因组中或在此替换为对应的基因组区段以产生新型嵌合RSV重组体。特定重组体将表达嵌合蛋白，例如具有与另一RSV的胞外结构域融合的一种RSV的胞质尾和/或跨膜结构域的蛋白。
根据本发明的一个方面，通过用异源基因或基因组区段替换在部分RSV背景基因组或反基因组中的对应基因或基因组区段来构建人-牛嵌合RSV。或者，可将异源基因或基因组区段作为额外基因或基因组区段与完整(如果另一基因或基因组区段缺失，则部分)RSV背景基因组或反基因组组合一起加入。可将该异源基因或基因组区段加入至部分或完整RSV背景基因组或反基因组内的基因间位置以便不会破坏背景基因组或反基因组内的读码框。
可在相对于部分或完整RSV背景基因组或反基因组内对应基因或基因组区段的野生型基因顺序位置加入或替换异源基因或基因组区段，由此取代或替换对应的基因或基因组区段(例如至距启动子更远的位置)。在另外实施方案中，可在与背景基因组或反基因组内对应基因或基因组区段的野生型基因顺序位置相比距启动子更近或距启动子更远的位置加入或替换异源基因或基因组区段，这样分别会提高或降低该异源基因或基因组区段的表达。
就基因顺序而言，前述引入的大量参考文献集中于RSV和其他病毒中天然发生的顺序修饰。例如，在RSV中，逐个缺失NS1、NS2、SH和G基因，和NS1和NS2基因一起缺失，由此移动下游各基因相对于病毒启动子的位置。例如，当NS1和NS2基因一起缺失时，N就从位置3移到位置1，P从位置4移到位置2等。或者，缺失该基因顺序内的任何其他基因将会仅影响位于更下游之那些基因的位置(相对于启动子)。例如，SH在野生型病毒中占据位置6，其缺失不会在位置5的M(或任何其他上游基因)，但使G相对于启动子从位置7移动到位置6。应注意基因缺失还可发生(罕见)在生物学衍生的突变病毒中。例如，在细胞培养中已广泛传代的B亚型RSV自发缺失SH和G基因(Karron等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：13961-13966，1997；在此引入作为参考)。注意“上游”和“下游”分别指距启动子近和距启动子远的方向(启动子在负义基因组RNA3’前导末端)。
用本发明人-牛嵌合RSV的基因顺序移动修饰(即在重组病毒基因组中将一个或多个基因移向更靠近启动子或更远离启动子位置的位置修饰)导致产生具有改变的生物学特性的病毒。例如已表明缺失NS1、NS2、SH、G，NS1和NS2一起缺失，或SH和G一起缺失的RSV在体外、体内或者体内外是减毒的。这种表型可能主要是由于特异性的病毒蛋白表达丢失。但是，改变的基因图谱也可能有助于所观察的表型。用SH-缺失病毒可以很好地说明该效应，在某些细胞中该病毒比野生型生长得更有效，可能是由于基因缺失和基因顺序发生改变以及可能是由于基因组大小改变而引起转录、复制或两者的增加。在其他病毒中，例如其中缺失NS1和/或NS2的RSV中，由于基因顺序可能的改变而发生的改变的生长因RSV蛋白质表达丢失而被更显著的表型遮掩了。
导入其他改变以改变RSV的基因顺序，从而致力于提高其作为活减毒疫苗的特性。(参见美国临时专利申请，其题目为从靠近启动子的基因表达保护性抗原的呼吸道合胞病毒疫苗，2000年6月23日由Krempl提交，identifiedbyAttorneyDocketNumber015280-424000US，在此引入作为参考)。具体地说，各自和串联地将G和F基因移动到相对于其野生型基因顺序更靠近启动子的位置。这两个蛋白质正常在RSV基因顺序中占据位置7(G)和8(F)(NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L)。为了提高成功回收的可能性，用其中已缺失SH基因的RSV版本进行操作(Whitehead等，J.Virol.，73：3438-42(1999)，在此引入作为参考)。因为该病毒在体外产生更大的噬菌斑，所以这样做有利于回收(Bukreyev等，J.Virol.，71：8973-82(1997)，在此引入作为参考)。然后将G和F逐个分别移到位置1，或者一起移到位置1和2。
令人惊奇的是，其中将G或F移到位置1，或者其中将G和F分别移到位置1和2的重组RSV很容易回收。该结果与以前用VSV进行的研究有很大不同，单个VSV糖蛋白基因仅有2个位置的移动对病毒生长非常有害。回收这些改变的病毒的能力也是令人吃惊的，因为RSV无效率地复制，还因为RSV有复杂的基因顺序，并且糖蛋白基因的移动涉及大量位置的改变。确实，重排RSV亲本生长与它们具有野生型基因顺序的直接亲本至少一样好。如上所述，这对于RSV特别重要，因为野生型病毒在细胞培养中无效率生长，并且在体外复制的进一步减少可能会使疫苗制品不可行。因此，明显的是所有NS1-NS2-N-P-M蛋白可由相对于启动子的一个或两个位置替换而不会显著降低生长适应性。另外，检测G糖蛋白的表达表明比其亲本病毒G糖蛋白提高到数倍。这显示在第一个位置含G和/或F的疫苗病毒表达比其他病毒蛋白表达更高摩尔量的保护性抗原，因此代表了具有所需疫苗特性的病毒。
用其中在其本身缺失NS2基因，或者其中一起缺失NS1和NS2基因的两个高度减毒的疫苗候选株在基因顺序中可获得类似的广泛的修饰。在这两者疫苗候选株中，将G和F糖蛋白一起分别移到位置1和2，从其源下游位置缺失G、F和SH糖蛋白。因此，回收的病毒G1F2ΔNS2ΔSH和G1F2/ΔNS1ΔNS2ΔSH除了G和F基因的移动外，分别还有2和3个基因的缺失。为了说明所涉及改变的程度，比较野生型RSV(NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L)和G1F2/ΔNS2ΔSH病毒(G-F-NS1-N-P-M-M2-L)或ΔNS1ΔNS2ΔSH(G-F-N-P-M-M2-L)的基因顺序。这表明相对于启动子大多数或所有基因的位置都被改变。然而，这些高度减毒的衍生物仍保留了在细胞培养中生长的能力。
下列实施例提供感染性重组人-牛嵌合RSV(rBRSV/HRSV)的作例证构建，其中将HRSVG和F基因替换到重组牛RSV(rBRSV)背景中。所得的人-牛嵌合体含两个HRSV基因，即G和F，和8个BRSV基因，即NS1、NS2、N、P、M、SH、M2和L。
除这种基本替换的糖蛋白构建外，即相对于F和G基因在RSV基因组中的野生型基因顺序位置，将HRSVG和F基因移到rBRSV骨架中更靠近启动子的位置。更具体地说，将F和G基因从其相对于启动子的通常位置即位置7和8分别移到位置1和2。
所得的嵌合重组病毒rBRSV/A2-G1F2在由免疫荧光检测的F和G蛋白质表达水平与野生型HRSV的很相似，该结果与由于基因向靠近启动子的方向移动而导致的G和F糖蛋白的表达增加一致。由于本发明的rBRSV/A2-G1F2病毒在其遗传背景中携带相同的BRSV基因构象，因此它可能共享这种强宿主范围限制表型。在本发明中，这两种保护性抗原体内表达的增加将会提高该病毒的免疫原性以产生非常令人满意的疫苗特性。
为了构建嵌合RSV，可将异源基因全部或部分加入或替换到背景基因组或反基因组中。在通过替换产生嵌合体的情况下，用编码来自人或牛RSV的蛋白质或蛋白质区域(例如胞质尾、跨膜结构域或胞外结构域、表位位点或区域、结合位点或区域、活性位点或含活性位点的区域等)的所选基因或基因组区段替换在背景RSV基因组或反基因组中的对应基因或基因组区段以产生与一种或两种各自的野生型(或突变亲本)RSV病毒株相比具有所需表型的改变的新重组体。如本文所用，″对应″基因或基因组区段指来自不同RSV的对应多核苷酸，该多核苷酸编码同源或等同蛋白质或蛋白质区域、表位或氨基酸残基，或者″对应″基因或基因组区段代表可包括但不限于不同RSV亚型或病毒株间的种和等位基因变体的同源或等同顺式作用信号。
人和牛病毒株具有相同的基因图谱并编码基本相同的mRNA和蛋白质构象。例如，每种都有编码NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2-1、M2-2和L蛋白质的ORF。所选人和牛蛋白质间的氨基酸同一性百分比为：NS1(69％)、NS2(84％)、N(93％)、P(81％)、M(89％)、SH(38％)、G(30％)、F(18％)、M2-1(80％)、L(77％)。因此，总之，在这两种病毒的基因和基因组区段间有清楚的辨别对应性，因此替换、转移和插入的设计直接了当。
牛和人RSV间的对应残基位置可以不同、相同或者因保守氨基酸取代而有所区别。保守氨基酸取代指具有相似侧链的残基相互替换。例如，具有脂肪族侧链的保守氨基酸组为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族一羟基侧链的一组氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸为天门冬酰胺和谷酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替换组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷酰胺。这20种常规氨基酸、非天然氨基酸例如α，α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸的立体异构体也适宜作为本发明多肽的组分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟脯氨酸、γ-羰基谷氨酸盐、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、ω-N-甲基精氨酸和其他氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。此外可通过糖基化、磷酸化等修饰氨基酸。
本发明采用以cDNA为基础的方法来构建各种重组体、人-牛嵌合RSV病毒和亚病毒颗粒。这些重组RSV为用作疫苗剂提供了改善的减毒特征和免疫原性。被改造到人-牛嵌合RSV中的所需表型改变包括，但不限于在培养或所选的宿主环境中减毒、对减毒表型回复的抗性、提高的免疫原性特征(例如通过所引发的免疫反应的提高、或减低确定的)、所选病毒产物的转录和/或翻译的上调或下调等。在本发明优选的方面，生产减毒人-牛嵌合RSV，其中通过导入一个或多个具体说明减毒表型的减毒突变而进一步修饰嵌合基因组或反基因组。可如上引入的参考文献所述的常规设计诱变策略重新产生这些突变并检测其减毒效果。或者，可在生物学衍生的突变RSV中鉴定减毒突变，然后掺入本发明的人-牛嵌合RSV中。
″生物学衍生的RSV″指非通过重组方法产生的任何RSV。因此，生物学衍生的RSV包括天然产生的RSV的所有亚型和病毒株，包括，例如具有野生型基因组序列的自然产生的RSV和具有来自参考野生型RSV序列的基因组变体的RSV，例如具有说明减毒表型的突变RSV。同样，生物学衍生的RSV包括尤其通过人工诱变和筛选过程衍生自亲本RSV病毒株的RSV突变体。
为了生物学衍生的病毒株生产令人满意的减毒RSV，优选将突变导入已不完全或部分减毒的亲本病毒株中，例如熟知的RSVA亚型的A2病毒株的ts-1或ts-1NG或cpRSV突变体或其衍生物或亚克隆。用这些和其他部分减毒的病毒株，还可产生进一步使病毒株减毒的另外突变，例如在哺乳动物宿主中达到所需的限制复制水平，同时保留足够的免疫原性以在疫苗中赋予保护作用。
生产A或B亚型病毒的部分减毒突变体，即在可接受的细胞底物中，通过熟知的生物学方法克隆野生型病毒并开发例如其冷传代突变体，将该病毒经化学诱变以产生ts突变体，或者筛选小噬菌斑或类似表型的突变体(参见例如，Murphy等，国际公开号WO93/21310，在此引入作为参考)。对于B亚型病毒，一个作例证的部分减毒的亲本病毒是cp23，它是B亚型的B1病毒株的突变体。
可结合各种已知的筛选技术从非减毒A或B亚型病毒株中产生部分减毒的突变体，这些突变体如本文所述用于进一步衍生。此外，具体说明减毒表型的突变可被逐个导入或组合导入到不完全减毒的A或B亚型病毒中以产生具有多种定义的减毒突变的疫苗病毒，这种减毒突变赋予疫苗所需的减毒水平和免疫原性。
如上所述，用多种已知方法可实现生产充分减毒的生物学衍生的RSV突变体。一种方法涉及在渐低的减毒温度下使部分减毒的病毒在细胞培养中传代。例如，通常在约34-37℃培养野生型病毒，而在次最适温度，例如20-26℃通过在细胞物(例如初级牛肾细胞)中传代产生部分减毒的突变体。因此，cp突变体或其他部分减毒的病毒株，例如ts-1或spRSV通过在MRC-5或Vero细胞中传代，在低至约20-24℃，优选20-22℃的温度下仍能适应且有效生长。与部分减毒亲本相比，在冷传代过程中这种筛选突变RSV基本上降低了在衍生病毒株中的任何残留毒力。
或者，能将特异性突变导入到生物学衍生的RSV中，即对部分减毒的亲本病毒进行化学诱变，例如以导入ts突变，或者在已是ts病毒的情况下，导入另一个ts突变足以赋予提高减毒衍生物ts表型的减毒作用和/或稳定性。将ts突变导入RSV的方法包括：在存在诱变剂例如5-氟尿苷或5-尿嘧啶浓度为约10-3-10-5M，优选约10-4M时的复制病毒，按照例如在(Gharpure等，J.Virol.3：414-421，1969和Richardson等，J.Med.Virol.3：91-100，1978)中所述的一般方法将病毒暴露于浓度为约100μg/ml亚硝基胍，或者遗传导入特异性的ts突变。也可使用其他化学诱变剂。减毒作用可产生于在几乎所有RSV基因中的ts突变，尽管已发现为此目的一个特别修正的靶为聚合酶(L)基因。
在本发明内所用的作例证的减毒RSV中，复制的温度敏感性水平是通过比较其在可允许温度的复制与其在多种限制性温度的复制而确定。与其在可允许温度的复制相比，病毒复制降低100倍或更多的最低温度称为关闭温度。在试验动物和人中，RSV的复制和毒力与突变体的关闭温度有关。关闭温度为39℃之突变体的复制是中度受限制的，而关闭温度为38℃突变体复制更差，并且疾病症状主要限于上呼吸道。关闭温度为35℃-37℃的病毒通常在黑猩猩中是完全减毒的，而在人中是基本上减毒的。因此，减毒的生物学衍生突变体和本发明ts人-牛嵌合RSV的关闭温度将在约35℃-39℃范围，优选35℃-38℃。将ts突变加入到部分减毒的菌株中产生可用于本发明疫苗组合物的多减毒病毒。
采用多轮化学诱变将多突变导入病毒中，该病毒已在冷传代过程中减毒，已开发出许多用于鼻内给药的作为候选疫苗的减毒RSV(例如，Connors等，Virology208：478-484，1995；Crowe等，Vaccine12：691-699，1994；以及Crowe等，Vaccine12：783-790，1994，在此引入作为参考)。用成年和幼啮齿动物、黑猩猩评估表明这些候选疫苗菌株中的某些菌株遗传相对稳定、高度免疫原性、减毒令人满意。对这些减毒病毒中的一部分进行核苷酸序列分析表明各提高的减毒水平与特异核苷酸和氨基酸替换有关。上述引入的参考文献也公开了通过单独和以各种组合将突变导入在感染性RSV克隆的基因组或反基因组中如何常规区分沉默突变与负责表型差异突变。该方法与评估亲本和衍生病毒的表型特征相结合鉴定突变体，这些突变体负责所需特征如减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬菌斑、宿主范围限制等。
将由此鉴定的突变编入″菜单″，然后按需要单独或组合导入以校正人-牛嵌合RSV疫苗病毒达到适宜的减毒水平、免疫原性、对从减毒表型回复的遗传抗性等。优选地，本发明的嵌合RSV通过掺入至少一个和多个，优选2个或多个从所述菜单中鉴定的减毒突变而得到减毒，这些突变体可定义为一组生物学衍生突变RSV菌株中的一组已知突变。本文所述的优选突变RSV菌株组是冷传代的(cp)和/或温度敏感性(ts)突变体，例如一组包含RSV突变体命名为cptsRSV248(ATCCVR2450)、cptsRSV248/404(ATCCVR2454)、cptsRSV248/955(ATCCVR2453)、cptsRSV530(ATCCVR2452)、cptsRSV530/1009(ATCCVR2451)、cptsRSV530/1030(ATCCVR2455)、RSVB-1cp52/2B5(ATCCVR2542)和RSVB-1cp-23(ATCCVR2579)(根据布达佩斯条约，分别保藏在美国10801UniversityBoulevard，Manassas，Virginia20110-2209的美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并授与上述保藏号)。
从该作例证的一组生物学衍生的突变体中，提供了可与组内任何其他突变组合的减毒突变的大菜单以校正用作疫苗的重组人-牛嵌合RSV中的减毒水平。另一些突变可衍生自具有非ts和非-cp减毒突变的RSV，如在例如小噬菌斑(sp)、冷适应的(ca)或宿主范围限制的(hr)突变体菌株中鉴定的突变体。可在供体或受体RSV基因的编码区或非编码区例如顺式调节序列中选择突变体。例如，减毒突变可包括基因起始序列中的单或多碱基改变，例如在M2基因起始序列中核苷酸7605的单或多碱基替换。
设计并筛选用于疫苗的人-bovine嵌合RSV常常含有至少2个，有时3个或多个减毒突变以达到令人满意的减毒水平用于广泛的临床。在一个实施方案中，至少一个减毒突变发生在RSV聚合酶基因(在供体或受体基因)中，并涉及核苷酸替换，核苷酸替换决定聚合酶蛋白中氨基酸改变，氨基酸改变又体现温度敏感型(ts)表型。在本发明中，作例证的人-牛嵌合RSV在大聚合酶基因L中掺入一个或多个核苷酸替换，从而在氨基酸Asn43、Phe521、Gln831、Metl169或Tyrl321产生氨基酸改变，如变化所例证的Leu替换Phe521、Leu替换Gln831、Val替换Metl169以及Asn替换Tyrl321。或者或另外，本发明的嵌合RSV在不同RSV基因，例如M2基因中掺入ts突变。优选地，将2个或多个核苷酸改变掺入到说明减毒突变的密码子中，例如具体说明ts突变的密码子，由此降低从减毒表型回复的可能性。
根据本发明方法，人-牛嵌合RSV很容易构建并表征为掺入至少1个最多达全部存在于一组生物学衍生突变RSV菌株中的减毒突变。因此，可以以任何组合从所选突变体组中组装突变，例如cptsRSV248(ATCCVR2450)、cptsRSV248/404(ATCCVR2454)、cptsRSV248/955(ATCCVR2453)、cptsRSV530(ATCCVR2452)、cptsRSV530/1009(ATCCVR2451)、cptsRSV530/1030(ATCCVR2455)、RSVB-1cp52/2B5(ATCCVR2542)和RSVB-1cp-23(ATCCVR2579)。用这种方法，可细致地校正嵌合疫苗候选株的减毒作用以便用于一类或多类患者，包括血清反应阴性婴儿。
在更具体的实施方案中，用于疫苗的人-牛嵌合RSV掺入至少一个最多达全部减毒突变体，这些减毒突变体具体说明了在RSV聚合酶基因L内Asn43、Phe521、Gln831、Metl169或Tyrl321温度敏感型和/或减毒氨基酸替换，或者在M2基因的基因起始序列中的温度敏感型核苷酸替换。或者，或另外所要求的嵌合RSV可掺入至少1个最多达全部来自冷传代减毒RSV的突变体，例如表明在RSVN基因中Val267、RSVF基因中Glu218或Thr523、RSV聚合酶基因L中Cys319或His1690氨基酸替换的一个或多个突变。
在其他详细的实施方案中，进一步修饰本发明的人-牛嵌合RSV以掺入选自下列的减毒突变：(i)表明在RSV聚合酶基因L中温度敏感型氨基酸替换Gln831到Leu、Tyrl321到Asn的一组突变；(ii)在M2基因的基因起始序列中的温度敏感型核苷酸替换；(iii)采纳自冷传代RSV具体说明RSVN基因中Val267Ile和RSV聚合酶基因L中Cys319Tyr与His1690Tyr的一组减毒突变；或者(iv)缺失或除去一个或多个RSVSH、NS1、NS2、G和M2-2基因的表达。优选地，这些和其他人-牛嵌合RSV例子掺入采自生物学衍生的突变RSV的至少2个减毒突变，这种减毒突变可衍生自相同或不同的生物学衍生的突变RSV菌株。另外优选地，这些作例证突变体含有一个或多个通过在表明突变的密码子中的多核苷酸改变而稳定的减毒突变。
根据前文描述，从cDNA产生感染性RSV的能力使得可以在人-牛嵌合RSV中导入具体加工的改变。具体地说，将感染性的重组RSV用于鉴定生物学衍生的减毒RSV菌株中的特异性突变，例如表明ts、ca、att和其他表型的突变。由此鉴定所需突变，然后导入重组人-牛嵌合RSV疫苗菌株。从cDNA生产病毒的能力使得可常规将这些突变，单独或以各种所选组合掺入到全长cDNA克隆中，然后，很容易确定含所导入突变的拯救重组病毒的表型。
除单和多点突变以及位点特异性突变外，对本文所公开人-牛嵌合RSV的改变包括全部基因或基因组区段的缺失、插入、替换或重排。这些突变可改变供体或受体基因组或反基因组中的少量碱基，(例如从15-30个碱基，最多为35-50个碱基或更多)，大块核苷酸(例如50-100、100-300、300-500、500-1,000个碱基)或几乎完整或完整基因(例如，1,000-1,500个核苷酸，1,500-2,500个核苷酸，2,500-5,000个核苷酸，5,00-6,5000个核苷酸或更多)，这取决于改变的性质(即可改变少量碱基以插入或除去免疫原性表位或者改变小基因组区段，而当加入、替换、缺失或重排基因或大基因组区段时，就需涉及大块碱基)。
因此，除采用自生物学衍生的RSV突变体的减毒突变体外或与该突变组合，本发明还提供基于感染性RSV克隆的重组加工用于减毒或修饰人-牛嵌合RSV表型一系列其他方法。在编码供体基因或基因组区段或者背景基因组或反基因组的分离的多核苷酸序列中产生各种改变以掺入到感染性克隆中。更具体地说，为了在嵌合RSV中获得所需的结构和表型改变，本发明可以导入缺失、替换、导入或重排来自亲本嵌合基因组或反基因组的所选核苷酸或多数核苷酸的修饰，以及缺失、替换、导入或重排人-牛嵌合RSV克隆内完整基因或基因组区段的突变。
通常筛选感染性人-牛嵌合RSV的所需修饰来说明所需的表型改变，例如病毒生长、温度敏感型、引发宿主免疫反应的能力、减毒作用等方面的改变。这些改变通过例如诱变亲本RSV克隆以除去、导入或重排特异性基因或基因组区段(例如编码蛋白质结构域，例如胞质、跨膜或细胞外结构域、免疫原性表位、结合区域、活性位点等或顺式作用信号的基因组区段)发生在供体或受体基因组或反基因组中。就此而言，目的基因包括RSV基因组的所有基因：3′-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M21/M2-2-L-5′以及来自本文所述其他RSV、其他病毒和各种其他非RSV的异源基因。
还提供了在人-牛嵌合RSV中的修饰，这些修饰简单地改变或除去所选基因的表达，例如通过将终止密码子导入所选RSV编码序列、改变RSV基因相对于操作相连的启动子的位置、导入上游起始密码子以改变表达率、修饰(例如通过改变位置、改变现有序列或用异源序列替换现有序列)GS和/或GE转录信号以改变表型(例如对转录的生长、温度限制等)以及在病毒复制、所选基因的转录或所选蛋白质的翻译中说明定量或定性变化的各种其他缺失、替换、加入和重排。
分析和在人-牛嵌合RSV中掺入其他类型减毒突变用于疫苗开发的能力扩大了RSV克隆中靶改变的组合。例如，缺失SH基因产生具有新表型特征包括生长能力提高的重组RSV。在本发明中，在嵌合RSV中缺失SH、NS1或NS2基因(或任何其他所选的非必需基因或基因组区段)，该嵌合体还可含有一个或多个说明减毒表型的另一些突变，例一个或多个采纳自生物学衍生的减毒RSV突变体的突变。在作例证的实施方案中，缺失SH、NS1或NS2基因和一个或多个采纳自cpts248/404、cpts530/1009、cpts530/1030或另一所选突变RSV菌株的cp和/或ts突变相组合，以由于不同突变的组合作用产生具有病毒产率提高、减毒作用增强和抗表型回复的重组RSV。
对生长非必需的任何RSV基因，例如SH、NS1、NS2或M2-2基因在嵌合RSV中可除去或修饰以对毒力、致病性、免疫原性和其他表型特征产生所需的影响。例如，缺失通过去除非必需基因例如SH导致在培养中病毒生长提高。不希望受理论的束缚，这种效应可能部分是由于病毒基因组的核苷酸长度减小造成的。在一作例证SH(-)克隆的情况下，修饰的病毒基因组为14，825个核苷酸长，比野生型少398个核苷酸。通过例如在RSV基因组的其他编码或非编码区，例如P、M、F和M2基因中降低基因组大小的类似突变改造，本发明提供了多种容易获得的用于改善嵌合RSV生长的方法和材料。
另外，在RSV基因组或反基因组中可产生各种其他遗传改变以单独或与一个或多个采纳自生物学衍生的突变RSV的减毒突变一起掺入感染性人-牛嵌合RSV中。还可将异源基因和基因组区段(例如来自不同RSV基因、不同RSV菌株或类型，或者非-RSV源)全部或部分插入，改变基因的顺序，除去基因重叠，用其反基因组对应物替换RSV基因组启动子，除去或替换部分基因，甚至缺失全部基因。可在序列中进行不同或另外的修饰以便于操作，例如在各种基因间区域或别处插入特有的限制位点。可除去非翻译的基因序列以提高插入外源序列的能力。
本发明还提供了在人bovine嵌合RSV中的遗传修饰，该修饰改变或除去了所选基因或基因组区段的表达而不会从嵌合RSV克隆中除去基因或基因组区段。例如，通过在所选的编码序列内导入框移突变或终止密码子、改变基因的位置或导入上游起始密码子以改变其表达率或者改变GS和/或GE转录信号以改变表型(例如对转录的生子、温度限制等)可以达到上述目的。在一所述实施例中，剔除M2-2ORF的表达，这样产生用于开发疫苗病毒的非常合乎要求的表型改变，包括改变生长动力学、减少RNA复制以及提高转录。因此，M2-2剔除表现出显著的减毒作用同时提高，而不是降低了抗原表达。
在本发明更详细的方面，提供人-牛嵌合RSV，其中例如通过将两个串联翻译终止密码子导入翻译读码框(ORF)中而在翻译水平除去NS2基因的表达而不缺失该基因或其片段。这样产生活的病毒，其中在翻译水平已使所选基因沉默而没有缺失该基因。这些形式的剔除病毒在组织培养中常常表现出生长率降低以及产生小噬菌斑。因此，这些方法提供了另一些的新的减毒突变类型，其去除非主要病毒保护性抗原之一的病毒基因的表达。在本发明中，不缺失基因或基因组区段而产生的剔除病毒表型还可按本文所述通过缺失诱变而选择性地产生以便有效地排除可恢复靶蛋白合成的更正突变。用本领域熟知的其他设计和方法(例如，描述于(Kretschmer等，Virology216：309-316，1996；Radicle等，Virology217：418-412，1996；和Kato等，EMBOSSJ.16：178-587，1987；和Schneider等，Virology277：314-322，1996，分别在此引入作为参考)可制备人-牛嵌合RSV的几种其他基因剔除。
用于掺入本发明人-牛嵌合RSV的其他突变包括针对顺式作用信号的突变，这可例如通过RSV小基因组的突变分析来鉴定。例如，前导和尾序列及侧序列的插入和缺失分析可鉴定病毒启动子和转录信号，并提供一系列与不同程度RNA复制或转录降低有关的突变。这些顺式作用信号的饱和诱变(由此按顺序再将每个位置修饰成各核苷酸选择对象)已鉴定了许多可降低(或在一种情况下提高)RNA复制或转录的突变。可将这些突变中的任何突变插入到本文所述的人-牛嵌合RSV反基因组或基因组中。用完整反基因组cDNA评估和操作反式作用蛋白质和顺式作用RNA序列是利用RSV小基因组协助的(参见例如，Grosfeld等，J.Virol.69：5677-5686，1995，在此引入作为参考)，其辅助依赖性状态在表征那些抑制性太强而不能回收复制一独立感染性病毒的突变体时是有用的。
人-牛嵌合RSV内的其他突变涉及用反基因组的其对应物替换基因组的3′末端，其与RNA复制和转录中的改变有关。另外，可将基因间区域(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：4594-4598，1986，在此引入作为参考)缩短或延长或者改变序列成分，以及通过本文所述方法可将天然产生的基因重叠(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5134-5138，1987，在此引入作为参考)除去或改变成不同的基因间区域。在一作例证的实施方案中，通过用已被合成和设计为与有效翻译相一致的序列替换天然序列可提高特异性RSV蛋白质，例如保护性F和G抗原的表达水平。就此而言，已表明在哺乳动物病毒蛋白质的翻译水平，密码子的使用是主要因素(Haas等，CurrentBiol.6：315-324，1996，在此引入作为参考)。检查编码RSVF和G蛋白的mRNA的密码子使用表明这种使用符合低水平表达，RSVF和G蛋白是主要的保护性抗原。因此，通过本发明重组方法可改善密码子使用以获得所选基因改善的表达。在另一作例证实施方案中，修饰所选择RSV基因的翻译起始位点周围的序列(优选包括在-3位置的核苷酸)，单独或一起组合导入上游起始密码子，以通过说明翻译上调或下调调节嵌合RSV基因的表达。
或者，与本文公开的其他RSV修饰一起，通过改变所选病毒基因的转录GS信号可调节人-牛嵌合RSV基因的表达。在一作例证的实施方案中，修饰NS2的GS信号以包括确定的突变(例如下文所述的404(M2)突变)，从而在病毒复制上附加一ts限制。
在可选择的实施方案中，在转录水平修饰人-牛嵌合RSV中的基因表达水平。在一方面，可将RSV基因图谱中所选基因的位置移动到靠近或远离启动子的位置，由此使基因表达分别更有效或效率更低。根据该方面，与通常通过同步降低相互位置替换基因的表达水平所达到的野生型水平相比，调节特定基因的表达能获得产生基因表达降低或提高2倍，更典型为4倍，最多达10倍或更多倍。在一实施例中，在SH基因(顺序为第六)的位置替换NS2基因(在RSV基因图谱中的顺序为第二)，NS2的表达水平按照预期降低。在其他作例证实施方案中，将F和G基因单独或一起互换位置至嵌合RSV基因图谱内更靠近启动子或更远离启动子的位点以便分别获得较高或较低水平的基因表达。这些和其他相互位置改变产生具有减毒表型新的嵌合RSV克隆，例如由于与RNA复制有关的所选病毒蛋白的表达水平降低或具有其他合乎需要的特征例如抗原表达提高。
还可按照本发明公开的方法和组合物加工本发明的感染性人-牛嵌合RSV克隆以便与用野生型RSV或亲本嵌合RSV感染所提供的相比，免疫原性和引导的保护水平都有所提高。例如，可将来自异源RSV菌株或类型或者来自非RSV源例如PIV的免疫原性表位通过在编码嵌合基因组或反基因组的多核苷酸序列中的适宜的核苷酸改变加到嵌合克隆中。或者可加工嵌合RSV以便加入或切除(例如通过氨基酸插入、替换或缺失)免疫原性蛋白、蛋白结构域或者与所需或不需免疫学反应有关的特异性蛋白形式(例如分泌形式的G)。
在本发明方法中，可将其他基因或基因组区段插入或靠近人-牛嵌合RSV基因组或反基因组。这些基因可在受体基因的普通控制下，或者可以在一组独立转录信号的控制下。目的基因包括上述鉴定的RSV基因以及非-RSV基因。目的非-RSV基因包括编码细胞因子(例如IL-2到IL-18，特别是IL-2、IL-6和IL-12、IL-18等)、γ干扰素和富集T辅助细胞表位的蛋白质的基因。可将这些其他蛋白质作为独立的蛋白质表达或者作为从一个RSV蛋白例如SH的第二拷贝加工的嵌合体表达。这提供了定量和定性修饰并改善抗RSV免疫反应的能力。
在本发明的作例证实施方案中，将外源基因或基因组区段，在某些情况下是非编码核苷酸序列插入人-牛嵌合RSV基因组会导致基因组长度增加而引起其他所需的表型效果。增加基因组长度会使所得RSV减毒，这部分取决于插入片段的长度。另外，从插入到人-牛嵌合RSV中的非RSV基因表达特定蛋白质，例如细胞因子将会因蛋白质的作用而使病毒减毒。产生感染性减毒病毒表型并从RSV转染细胞表达高水平细胞因子的作例证细胞因子包括白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、GM-CSF和γ干扰素。包括提高细胞和/或体液免疫反应的其他效果也将随细胞因子导入本发明人-牛嵌合RSV。
缺失、插入、替换以及涉及改变本发明人-牛嵌合RSV内完整病毒基因或基因组区段的其他突变将产生高度稳定的疫苗候选株，这在免疫抑制个体的情况下尤其重要。许多这样的改变将使所得疫苗病毒株减毒，而其他将表明不同类型的所需表型改变。例如辅助(即体外生长非必需的)基因是编码特异性干扰宿主免疫性之蛋白质的优秀候选基因(参见例如Kato等，EMBO.J.16：578-87，1997，在此引入作为参考)。预期在嵌合疫苗中切除这些基因会降低毒力和致病性和/或改善免疫原性。
在本发明的可选择方面，从cDNA-表达的基因组或反基因组产生的感染性人-牛嵌合RSV可以是任何RSV或RSV-样菌株，例如人、牛、鼠等，或者任何肺炎病毒，例如小鼠鸟肺炎病毒的肺炎病毒(以前称为火鸡鼻气管炎病毒)。为了产生保护性免疫反应，RSV菌株可以是对被免疫主体为内源性的一种，例如用人RSV免疫人。但是可修饰内源RSV的基因组或反基因组以便从不同源的组合，例如不同RSV种、亚型或菌株或者来自RSV与另一个呼吸病原体例如PIV的基因或基因组区段组合表达RSV基因或基因组区段。
在本发明的特定实施方案中，提供人-牛嵌合RSV，其中将人或牛RSV内的基因或基因组区段(例如人RSV背景基因组或反基因组)用来自非人非牛RSV，例如鼠RSV的对应异源基因或基因组区段替换。在本发明中，替换、缺失和加入RSV基因或基因组区段可包括部分或全部一个或多个NS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)和L基因，或优选在主要中和保护性表位外的部分G和F基因。另外，人或牛RSV顺式作用序列，例如启动子或转录信号也可用非人、非牛对应序列替换。因此，打算给人施用的感染性人-牛嵌合RSV可以是已被修饰而含有除牛RSV外来自还有鼠RSV基因的人RSV。
在本发明的其他实施方案中，在小鼠肺炎病毒(人RSV的鼠对应物)组织培养适应为缺乏G蛋白胞质尾的非致病菌株后(Randhawa等，Virology207：240-245，1995)，将用于导入人-牛嵌合RSV中的目的突变定型。因此，在本发明的一个方面，用异源对应序列(例如来自鼠肺炎病毒F、G或SH蛋白的胞质或跨膜结构域的序列)在嵌合RSV内加入、缺失、修饰或替换一个或多个人RSV糖蛋白F、G和SH的胞质和/或跨膜结构域以获得所需的减毒。作为另一实例，在F蛋白质切割位点或靠近该切割位点的核苷酸序列或者G蛋白质的推测粘附结构域，通过点突变、位点特异性改变或者通过涉及完整基因或基因组区段的改变进行修饰，以便在组织培养中的病毒生长和/或感染和致病性方面获得新的效果。
在本发明更详细的方面，用人-牛嵌合RSV作为其他病原体，特别是呼吸道病原体例如副流感病毒(PIV)的保护性抗原的载体。例如，可改造嵌合RSV，使其掺入编码PIV的保护性抗原的序列以产生感染性减毒疫苗病毒。PIVcDNA的克隆以及用于完成本发明这些和其他更详细方面的其他公开内容提供于美国专利申请号09/083,793(对应于国际公开号WO98/53078)及其优先权，美国临时申请序列号60/047,575；美国专利申请号09/350,821和美国专利申请号09/586,479及其优先权，美国临时申请序列号60/143,134，分别在此引入作为参考。这些公开内容包括可用于生产感染性PIV病毒克隆的下列质粒的描述：p3/7(131)(ATCC97990)；p3/7(131)2G(ATCC97989)和p218(131)(ATCC97991)，每个质粒均根据布达佩斯条约保藏在美国10801UniversityBoulevard，Manassas，Virginia20110-2209的美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并给出上述鉴定的保藏号。
根据本发明的该方面，提供人-牛嵌合RSV，其中含有牛和人RSV基因组或反基因组序列以及至少一个PIV序列的嵌合体，例如含牛和人RSV和PIV1、PIV2、PIV3或牛PIV之序列的多核苷酸。例如用来自人PIV的对应基因，如PIV1、PIV2或PIV3的F糖蛋白基因替换RSV的各个基因。或者，所选异源基因组区段，例如其胞质尾、跨膜结构域或胞外结构域替换在例如RSV中相同基因、RSV中不同基因的对应基因组区段，或者替换RSV基因组或反基因组的非编码序列。在一实施方案中，用来自HPIV3的F基因的基因组区段替换对应的人RSV基因组区段以产生编码嵌合蛋白的构建体，例如含有与RSV胞外结构域融合之RSV胞质尾和/或跨膜结构域的融合蛋白以产生新的减毒病毒，和/或免疫原性抗PIV和RSV的多价疫苗。PIVcDNA的克隆和其他用于完成本发明这些方面和其他更详细方面的其他公开内容提供于美国专利申请号09/083,793(对应于国际公开号WO98/53078)及其优先权，美国临时申请序列号60/047,575；美国专利申请号09/350,821和美国专利申请号09/586,479及其优先权，美国临时申请序列号60/143,134，分别在此引入作为参考。
因此可用本发明的人-牛嵌合RSV作为表达多种其他病原体之抗原决定基的载体。通常，用牛-人嵌合基因组或反基因组作为部分或完整RSV载体基因组或反基因组。掺入该载体基因组或反基因组中的是编码一个或多个异源病原体之抗原决定基的一个或多个异源基因或基因组区段。在特定的实施方案中，该异源病原体是异源RSV，而掺入在人-牛嵌合RSV载体基因组或反基因组中的异源基因或基因组区段编码一个或多个RSVNS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F或G蛋白或其片段。例如载体基因组或反基因组可包括部分或完整RSVA基因组或反基因组，编码抗原决定基的异源基因或基因组区段可以是RSVB亚型病毒的。
在其他可选择的实施方案中，用人-牛嵌合RSV作为表达非RSV病原体的一个或多个抗原决定基的载体。由此构建的嵌合载体病毒可表达RSV以及非RSV病原体的抗原决定基，或者可引发针对非RSV病原体的单特异性免疫反应。在一实施方案中，人-牛嵌合RSV掺入编码一个或多个HN和/或F糖蛋白或其抗原结构域、片段或表位的一个或多个HPIV1、HPIV2或HPIV3基因或基因组区段。在更详细的方面，将含HPIV2HN或F基因的读码框(ORF)的转录单位加入或掺入嵌合HBRSV载体基因组或反基因组中。
用作载体的人-牛嵌合RSV包括嵌合RSV，其中载体基因组或反基因组是部分或完整BRSV基因组或基因组区段，而编码抗原决定基的异源基因或基因组区段属于一个或多个HRSV。例如，部分或完整BRSV基因组或反基因组可掺入编码选自F、G和SH的一个或多个HRSV糖蛋白基因的一个或多个基因或基因组区段，或者掺入编码HRSV的F、G和/或SH的胞质结构域、跨膜结构域、胞外结构域或免疫原性表位部分的一个或多个基因组区段。
除对人-牛嵌合RSV的上述修饰外，可在RSV克隆中进行不同的或其他修饰以便有利于操作，例如在各种基因间区域或其他区域插入特有的限制位点(例如在G和F基因间的特有StuI位点)。可除去非翻译基因序列以提高插入外源序列的能力。
通过熟知的各种方法可将前述定义的突变导入感染性人-牛嵌合RSV克隆中。就DNA而言，″感染性克隆″指cDNA或其产物，可以是合成的或其他的，其能被转录成用作模板基因组或反基因组RNA以生产感染性病毒或亚病毒颗粒的基因组。因此，可通过常规技术(例如定点诱变)将定义的突变导入基因组或反基因组的cDNA拷贝中。利用如本文所述的反基因组或基因组cDNA亚片段组装完整反基因组或基因组cDNA有如下好处，即可分别操作各区(小cDNA比大cDNA更容易操作)，然后很容易组装成完整cDNA。因此，可用完整反基因组或基因组cDNA或其任何亚片段作为模板用于寡核苷酸指导的诱变。例如用Bio-RadLaboratories的Muta-gene试剂盒(Richmond，CA)通过单链噬菌粒形式的中间产物，或者用双链质粒直接作为模板的方法，例如Stratagene的Chameleon诱变试剂盒(LaJolla，CA)，或者通过使用含目的突变的寡核苷酸引物或模板的聚合酶链反应可达到所述目的。然后可将突变的亚片段组装成完整反基因组或基因组cDNA。各种其他诱变技术是已知的，而且可用于在RSV反基因组或基因组cDNA中产生目的突变。突变可以是单核苷酸改变，也可以是含一个或多个基因或基因区域的大cDNA片段的替换。
因此，在一说明性的实施方案中，用Bio-Rad提供的Muta-gene噬菌粒体外诱变试剂盒可导入突变。总之，将编码部分RSV基因组或反基因组的cDNA克隆到质粒pTZ18U中，然后用于转化CJ236细胞(LifeTechnologies)。按制造商的建议制备噬菌粒制品。通过在基因组或反基因组的所需位置导入改变的核苷酸设计用于诱变的寡核苷酸。然后扩增含遗传改变的基因组或反基因组区段的质粒，并将突变的片段再导入全长基因组或反基因组克隆中。
将定义的突变导入感染性RSV中的能力有许多应用，包括RSV分子生物学和致病机理的分析。例如，通过导入切除或降低表达水平的突变或产生突变蛋白的突变可研究和操作RSV蛋白质的功能。在一作例证的实施方案中，构建重组RSV，其中例如通过缺失mRNA编码序列和侧转录信号切除病毒基因，即SH基因的表达。令人惊奇的是，不仅可回收病毒，而且该病毒还能在组织培养中有效生长。事实上基于两者都产生感染性病毒以及噬菌斑大小来看，其生长比野生型基本上有所提高。因SH缺失而产生的组织培养中的生长改善以及本发明的其他RSV衍生物为开发RSV疫苗提供了有用的工具，这样克服了RSV在组织培养中生长不好的问题，这一问题曾使得疫苗病毒在其他系统中生产变复杂。这些缺失对于遗传回复来说是高度稳定的，由其衍生的RSV克隆特别适用于疫苗剂。
在另一作例证的实施方案中，提供了嵌合RSV掺入一种突变体中，该突变体缺失M2基因(M2ORF2)(Collins和Wertz，J.Virol.54：65-71，1985；Collins等，J.Gen.Virol.71：3015-3020，1990，Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：81-85，1996，分别在此引入作为参考)，或者降低或切除M2ORF2表达以产生新RSV疫苗候选株(参见1999年7月9日Collins等提交的美国临时专利申请号60/143,097，在此引入作为参考)。在优选的方面，通过修饰嵌合RSV基因组或反基因组以在M2ORF2中掺入移码突变或一个终止密码子产生“剔除”病毒克隆而降低或除去M2ORF2的表达。或者，全部或部分缺失M2ORF2以产生部分或全部非功能的M2-2蛋白质或者全部破坏其表达以产生M2ORF2″缺失突变″嵌合RSV。或者，可在基因组或反基因组中将M2-2ORF移位到与M2-2基因的天然基因顺序位置相比更靠近启动子或更远离启动子的位置以便上调或下调M2-2ORF的表达。在其他实施方案中，将M2-2ORF作为具有基因起始和基因终止信号的单独基因掺入到基因组或反基因组中，其修饰导致M2-2ORF的上调。
本发明嵌合RSV在M2ORF2中被进一步修饰掺入突变，具有非常适合于疫苗开发的表型特征。在嵌合基因组或反基因组中上述已鉴定的修饰具体说明在所得病毒或亚病毒颗粒中的一个或多个所需表型的改变。由此产生的疫苗候选株表现出一个或多个经鉴定的下列特征(i)在mRNA转录中的改变；(ii)病毒蛋白表达水平的改变；(iii)基因组或反基因组RNA复制的改变；(iv)病毒生长特征的改变；(v)病毒噬菌斑大小的改变和/或(vi)细胞病原性的改变。
在掺入M2ORF2缺失或剔除突变的作例证RSV嵌合体中，所需表型改变包括与相应野生型或突变亲本RSV菌株的生长相比病毒生长的减毒作用。在更详细的方面，在细胞培养中的病毒减毒约10倍或更高可归功于M2ORF2中突变。病毒生长动力学也表明以有益于疫苗开发的方式得到修饰。
与相应野生型或突变亲本RSV菌株的mRNA合成动力学相比，在本发明中还包括表现出延迟的病毒mRNA合成动力学的嵌合M2-ORF2缺失和剔除突变RSV。虽然有这些延迟的转录动力学，但这些新疫苗候选株与亲本病毒相比，仍表现出累积性mRNA合成提高。与在用野生型或其他亲本RSV菌株感染的细胞中积累的蛋白质相比，这些表型改变通常在所感染细胞中病毒蛋白积累增加有关。同时，与具有正常M2ORF2功能的亲本RSV菌株相比，M2ORF2嵌合RSV中的病毒RNA复制降低，由此降低了基因组或反基因组RNA的积累。
在本发明的优选方面，嵌合M2ORF2缺失和″剔除″RSV改造成表达未减少的，或更通常的是提高水平的病毒抗原，同时也表现出减毒表型。由于未降低或提高了mRNA转录和抗原表达而因此保留了免疫原性潜力，而通过掺入异源基因或基因片段，同时因M2-ORF2缺失和剔除突变而减少RNA复制和病毒生长，从而达到减毒的目的。这种一组新的表型特征对于疫苗开发是非常需要的。与相应野生型和突变亲本RSV菌株相比，在M2ORF2缺失和剔除嵌合RSV中观察到的其他有用的表型改变包括大噬菌斑表型和改变的细胞病原性。
本发明还提供了从一个或多个分离的多核苷酸，例如一个或多个cDNAs生产感染性人一牛嵌合RSV的方法。根据本发明，编码RSV基因组或反基因组的cDNA构建成与必需的病毒蛋白质一起在细胞内或体外共表达以形成感染性RSV。″RSV反基因组″指分离的正义多核苷酸分子，它可作为子代RSV基因组合成的模板。优选地，构建是RSV基因组正义版本的cDNA，相对于复制性的中间RNA或反基因组而言，以便减小与互补序列的正义转录本杂交的可能性，该互补序列编码产生转录、复制核壳所必需的蛋白质，即编码N、P、L和M2(ORF1)蛋白的序列。在RSV小基因组系统中，无论是与RSV还是质粒互补，在获救方面基因组和反基因组具有同等活性，这表明可使用基因组或反基因组，并因此可根据方法学或其他因素加以选择。
基本上如在(Mink等，Virology185：615-624，1991；Stec等，Virology183：273-287，1991；和Connors等，Virol.208：478-484，1995；Collins等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA93：81-85，1996)所述，分别在此引入作为参考，天然RSV基因组通常含有负义多核苷酸分子，它通过互补病毒mRNA编码11种病毒蛋白，即非结构蛋白NS1和NS2、N、P、基质(M)、小疏水(SH)、糖蛋白(G)、融合(F)、M2(ORF1)、M2(ORF2)和L。为了达到本发明的目的，本发明的重组RSV的基因组或反基因组只需含有那些对产生编码感染性病毒或亚病毒颗粒所必需的基因或其片段。此外，可以由一个以上的多核苷酸分子提供基因或其部分，即可通过单独核苷酸分子的补充或类似物提供基因，或者可直接从基因组或反基因组cDNA表达该基因。
重组RSV指直接或间接衍生自重组表达系统或繁殖自从中产生的病毒或亚病毒颗粒的RSV或RSV-样病毒或亚病毒颗粒。重组表达系统将采用重组表达载体，该载体含有一个可操作相连的转录单位，该转录单位包括一组在RSV基因表达中具有调节作用的至少一个遗传元件，例如启动子、转录成RSVRNA的结构或编码序列以及适宜的转录起始和终止序列。
为了从cDNA-表达的基因组或反基因组产生感染性RSV，将基因组或反基因组与对(i)产生能够进行RNA复制的核壳和(ii)产生胜任RNA复制和转录的子代核壳所必需的RSV蛋白共表达。通过基因组核壳转录提供了其他RSV蛋白并引发了生产性感染。或者通过共表达提供生产性感染所需的另外RSV蛋白。
在本发明特定的实施方案中，由一个或多个辅助病毒提供编码对产生转录、复制RSV核壳所必需的蛋白质的互补序列。这些辅助病毒可以是野生型或突变体。优选地，可从表型上区别这种辅助病毒和由RSVcDNA编码的病毒。例如，需要提供与辅助病毒而不是由RSVcDNA编码的病毒发生免疫反应的单克隆抗体。这些抗体可以是中和抗体。在一些实施方案中，可用这些抗体中和辅助病毒背景以便有利于鉴定和回收重组病毒，或者用亲和层析将辅助病毒与重组病毒分开。可将突变导入RSVcDNA，其提供与这些抗体非反应性或抗中和的重组RSV。
可在人-牛嵌合RSV基因组或反基因组中进行各种核苷酸插入和缺失以产生适当减毒的克隆。野生型人RSV基因组的核苷酸长度(15,222个核苷酸)是6的倍数，副粘病毒和麻疹病毒属的成员也通常遵守“6的规则”，即仅当其核苷酸长度是6的倍数时，基因组(或小基因组)复制才有效(认为是精确跨距相对于包被NP蛋白质的核苷酸残基的需要)。通过增加单个残基改变RSV基因组长度对复制的有效性没有影响，传代后多个不同小基因组突变体的序列分析表明保持了长度差异而没有补偿性改变。因此，RSV并不严格要求基因组长度是6的倍数，在RSV基因组或反基因组中可进行核苷酸插入和缺失而不会使本发明重组RSV的复制落空。
构建编码人-牛嵌合RSV基因组或反基因组的cDNA可选择的方法包括用改进的PCR条件(例如按Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：5695-5699，1994；Samal等，J.Virol.70：5075-5082，1996所述，在此引入作为参考)反转录PCR以便将亚单位cDNA组分的数目减少到1或2个片段。在其他实施方案中，可使用不同启动子(例如T3、SP6)或不同核酶(例如肝炎δ病毒的)。可用不同DNA载体(例如粘粒)繁殖以达到更好地容纳大尺寸的基因组或反基因组。
RNA复制所需的N、P和L蛋白需要RNA聚合酶延长因子例如对持续转录的M2(ORF1)蛋白。M2(ORF1)或对负链RNA病毒基本上等同的转录延长因子是生产感染性RSV所需的而且是生产性感染过程中功能性核壳的必需组分。
对M2(ORF1)蛋白的需要与其作为转录延长因子的作用一致。对于表达负链RNA病毒的RNA聚合酶延长因子蛋白的需要是本发明的特征。M2(ORF1)可通过表达完整M2-基因，要么通过嵌合基因组或反基因组，要求通过共表达提供，尽管在这种形式中，第二个ORF2也可被表达并对RNA复制有抑制作用。因此，为了用完整M2基因生产感染性病毒，应平衡两个ORF的活性以便允许有效表达M(ORF1)，从而提供转录延长活性但不是太多M(ORF2)而抑制RNA复制。或者，从cDNA中提供ORF1蛋白，该cDNA改造成缺失ORF2或者编码缺陷的ORF2。通过共表达其他病毒蛋白基因，例如编码被膜组分(即SH、M、G、F蛋白)的基因也可改善病毒生长的效率。
将编码人-牛嵌合RSV基因组或反基因组的分离的多核苷酸(例如cDNA)或者从反基因组或基因组cDNA表达的多核苷酸单独地，或以其顺式与从反基因组或基因组cDNA表达的N、P、L和M2(ORF1)蛋白一起通过转染、电穿孔、机械插入、转导等插入到能够支持生产性RSV感染的细胞中，例如HEp-2、FRhL-DBS2、MRC和Vero中。可将分离的多核苷酸序列的转染物导入到培养细胞中通过例如磷酸钙介导的转染(Wigler等，Cell14：725，1978；Corsaro和Pearson，SomaticCellGenetics7：603，1981；Graham和VanderEb，Virology52：456，1973)、电穿孔(Neumann等，EMBOJ.1：841-845，1982)、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等编CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWileyandSons，Inc.，NY，1987)、阳离子脂介导的转染(Hawley-Nelson等，Focus15：73-79，1993)或市售转染剂例如LipofectACE(LifeTechnologies)(每篇前述文献在此引入作为参考)。
N、P、L和M2(ORF1)蛋白可由一个或多个cDNA和表达载体编码，该cDNA和表达载体可以与编码基因组或反基因组以及其各种组合的cDNA和表达载体相同或不同。按照需要可包括的其他蛋白质可由其自身载体编码或由编码N、P、L或M2(ORF1)蛋白质和/或完整基因组或反基因组的载体编码。来自转染质粒的基因组或反基因组和蛋白质的表达可通过下列方式获得，例如将各cDNA置于T7RNA聚合酶的启动子控制下，所述启动子由通过用T7RNA聚合酶的表达系统感染、转染或转导依次提供，例如，表达T7RNA聚合酶的牛痘病毒MVA菌株重组体(Wyatt等，Virology，210：202-205，1995，在此引入作为参考)。也可由转化的哺乳动物或者通过转染完成的mRNA或蛋白质提供病毒蛋白和/或T7RNA聚合酶。
或者，在组合的转录—翻译反应中体外(无细胞)合成反基因组或基因组，然后转染到细胞中。或者体外合成反基因组或基因组RNA，然后转染到表达RSV蛋白的细胞中。
依据本发明，为了筛选候选嵌合疫苗病毒，根据熟知的方法确定生存能力、减毒和免疫原性标准。在本发明疫苗中最需要的病毒必须是保持生存能力、具有稳定的减毒表型、在所免疫的宿主中能够复制(虽然水平较低)，并在接种者中能有效引发免疫反应的产生以赋予对随后野生型病毒感染引起的严重疾病的保护作用。明确地说，迄今已知和报道的RS病毒突变体都不符合这些标准。事实上，与基于已知的减毒RSV所报道的结果预期相反，本发明的病毒与以前的突变体相比不仅能存活并被更适宜地减毒，而且与以前研究的突变体相比在体内遗传上更稳定——保留了刺激保护性免疫反应的能力，并在某些情况下扩大了由多修饰提供的保护作用，例如诱导抗不同病毒菌株或亚型的保护作用，或者通过不同免疫学基础的保护作用，例如分泌对血清免疫球蛋白，细胞免疫等等。在本发明之前，体内复制后ts表型的遗传不稳定性对于ts病毒是常见的(Murphy等，Infect.Immun.37：235-242，1982)。
为了繁殖用于疫苗和其他目的的人-牛嵌合RSV病毒，可使用多种可使RSV生长的细胞系。RSV可在各种人和动物细胞中生长。用于繁殖疫苗用减毒RS病毒的优选细胞系包括DBS-FRhL-2、MRC-5和Vero细胞。通常用上皮细胞系例如Vero细胞可获得最高病毒产率。通常将细胞用约0.001-1.0或更高MOI的病毒接种，然后在允许病毒复制的条件下，例如在约30-37℃以及约3-5天，或者长至病毒能够达到足够的滴度所必需的条件。将病毒从细胞培养中取出，然后与细胞组分分开，通常利用熟知的澄清方法，例如离心，然后按需要采用本领域技术人员熟知的方法进一步纯化。
可用各种熟知和普遍接受的体内外模型检测如本文所述已经减毒并修饰的人-牛嵌合RSV，以确定作为疫苗用途是否达到足够的减毒、对表型回复的抗性以及免疫原性。在体外检测中，就病毒复制的温度敏感性，即ts表型和小噬菌斑表型检测修饰的病毒(例如多减毒的、生物学衍生的或重组RSV)。修饰病毒用RSV感染的动物模型进一步检测。各种动物模型已被描述和总结在(Meignier等编，AnimalModelsofRespiratorySyncytialVirusInfection，MerieuxFoundationPublication，1991，在此引入作为参考)。RSV感染的棉鼠模型描述于(美国4,800,078和Prince等，VirusRes.3：193-206，1985)，在此引入作为参考，并认为在人和非人灵长类中对减毒作用和效率是预测性的。另外，利用黑猩猩的RSV感染的灵长类模型在人中减毒作用和效率是预测性的，如在(Richardson等，J.Med.Virol.3：91-100，1978；Wright等，Infect.Immun.37：397-400，1982；Crowe等，Vaccine11：1395-1404，1993，分别引入作为参考)中详细描述的一样。
根据前文所述以及下文所述的实施例，本发明还提供了用于疫苗的分离的、感染性人-牛嵌合RSV组合物。作为疫苗组分的减毒嵌合病毒是分离，通常是纯化形式的。“分离的”意指不同于野生型病毒的自然环境，例如受感染个体的鼻咽中的RSV。更一般地，“分离的”意包括作为细胞培养或其他人工介质的组分的减毒病毒，这里在控制的条件下病毒能增殖和表征。例如通过感染的细胞培养物可生产本发明的减毒RSV，与细胞培养物分开，并加入稳定剂。
经气溶胶、小滴、口、局部或其他途径用本文所述的人-牛嵌合RSV疫苗组合物免疫后，宿主的免疫系统通过产生针对一种或多种RSV病毒蛋白，例如F和/或G糖蛋白特异性的抗体而对疫苗产生应答。接种的结果，宿主对RSV感染至少部分或完全免疫，或对发展的中度或严重RSV疾病，特别是下呼吸道疾病产生抗性。
本发明的人-牛嵌合RSV疫苗可含有减毒嵌合病毒，该病毒可引发针对单一RSV菌株或抗原亚型例如A或B或者针对多种RSV菌株或亚型的免疫反应。在本发明中，嵌合RSV可引发单特异性免疫反应或者针对多种RSV菌株或亚型的多特异性免疫反应。或者，可将具有不同免疫原性特征的嵌合RSV组合在疫苗混合物中或者以协同处理方案分别施用以引发更有效的抗一种RSV菌株或抗多种RSV菌株或亚型的保护作用。
将要施用疫苗的宿主可以是对RSV或者相近病毒感染敏感并能够对所接种病毒的抗原产生保护性免疫反应的任何哺乳动物。因此，适宜的宿主包括人、非人灵长类、牛、马、猪、绵羊、山羊、lagamorph、啮齿动物等。因此，本发明提供了产生用于各类人和兽的疫苗的方法。
将含本发明减毒人-牛嵌合RSV的疫苗组合物以“免疫学有效量”施用给对RSV感染敏感或者有RSV感染危险的患者，所述“免疫学有效量”指足以诱导或提高个体抗RSV的免疫反应能力的剂量。在人是被试对象的情况下，按例如所述(Wright等，Infect.Immun.37：397-400，1982；Kim等，Pediatrics52：56-63，1973；和Wright等，J.Pediatr.88：931-936，1976)，分别在此引入作为参考，按照已确立的人RSV疫苗方案施用本发明的减毒病毒。简而言之，用小滴经鼻内给成年人或儿童接种免疫学有效量的RSV疫苗，通常是0.5ml生理学可接受的稀释剂或载体。与用非复制疫苗肠胃外的免疫相比，这种方法具有既简单又安全的优势。还提供了直接刺激局部呼吸道免疫的方法，该法在RSV抗性中起主要作用。此外，该接种方式有效回避RSV-特异性母体衍生的血清抗体的免疫抑制作用，该免疫抑制作用通常见于很小的婴儿。另外，尽管胃肠外施用RSV抗原有时与免疫病理学并发症有关，但在用活病毒时从未观察到。
在新生儿和婴儿中，需要多次给药以引发足够水平的免疫。给药应在出生后第一个月内开始，在儿童期间隔给药，例如以2个月、6个月、一年和两年的间隔，以必须保持足够水平的抗天然(野生型)RSV感染的保护作用。同样，对重复或严重RSV感染特别敏感的成年人，例如健康护理工、看护工、幼儿的家庭成员、老年人、心肺功能受损害的个体需要多次免疫以确立和/或保持保护性免疫反应。通过测定中和分泌和血清抗体的数量，调整的剂量或重复接种的次数能监测诱导的免疫水平以便必须维持在所需的保护水平。此外，可将不同疫苗病毒标名施用给不同的受体组。例如，表达富集在T细胞表位的细胞因子或其他蛋白质的经遗传工程学方法改变的嵌合RSV菌株对成年人比对婴儿尤其优势。将依据本发明生产的RSV疫苗能与表达另一RSV亚型或菌株抗原的病毒组合在一起以获得抗多种RSV亚型或菌株的保护作用。或者，疫苗病毒可按本文所述掺入加工到一个RSV克隆中的多个RSV菌株或亚型的保护性表位。
通常使用不同疫苗病毒时，会将其组合同时施用，但也可将其单独施用。例如，由于两种RSV亚型的F糖蛋白的氨基酸序列仅有约10％的不同，因此，这种相似性就是在用RSV或F抗原免疫和用异源菌株攻击的动物中所观察到的交叉保护性免疫反应的基础。因此，用一种菌株免疫可抵御相同或不同亚型的不同菌株。但是最佳保护作用需要对两种亚型都免疫。
本发明的人-牛嵌合RSV疫苗引发产生保护性免疫反应，当个体随后受到野生型RSV感染时，这种免疫反应可抵御严重的下呼吸道疾病，例如肺炎和细支气管炎。尽管天然循环中的病毒仍能引起感染，特别是在上呼吸道中，但由于接种并可能加强对随后野生型病毒感染的抗性，所以大大降低了鼻炎的可能性。接种后，有可检测水平的宿主产生的血清和分泌抗体，该抗体能够中和体外和体内同源(相同亚型的)野生型病毒。在许多情况下，宿主抗体还可中和不同非疫苗亚型的野生型病毒。
本发明的优选人-牛嵌合RSV与人中天然循环的野生型病毒相比，毒力有非常实质性的减低。嵌合病毒是充分减毒的以致在大多数免疫个体中不发生感染症状。在某些情况下，减毒病毒还能够传给未接种的个体。但是，其毒力被充分废除以致在所接种或附带宿主中不发生严重的下呼吸道感染。
在某些情况下，可合理地将本发明的人-牛嵌合RSV疫苗与针对其他药剂，特别是其他儿童病毒诱导保护性反应的疫苗组合在一起。例如，可将本发明的嵌合RSV疫苗与例如在Clements等，J.Clin.Microbiol.29：1175-1182，1991(在此引入作为参考)中所述的副流感病毒疫苗同时施用。在本发明的另一方面，可将嵌合RSV作为其他呼吸道病原体例如PIV的保护性抗原的载体，按本文所述，通过将编码这些保护性抗原的序列掺入到用于生产感染性嵌合RSV的嵌合RSV基因组或反基因组而完成。
在本发明的另一方面，用嵌合RSV作为呼吸道的瞬时基因治疗的载体。根据该实施方案，嵌合RSV基因组或反基因组掺入能够编码目的基因产物的序列。目的基因产物在与控制RSV表达相同或不同的启动子的控制下。将通过与N、P、L及M2(ORF1)蛋白共表达重组RSV基因组或反基因组并含有编码目的基因产物的序列而产生的感染性RSV施用给患者。这样可能涉及是完全感染性的重组RSV(即对感染培养的细胞是感受态并产生感染性子代)，或可以是例如缺乏一个或多个G、F和SH表面糖蛋白基因并通过稳定或瞬时表达以反式提供一种或多种这些蛋白的细胞中增殖的重组RSV。在这种情况下，产生的重组病毒能胜任有效感染，但在产生感染性颗粒方面是高度无效的。所表达的细胞表面糖蛋白的缺乏也会降低宿主免疫系统在减少感染细胞方面的效率。这些特征将会提高外源基因表达的持久性和安全性。
就基因治疗来说，通常通过气溶胶、喷雾器或其他局部应用给药到待治疗之患者的呼吸道。施用足够的量人—牛嵌合RSV会导致治疗或预防水平的所需基因产物表达。用该方法施用的代表性基因产物的实例包括那些编码例如特别适合于瞬时表达的产物，例如白细胞介素-2、白细胞介素-4、γ-干扰素、GM-CSF、G-CSF、促红细胞生成素以及其他细胞因子、葡糖脑苷脂酶、苯丙氨酸羟化酶、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、细胞毒素、肿瘤抑制因子、反义RNA和疫苗抗原。
以说明而非限制的方式提供下列实施例。实施例I构建编码嵌合BRSV/HRSV反基因组的cDNA及回收感染性rBRSV/A2嵌合病毒
用类似于HRSV所描述的策略(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：11563-11567，1995；Bermingham和Collins，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：11259-11264，1999；Bukreyev等，J.Virol.70：6634-6641，1996；Bukreyev等，J.Virol.71：8973-8982，1997；Whitehead等，J.Virol.72：4467-4471，1998；Whitehead等，Virology247：232-239，1998；Collins等，Virology259：251-255，1999；Bukreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：2367-2372，1999；Juhasz等，Vaccine17：1416-1424，1999；Juhasz等，J.Virol.73：5176-5180，1999；Teng和Collins，J.Virol.73：466-473，1999；Whitehead等，J.Virol.73：9773-9780，1999；Whitehead等，J.Virol.73：871-877，1999；Whitehead等，J.Virol.73：3438-3442，1999；Murphy等，美国专利号5,993,824，分别在此引入作为参考)从编码病毒反基因组RNA和N、P、M2-1和L支持蛋白(Buchholz等，J.Virol.73：251-259，1999)克隆的cDNA中回收感染性rBRSV。但是，通过利用稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系，而不是用表达该酶的牛痘病毒重组体感染来提供T7RNA聚合酶(Buchholz等，J.Virol.73：251-259，1999)。
设计用于rBRSV的cDNA来编码带有真正3’和5’末端而没有其他异源末端核苷酸的完整rBRSV反基因组RNA。该cDNA编码具有体外生长特性的感染性rBRSV，这些特性与其生物学亲本ATue51908病毒株特性(文献参照同上)基本上无法区别开，该亲本衍生于美国典型培养物保藏中心提供的A51908病毒株。
为了用于本发明，按照下列标准方法(Kunkel等，MethodsEnzymol.154：367-382，1987；在此引入作为参考)通过定点诱变修饰前述质粒：首先除去在NS1非编码区的单一合成的NotI位点(Buchholz等，J.Virol.73：251-9，1999，在此引入作为参考)以产生ATue51908野生型序列(GenBank登记号AF092942)。其次，将合成的标记限制位点导入SH/G(SalI，ATue51908核苷酸4,673)，G/F(SphI，ATue51908核苷酸5,539)和F/M2(XhoI，ATue51908核苷酸7,471和ClaI，ATue51908核苷酸7,485)基因间区域(图1B)。将所得的质粒命名为pBRSV18(在pBRSV18中BRSVcDNA的Genbank登记号为AF092942)。该cDNA作为构建BRSV/HRSV嵌合体的亲本cDNA。就体外生长特征而言，从该亲本cDNA回收的rBRSV与生物学衍生的ATue51908病毒基本上无法区分，因此认为其是野生型生长表型。
基本上如本发明别处以及上述引入之参考文献所述，从cDNA回收重组RSV。用5微克各自全长质粒(pBRSV18或pBRSV/A2-10)和4个一组的从其表达BRSVN、P、L与M2蛋白的支持质粒(2.5gpN、2.5μgpP、0.5μgpL和0.5μgpM2)转染32-mm平皿的稳定表达噬菌体T7RNA聚合酶的分会合BSRT7/5细胞。将所有cDNA构建体克隆在T7启动子的控制下。该表达质粒含EMCVIRES序列，允许进行帽—独立(cap-independent)翻译。用Superfect(Qiagen，Valencia，California)转染剂完成转染。转染2小时后，除去上清液，用含3％胎牛血清(FCS)补加的极限必需培养基洗涤细胞并保持。转染3天后，将细胞以1∶3的比例分开。转染后7天收集细胞和上清液。用甲基纤维素覆盖双份转染物，保温5天不会分裂，通过免疫化学染色检查。这表明pBRSV18与pBRSV/A2-10产生相似水平的回收病毒，约100个转化灶/32-mm平皿。根据该标准，rBRSV/A2病毒与rBRSV亲本基本上表现出相同的生活力。
为了证实所回收病毒的同一性，从感染的细胞中回收病毒RNA，然后通过反转录(RT)PCR分析。用设计引物进行反应以拷贝并扩增基因组的3个RNA区，该区域含图1B中所示标记限制位点，这些位点可以区别ATue51908、rBRSV与rBRSV/A2。用于RT的引物是反基因组意义的，与下列基因互补：BRSV(ATue51908病毒株)M基因(ATue51908核苷酸从3612到3635)的一个区域、BRSVG基因(ATue51908核苷酸从5372到5392)或HRSVA2G基因(HRSVA2核苷酸5442-5463)，以及BRSVF基因(ATue51908核苷酸从7218到7240)或者HRSVA2F基因(A2核苷酸从7309到7329)。将一份RT产物用于PCR，使用上述各自的第一链引物和对应于基因组序列的各自基因间区域下游的反向引物(ATue51908核苷酸从4886到4862和HRSVA2核苷酸从4878到4856，SH/G基因间区域下游反向引物；ATue51908核苷酸从5964到5941和HRSVA2核苷酸从6055到6033，G/F基因间区域下游反向引物；以及ATue51908核苷酸从7852到7832，F/M2基因间区域下游反向引物)。
如图2A与2B所示，每个RT-PCR反应产生单一cDNA产物，在每种情况下其电泳迁移率与计算的预测值一致。如果删除RT步骤，则不会缺失PCR产物，这表明该产物衍生自RNA而不是污染的DNA。用诊断限制酶(SalI、StuI、SphI和XhoI)消化RT-PCR产物，然后在琼脂糖凝胶电泳上电泳分析。在所有情况下，均得到了预期的限制图谱，这表明每种病毒均含有预期的限制位点标记。具体地说，ATue51908生物学衍生的病毒在所检测区域内均缺乏所有4个位点，两个重组体均含有位于SH/G基因间区域的单一SolI位点，和在F/M2区域内单一XhoI位点，rBRSV在G/F基因间区域含有单一SphI位点，而rBRSV/A2在这个后基因间区域内含单一StuI位点。另外，用自动测序仪(LI-COR，MWG)测定RT-PCR产物的序列，证实了预期的序列。因此，这种嵌合rBRSV/A2病毒含有预期的结构，并在回收过程中没有序列改变。实施例II重组嵌合rBRSV/A2病毒的体外分析
为了制备用于进一步分析的病毒储备液，用感染复数(MOI)为0.1的rBRSV或rBRSV/A2感染牛MDBK细胞单层。吸附90分钟后，除去接种物，将细胞保持在用3％胎牛血清(FBS)补加的极限必需培养基中。当细胞病变的效应(CPE)显著时，通常在温育4-7天后，将培养基调整到100mMMgSO4与50mMHEPES(pH7.5)以便使病毒稳定(Femie和Gerin，Virology106：141-4，1980，在此引入作为参考)，使细胞和培养基经3轮-70℃的快速冷冻和快速融解以便释放病毒。通过离心除去细胞碎片。用相同的方法在HEp-2细胞中繁殖生物学衍生的HRSV病毒株Long。就序列分析以及与大多数单克隆的反应性而言，病毒株Long与病毒株A2非常相似，因此在这些特定检测中作为A2病毒株的替代物(Johnson等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA84：5625-9，1987；Johnson和Collins，JGen.Virol.70：1539-47，1989；Lopez等，VirusRes.10：249-61，1988，分别在此引入作为参考)。不用对ATue51908生物学衍生的亲本进行平行分析，因为其体外生长特性与其重组衍生物rBRSV基本相似，因此作为BRSV对照。按以前所述进行病毒滴定(Buchholz等，J.Virol.73：251-9，1999，在此引入作为参考)。
通过间接免疫荧光检测在由rBRSV、rBRSV/A2与HRSV病毒株Long在人HEp-2细胞中的G蛋白表达。用0.1MOI感染HEp-2细胞，感染36小时后，用80％丙酮固定，然后在37℃与针对BRSVG的小鼠单克隆抗体(mab)G66(1∶1000稀释)(Furze等，J.Gen.Virol.75：363-70，1994；Langedijk等，J.Virol.71：4055-61，1997，分别在此引入作为参考)，或者与针对抗HRSVG的mab021/01G(1∶40稀释)(Garcia-Barreno等，J.Virol.63：925-32，1989；Martinez和Melero，J.Gen.Virol.79：2215-20，1998，分别在此引入作为参考)一起保温30分钟。将细胞用结合山羊抗小鼠IgG(Dianova，Hamburg)的异硫氰酸荧光素染色，再用0.01％EvansBlue复染。
正如预期的，BRSV-特异性的mab与rBRSV反应，而不与rBRSV/A2或HRSV反应(表1)。相反，HRSV-特异性mab与rBRSV/A2与HRSV反应，但不与rBRSV反应。rBRSV与HRSV的反应性图谱分别与其牛和人特异性一致，而rBRSV/A2的反应性图谱证实其表达人源G蛋白而不是牛源G蛋白。另一方面，嵌合rBRSV/A2病毒在HEp-2细胞中诱导细胞病变效应(CPE)，该效应与rBRSV的更相似胜过HRSV。例如，在用HRSV感染的培养物中，几乎100％的细胞表现出阳性免疫荧光，而相对地用rBRSV感染的有20％，用rBRSV/A2感染的有20-30％。另外，HRSV诱导显著的CPE，伴随形成大合胞体，而rBRSV与rBRSV/A2引起水平降低的CPE并形成小合胞体。因此，嵌合rBRSV/A2病毒在该人细胞系中的感染性和CPE与其rBRSV亲本更近似。这表明表面糖蛋白G和F单独转移到rBRSV并不会赋予HRSV完全许可在人细胞中生长--这表明其他HRSV基因有助于确定在Hep-2细胞中的生长特征。
表1.通过与单克隆抗体a的反应性证实在rBRSV/A2和rBRSV/LongF重组病毒中存在相称的F和G糖蛋白mab特异性rBRSVarBRSV/A2arBRSV/LongFaHRSVaG66BRSVG+-+-021/1GHRSVG-+-+2FRSVF++++44FHRSVF-+++
a.在间接免疫荧光检测和免疫电子显微镜中的反应性。
用免疫电子显微术检测病毒体是否存在适宜特异性的G蛋白。用0.1MOI的rBRSV、rBRSV/A2或HRSV感染MDBK细胞。感染后72小时，当CPE显著时，用缓冲的0.05％戊二醛将材料固定15分钟以使病毒体结构稳定。从平板中刮掉单层，然后低速离心，将沉淀重悬浮在少量缓冲液中。将用碳稳定的包被300目铜网格的辉光排放弗姆瓦浮在细胞悬浮液滴上。通过用在含1％牛血清白蛋白标准磷酸缓冲的盐水(PBS-BSA)中的1％冷水鱼明胶(Sigma，Deisenhofen，Germany)处理的网格阻断抗体的非特异性吸附。随后，将该网格在用PBS-BSA稀释的单克隆抗体(2F，特异于HRSV和BRSVF，44F，特异于HRSVF，021/1G，特异于HRSVG和66G，特异于BRSVG(Garcia-Barreno等，J.Virol.63：925-932，1989；Martinez等，J.Gen.Virol.79：2215-2220，1998))滴上浮45分钟。用PBS-BSA洗涤数次后，用经山羊抗小鼠免疫球蛋白Fab(GAF10，BioCellInt.，Cardiff，UnitedKingdom)标记的胶体金(10nm)检测并用磷钨酸(PTA)，pH6.0负染色结合抗体。用400T传导电子显微镜(Philips，TheNetherlands)检测该网格。该过程使病毒体结构保持完整，而且可检测外表面抗原。
电子显微术分析揭示在制备有大量rBRSV(图4，A组)、rBRSV/A2与HRSV病毒株Long直径为100-200nm、长度为数微米的丝状颗粒。超薄切片及戊二醛固定后的材料比较证明在戊二醛固定后仍能保持病毒体的形状。戊二醛固定后观察到的病毒体直径的变化可能是由于固定过程中颗粒脱水造成的(图4，A和B组)。此外，未影响抗原的结构和单克隆抗体的反应性(图4，A组，插入部分)。
用针对BRSV和HRSVG和F蛋白(表1)的抗体组对病毒制备物进行免疫电子显微术检查，然后用金—结合的山羊抗小鼠免疫球蛋白标记，负染色。用针对HRSVF的单克隆抗体(图5，B组、D组和F组)，与HRSV病毒体表面的标记强度相比(图5，F组)可观察到rBRSV/A2病毒体表面的密集免疫金标记(图5，D组)，而未检测到rBRSV病毒体的特异性标记(图5，B组)。用与BRSV和HRSVF蛋白均反应的抗体2F(图5，A、C和E组)作为对照以说明所有病毒制备物，包括BRSV制备物抗原结构完整。这证实正如预期的，rBRSV/A2嵌合病毒和HRSV阳性对照病毒含有HRSVF蛋白，而rBRSV阴性对照病毒则没有。
针对HRSVG蛋白的单克隆抗体与rBRSV/A2(图6，D组)以及与HRSV颗粒(图6，F组)反应，而不能与rBRSV病毒体表面(图6，B组)反应。当用针对BRSVG的抗体作为对照时，仅有rBRSV病毒体表面被免疫金标记(图6，A组)，而不是嵌合病毒体(rBRSV/A2，图6，C组)或HRSV(图6，E组)的病毒体表面。这些结果证实rBRSV/A2嵌合病毒与HRSV对照病毒含有HRSVG蛋白，而不是BRSV的G蛋白，而rBRSV对照病毒含BRSVG蛋白，而不含HRSVG蛋白。因此，rBRSV/A2嵌合病毒确实含有HRSVG和F蛋白作为表面糖蛋白，存在数量与生物学衍生之病毒相似。实施例III构建编码涉及不同HRSVA亚型病毒包含单一基因替换的嵌合BRSV/HRSV病毒的cDNA
上述嵌合rBRSV/A2病毒涉及同时替换两个表面蛋白，G和F。需要确定BRSV/HRSV嵌合病毒是否能被制备，其中这种替换仅涉及两个糖蛋白之一，而且确定该替换是否能与不同A亚型病毒株即Long病毒株一起制备。构建第二个BRSV反基因组cDNA，其中含有替换BRSVF基因的HRSV病毒株LongF基因(图7A和7B)。从HRSV病毒株Long感染的HEp-2细胞中制备总RNA。随后用下列引物进行RT-PCR：引物FLa(5′-AGGAATTCGCATGCGGGGCAAATAACAATGGAGTTGCCAATC-3′(SEQIDNO：21)，HRSV病毒株LongF基因序列的核苷酸1-28，含EcoRI/SphI衔接物(有下划线者)，和引物FLRa(5′-AGGAATTCTCGAGTTTTTATATAACTATAAACTAGGAATCTAC-3′(SEQIDNO：22)，HRSV病毒株LongF基因的核苷酸1903-1874，下划线的为EcoRI/XhoI衔接物，产生1,930bp的PCR产物。用EcoRI衔接物将PCR产物克隆到pBluescriptSK-(Stratagene，LaJolla，CA)中。将PCR产物测序，用SphI与XhoI切割1,906bp片段，然后转移到pBRSV18的Sphl-XhoI窗口中，得到pBRSV/LongF-12。该质粒编码15,114个核苷酸的嵌合RSV反基因组。
按上述，将质粒pBRSV/LongF-12转染到稳定表达T7RNA聚合酶的BSRT7/5细胞中。转染5天后，在所有转染的平皿中均可观察到对RSV典型的约数细胞病变效应。rBRSV、rBRSV/A2与rBRSV/LongF的回收率相当高，通常产生约100个转染灶/32-mm平皿。通过从转染MDBK细胞上清液的2次传代生产病毒储备液。
按以上对rBRSV/A2病毒的描述通过免疫电子显微术分析rBRSV/LongF嵌合病毒。用对BRSVG蛋白特异性的mabG66分析rBRSV/LongF，表明有强反应性(图9，A组)，而用对HRSVG蛋白特异性的mab021/21G就观察不到(图9，B组)。rBRSV/LongF与对HRSVF特异性的mab44F也有强反应性(图9，D组)，以及与对HRSV和BRSVF蛋白特异性的mab2F也有强反应性(图9，C组)。这表明这个嵌合病毒含有亲本BRSVG蛋白以及来自HRSV病毒株Long的异源F糖蛋白。实施例IVrBRSV/A2嵌合病毒在血清反应阴性少年黑猩猩中的生长
通过鼻内和气管路径在各位点给确定为HRSV血清反应阴性的年轻黑猩猩接种107pfu/ml剂量的rBRSV或rBRSV/A2(表2)。每种病毒施用给2只黑猩猩。接种病毒后，在1-10和12天每天取鼻咽的拭抹样品，在2、5、6、8和12天取气管的灌洗样品。将样品冷冻，然后通过在HEp-2细胞上的噬菌斑检测测定RSV效价。每天评估鼻液溢的量，这是上呼吸道疾病的测量指标，赋分数值0-4(0＝无，1＝痕量，2＝轻度，3＝中度，4＝严重)。将所述结果与动物历史对照比较，所述对照接受通过相同途径施用的(i)104pfu重组HRSV病毒株野生型病毒A2/位点(Whitehead等，J.Virol.72：4467-4471，1998，在此引入作为参考)或(ii)105pfu活减毒rA2cp28/404病毒株A2疫苗候选物/位点(Whitehead等，J.Virol.73：3438-3442，1999，在此引入作为参考)(表2)。
表2.重组rBRSV和嵌合rBRSV/A2在黑猩猩上呼吸道和下呼吸道中的复制
鼻咽拭抹样品效价(log10pfu/ml)气管灌洗样品效价(log10fu/ml)
接种后天数接种后天数鼻液溢黑猩猩
峰值分
病毒1234567891012峰值256812峰值鉴定号
数95A016rBRSVa＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7095A018rBRSVa＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.70
平均值＜0.7＜0.70.0
rBRSV/95A007
＜0.7＜0.70.70.71.0＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.7＜0.71.0＜0.70.712＜0.7＜0.71.20A2
rBRSV/95A008
＜0.7＜0.70.7＜0.71.40.7＜0.7＜0.70.712＜0.71.4＜0.70.72.0＜0.7＜0.72.00A2
平均值121.60.0rA2cp248/404b＜0.7＜0.71.12.21.52.01.41.41.00.7＜0.72.5d＜0.71.01.0＜0.7＜0.71.4d0.8
平均值RACc平均值＜0.71.72.64.54.44.44.44.41.6＜0.7＜0.74.9d2.04.23.322＜0.74.7d2.5
a经鼻内和气管内以107pfu/ml的剂量在每个位点接种1.0ml每种病毒。在1-10和12天每天收集鼻咽的拭抹样品，在2、5、6、8和12天收集气管的灌洗样品。
b用4只黑猩猩以105pfu/ml的剂量评估rA2cp248/404病毒(Whitehead等，J.Virol.73：3438-3442，1999)。
c用4只黑猩猩以104pfu/ml的剂量评估rA2(rA2位点)病毒(Whitehead等，J.Virol.72：4467-4471，1998)。
d用在每个动物中达到的峰病毒效价计算平均峰效价。因为对于每个动物来说，在不同的天数达到峰病毒效价，平均峰效价超过在任何给出天的平均效价。
在第30天用每个位点鼻内或气管内施用的104pfu野生型HRSV攻击接受了rBRSV或rBRSV/A2病毒的动物。在攻击后3、5、7和10天取鼻拭抹或气管灌洗样品，通过噬菌斑实验检测释放的病毒。用两种病毒中的任一种预先免疫会在攻击过程中等程度地降低疾病症状。尽管所述嵌合病毒由于掺入人RSV序列而在黑猩猩中比BRSV表现出好的生长，但在该嵌合病毒中高度受限制的复制特性表明该疫苗候选株的微调将会降低灵长类的减毒作用。
表3.wtRSVA2攻击病毒在预先用rBRSVorrBRSV/A2接种的黑猩猩中的复制a
鼻咽拭抹样品效价(log10pfu/ml)气管灌洗效价(log10pfu/ml)黑猩猩用于免疫
接种后天数接种后天数鼻液溢量峰鉴定号的病毒
峰值
035710峰值35710值分数95A016rBRSV＜0.73.74.11.0＜0.74.15.26.0＜0.7＜0.76.0196A018rBRSV＜0.73.83.0＜0.7＜0.73.82.04.5＜0.7＜0.74.51
平均值4.05.31.095A007rBRSV/A2＜0.74.64.31.6＜0.74.65.76.31.7＜0.76.3295A008rBRSV/A2＜0.72.25.41.7＜0.75.43.26.32.8＜0.76.32
平均值5.06.32.0
a每个黑猩猩在第30天经鼻内和气管内以104pfu/ml的剂量在每个位点接种1.0ml的wtRSVA2。攻击在所标示的天数收集鼻咽的拭抹样品和气管灌洗样品。实施例V构建在靠近启动子移动的位置含HRSVG和F基因的嵌合BRSV/HRSV
本实施例描述构建感染性rBRSV/HRSV嵌合体，其中将HRSVG和F基因替换到重组牛RSV(rBRSV)背景中。所得的人-牛嵌合体含有HRSV的2个基因，即G和F，和来自BRSV的8个基因，即NS1、NS2、N、P、M、SH、M2和L。除这种基本替换的糖蛋白构建外，还将HRSVG和F基因移到rBRSV骨架中更靠近启动子的位置，即相对于在RSV基因组中F和G基因的野生型基因顺序位置。更具体地说，将F和G基因从其相对于启动子的通常位置，即分别为基因位置7和8分别移到位置1和2。
按上述生产完全感染性的rBRSV，其中进行核苷酸替换以便分别在位置67，4,673与7,471产生特有的NotI、SalI和XhoI位点(图10A)(Buchholz等，J.Virol.73：251-259，1999；Buchholz等，J.Virol.74：1187-1199，2000，在此引入作为参考)。NotI位点包含在BRSVNS1基因的上游非翻译区，SalI和XhoI位点在基因间区域。用SalI和XhoI消化rBRSV反基因组cDNA在其整体中切割BRSVG和F基因，并产生连接的相容粘性末端。这导致rBRSV反基因组cDNA缺乏G和F基因并含有有下列序列的64-核苷酸SH-M2基因间区域：TTAAACTTAAAAATGGTTTATGtcgaGGAATAAAATCGATTAACAACCAATCATTCAAAAAGAT(SEQIDNO.23)(小写字母为原始切割的SalI和XhoI位点的四核苷酸粘性末端)。为了进行比较，天然BRSVF-M2基因间序列长度为55个核苷酸。
以用于修饰cDNA末端的诱变引物通过PCR制备含HRSVG和F基因的cDNA。具体地说，用PCR扩增完整HRSV反基因组cDNA的核苷酸4692-7551(跨越从GORF的ATG到F基因终止信号末端)，设计引物以便在F基因终止信号紧后加入F-M2IG的前6个核苷酸，然后接一个拷贝的NS1基因起始信号。还设计PCR引物以便在该cDNA的两个末端加入BlpI位点和NotI位点。经PCR扩增的该cDNA片段的序列通过双脱氧核苷酸测序确定。然后将该cDNA作为NotI片段插入到上述没有G和F基因的rBRSV反基因组cDNA的特有NotI位点中。通过限制片段图谱鉴定正确的重组体，并命名为rBRSV/A2-G1F2。所编码的基因组RNA的结构示于图10C。如图所示，在该cDNA中，将G和F基因从相对于启动子的位置7和8移到位置1和2。
将编码rBRSV/A2-G1F2的反基因组RNA的质粒与编码N、P、M2-1和L支持蛋白的质粒按上述一起转染到BSRT7/5细胞中，该细胞稳定表达T7，RNA聚合酶(还参见Buchholz等，J.Virol.73：251-259，1999；Buchholz等，J.Virol.74：1187-1199，2000，分别在此引入作为参考)，然后回收感染性病毒。将回收的rBRSV/A2-G1F2病毒与rBRSV、rHRSV(也称为rA2)和rBRSV/A2就在人HEp-2细胞和牛MDBK细胞中的多循环生长效率进行比较。如上所述(还参见Buchholz等，J.Virol.74：1187-1199，2000，在此引入作为参考)，在HEp-2细胞中，rHRSV生长得比rBRSV更有效率，而rBRSV/A2病毒生长效率介于各亲本之间。如图11所示，rBRSV/A2-G1F2复制的效率与rBRSV/A2的无法区别。因此，意想不到的是，G和F基因位置的改变并没有降低体外生长效率，新结果允许有效生产RSV疫苗病毒。
在用wtHRSV或嵌合病毒rBRSV/A2或rBRSV/A2-G1F2感染的HEp-2细胞上进行免疫荧光分析。用分别对HRSVG或F蛋白特异性的两个单克隆抗体，即021/O1G和44F进行免疫荧光分析(Lopez等，J.Virol.72：6922-6928，1998；Melero等，J.Gen.Virol.78：2411-2418，1997，分别在此引入作为参考)。用每个单克隆抗体逐个进行染色。尽管该检测仅是半定量的，但已预先确定该检测能可靠地区别wtrBRSV和rBRSV/A2(后者在rBRSV骨架的正常基因组位置上携带HRSVG和F基因)。具体地说，wtHRSV产生很强广泛的免疫荧光图谱，这标志着抗原表达的有效和广泛，而rBRSV/A2产生较弱的更分散的、较低广泛的图谱(Buchholz等，J.Virol.74：1187-1199，2000，在此引入作为参考)。为rBRSV/A2-G1F2(图12)进行的可比较的分析表明该启动子移动的嵌合病毒的免疫荧光图谱与wtHRSV的很相似。该结果与G和F糖蛋白的表达增加一致。同时，与wtHRSV相比，与rBRSV/A2-G1F2有关的细胞病理效应降低，而与以前描述的rBRSV/A2的更接近(Buchholz等，J.Virol.74：1187-1199，2000，在此引入作为参考)。具体地说，rBRSV/A2和rBRSV/A2-G1F2诱导较少和较小的合胞体。
修饰前述的rBRSV/A2构建体(Buchholz等，J.Virol.74：1187-1199，2000，在此引入作为参考)以便在位置3204，介于P和M基因的基因间区域含有独特的MluI位点(图13，A组；P-MIG)。这涉及导入5个核苷酸替换。核苷酸序列位置编号是相对于完整rBRSV反基因组(Buchholz等，J.Virol.73：251-259，1999；Buchholz等，J.Virol.74：1187-1199，2000；GenBank登记号AF092942或在Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：11563-11567，1995中的完整rHRSV反基因组；分别在此引入作为参考)，涉及HRSV序列的序列位置编号有下划线。切割MluI-SalI片段，并用携带M基因的MluI-SalI片段替换。
将该反基因组质粒与编码N、P、M2-1和L支持蛋白的质粒一起转染到如前详述的稳定表达T7RNA聚合酶的BSRT7/5细胞中(Buchholz等，J.Virol.73：251-259，1999；Buchholz等，J.Virol.74：1187-1199，2000，分别在此引入作为参考)，然后回收感染性病毒。
前述实施例说明了用于生产人-牛嵌合RSV的新组合物和方法，该嵌合RSV具有适宜的生长、减毒特性和免疫原性特性以及在敏感的宿主中引发特异性或多特异性保护性免疫反应的能力。在更详细的方面，前述实施例就携带主要HRSV抗原决定基，即G和F蛋白的嵌合人—牛RSV的减毒作用说明两个极端情况。一个极端情况是wtHRSV，其在人和黑猩猩中生长自由且有毒力。另一个极端是rBRSV/A2，它也携带HRSVG和F抗原决定基。按照本发明方法构建这种新的嵌合病毒并表明在黑猩猩中是活的、安全和高度减毒的。
通过9个基因确定wtHRSV与rBRSV/A2之间的差异。按照本文方法，用HRSV基因逐步替换BRSV基因，例如放在rBRSV/A2骨架中，这样将产生具有不同减毒水平的候选疫苗病毒。本发明的一个重要方面是主要HRSV抗原决定基已表明产生用于疫苗开发的活菌株。HRSV与BRSV基因组间的近相应，以及在这些实施例中所示的转录信号的可交换性简化了基因替换以实践本发明的其他方面并开发具有所需减毒水平的疫苗病毒株。为了简化这些方法，替换能用基因对一次完成。
如本文实施例所说明的，可选择待替换在人—牛嵌合RSV中的基因，这些基因可能在现有RSV结构/功能知识的基础上发生功能或结构上地相互作用。人-牛嵌合RSV内的这些交换和其他修饰通过下列事实进一步简化，即相互作用的蛋白并列在基因组中，例如N和P核壳蛋白，M、SH、F和G被膜蛋白以及M2-1、M2-2和L聚合酶组分。因此，根据本发明，例如通过掺入2个或多个并列基因，如选自N和P，2个或多个M、SH、F和G被膜基因，或者2个或多个M2-1、M2-2和L基因，在受体或背景基因组或反基因组中一起作为异源插入或替换单位，从而得到另外候选疫苗病毒株。
例如，在rBRSV/A2中可用其HRSV对应物同时替换M和SH基因。这将导致一种病毒，其中病毒被膜蛋白(G，F，SH和M)都是HRSV的，而内蛋白都是BRSV的。接着按照需要，可用人对应物，例如N和P作为一对，NS1和NS2作为另一对，M2-1、M2-2和L作为另一组替换其他BRSV基因。每对基因的并置将会简化替换过程。同时，将单个BRSV基因插入HRSV的逆向方法，使HRSVG和F抗原决定基不被扰乱，也会产生本发明内所需的疫苗候选株。例如，人RSV中的N，P，M2-1和M基因中的一个或多个可由其牛对应物单个替换。然后按本文例证，评估回收的重组病毒在细胞培养、啮齿动物、非人灵长类中的减毒表型。用这种方式，本发明提供了用于治疗和预防各种主体中RSV的、具有所需减毒水平和保护效率的候选人—牛嵌合RSV疫苗病毒的鉴定方法。微生物保藏信息
下列材料已根据布达佩斯条约保藏在10801UniversityBoulevard，Manassas，Virginia20110-2209的美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并命名如下：质粒保藏号保藏日期cptsRSV248ATCCVR24501994年3月22日cptsRSV248/404ATCCVR24541994年3月22日cptsRSV248/955ATCCVR24531994年3月22日cptsRSV530ATCCVR24521994年3月22日cptsRSV530/1009ATCCVR24511994年3月22日cptsRSV530/1030ATCCVR24551994年3月22日RSVB-1cp52/2B5ATCCVR25421996年9月26日RSVB-1cp-23ATCCVR25791997年7月15日p3/7(131)ATCC979901997年4月18日p3/7(131)2GATCC979891997年4月18日p218(131)ATCC979911997年4月18日
序列表
序列表<110>美国政府健康及人类服务部(TheGovernmentOfTheUnitedStatesOfAmericaasrepresentedbyTheDepartmentOfHealthAndHumanServices)
乌尔苏拉·布赫霍尔茨(UrsulaBUCHHOLZ)
彼得·L·柯林斯(PeterL.COLLINS)
布赖恩·R·墨菲(BrianR.MURPHY)
斯蒂芬·S·怀特黑德(StephenS.WHITEHEAD)
机译：减毒的人牛嵌合呼吸道合胞病毒疫苗的生产。
机译：-减毒的人牛嵌合呼吸道合胞病毒疫苗的生产
机译：减毒的人牛嵌合呼吸道合胞病毒疫苗的生产
机译：接种减毒活呼吸道合胞病毒疫苗后，没有出现野生型呼吸道合胞病毒感染导致疾病增强的情况
机译：鉴定了在婴儿中高度减毒的重组减毒活呼吸道合胞病毒疫苗候选物。
机译：在黑猩猩中，减毒活的B亚组呼吸道合胞病毒疫苗候选RSV2B33F减毒并具有免疫原性，但在体内复制后表现出部分ts表型丧失。
机译：对牛疱疹病毒，牛病毒性腹泻病毒，牛呼吸道合胞病毒，牛牛呼吸道DI的牛呼吸道和腹泻病毒和Parainfluenza型3病毒的疫苗效果的荟萃分析
机译：牛T细胞对牛呼吸道合胞病毒和疫苗载体候选物的反应。
机译：嵌合牛呼吸道合胞病毒与人类呼吸道合胞病毒（HRSV）糖蛋白基因替代：对宿主范围的影响和作为活体减毒的HRSV疫苗的评估
机译：收到活型，减毒，呼吸道合胞病毒疫苗后发生野生型呼吸道合胞病毒感染的增强疾病
机译：作为潜在疫苗株的呼吸道合胞病毒和副流感病毒减毒突变体的研制