本发明涉及医学生物技术领域，具体涉及包虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在包虫病鉴别诊断中的应用。
背景技术：
包虫病(echinococcosis)是由棘球绦虫幼虫寄生于人及某些动物体内所致的一种严重的人畜共患寄生虫疾病。95％以上的包虫病例为细粒棘球蚴(echinococcusgranulosus,e.g)感染所致的囊型包虫病(cysticechinococcosis,ce)，另外一种危害很严重的是由多房棘球绦虫(echinococcusmultilocularis，e.m)感染所致泡型包虫病(alveolarechinococcosis，ae)是其幼虫寄生于人体所致的一种致死性寄生虫病，呈世界性分布。ae危害严重，几乎原发于肝脏，有“虫癌”之称，未经治疗的ae病人10年病死率高达95％。
丝氨酸蛋白酶抑制剂(serineproteaseinhibitor，serpin)是蛋白酶抑制剂超家族中的一类蛋白酶，是一类分子质量在40～50kd的蛋白酶抑制剂，它广泛存在于多细胞动物和植物界中。在植物、动物、病毒和微生物中已经发现了几百种serpin，所有的serpin都一个共同的保守结构—螺旋状反应位点(rsl)，目标蛋白酶通过裂解rsl内部p1和p1′残基的肽键，使rsl裂解。serpin参与到许多基本的生理学反应中，如血液凝固、(血)纤维蛋白溶解作用、炎症、信号级联放大、免疫应答、肿瘤抑制和荷尔蒙的传导。多房棘球绦虫(e.m)中分离到serpin基因是扁形动物门中第一个发现的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，其氨基酸序列没有n末端的糖基化位点。目前针对于棘球绦虫分泌serpin的研究还相对较少,尤其在对两型包虫病的诊断方面没有研究。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题为如何有效的对棘球绦虫泡型包虫病或/和囊型包虫病进行诊断。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了重组蛋白的下述任一种应用：
p1、所述重组蛋白在制备泡型包虫病或/和囊型包虫病诊断抗原中的应用；
p2、所述重组蛋白在制备泡型包虫病或/和囊型包虫病诊断试剂中的应用；
p3、所述重组蛋白在制备泡型包虫病或/和囊型包虫病诊断试剂盒中的应用；
p4、所述重组蛋白在制备检测泡型包虫病抗体或/和囊型包虫病抗体的试剂盒中的应用；
p5、所述重组蛋白在制备泡型包虫病或/和囊型包虫病诊断试纸中的应用；
p6、所述重组蛋白在制备检测泡型包虫病抗体或/和囊型包虫病抗体的试纸中的应用；
p7、所述重组蛋白在制备抗泡型包虫病或/和囊型包虫病抗体中的应用；
所述重组蛋白为重组蛋白remspnxj或重组蛋白regspnxj；
所述重组蛋白regspnxj是如a1)、a2)a3)或a4)的蛋白质：
a1)氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质，
a2)氨基酸序列是序列表中序列3的第8-355位的蛋白质，
a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质，
a4)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由a1)或a2)衍生的或与a1)或a2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。
所述重组蛋白remspnxj是如下b1)、b2)、b3)或b4)的蛋白质：
b1)氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质，
b2)氨基酸序列是序列表中序列4的第8-342位的蛋白质，
b3)在b1)或b2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，
b4)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由b1)或b2)衍生的或与b1)或b2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；
上述a2)的蛋白质来自于细粒棘球绦虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂(echinococcusgranulosusserineproteaseinhibitorfromxinjiang，egspnxj)，上述a1)的蛋白质名称为his-egspnxj或regspnxj，是在a2)的蛋白质的氨基末端融合编码组氨酸标签的6个氨基酸残基得到的融合蛋白。
上述b2)的蛋白质来自于多房棘球绦虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂(echinococcusmultilocularisserineproteaseinhibitorfromxinjiang，emspnxj)，上述b1)的蛋白质名称为his-emspnxj或remspnxj，是在b2)的蛋白质的氨基末端融合编码组氨酸标签的6个氨基酸残基得到的融合蛋白。
上述remspnxj蛋白由342氨基酸残基组成，预测蛋白分子量约37.9kd；上述regspnxj蛋白由355个氨基酸残基组成，预测蛋白分子量约39.3kd。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gapexistencecost，perresiduegapcost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
q1、所述生物材料在制备泡型包虫病或/和囊型包虫病诊断抗原中的应用；
q2、所述生物材料在制备泡型包虫病或/和囊型包虫病诊断试剂中的应用；
q3、所述生物材料在制备泡型包虫病或/和囊型包虫病诊断试剂盒中的应用；
q4、所述生物材料在制备检测泡型包虫病抗体或/和囊型包虫病抗体的试剂盒中的应用；
q5、所述生物材料在制备泡型包虫病或/和囊型包虫病诊断试纸中的应用；
q6、所述生物材料在制备检测泡型包虫病或/和囊型包虫病抗体的试纸中的应用；
q7、所述生物材料在制备抗泡型包虫病或/和囊型包虫病抗体中的应用；
所述生物材料为下述任一种：
h1)编码上述重组蛋白remspnxj或重组蛋白regspnxj的核酸分子；
h2)含有h1)所述核酸分子的表达盒；
h3)含有h1)所述核酸分子的重组载体或含有h2)所述表达盒的重组载体；
h4)含有h1)所述核酸分子的重组微生物、含有h2)所述表达盒的重组微生物、或含有h3)所述重组载体的重组微生物；
h5)含有h1)所述核酸分子的重组细胞系或含有h2)所述表达盒的重组细胞系；
h6)含有h1)所述核酸分子的转基因动物组织或含有h2)所述表达盒的转基因动物组织；
h7)含有h1)所述核酸分子的宿主细胞或含有h2)所述表达盒的宿主细胞。
上述生物材料中，h1)所述编码重组蛋白regspnxj的核酸分子为如下h-a1)、h-a2)或h-a3)所示的所述蛋白质的编码基因：
h-a1)编码链的编码序列是序列表中序列1的第22-1068位核苷酸的cdna分子或dna分子；
h-a2)核苷酸是序列表中序列1的cdna分子或dna分子；
h-a3)与h-a2)限定的cdna或dna分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cdna分子或dna分子。
h1)所述编码重组蛋白remspnxj的核酸分子为如下h-b1)、h-b2)或h-b3)所示的所述蛋白质的编码基因：
h-b1)编码链的编码序列是序列表中序列2的第22-1029位核苷酸的cdna分子或dna分子；
h-b2)核苷酸是序列表中序列2的cdna分子或dna分子；
h-b3)与h-b2)限定的cdna或dna分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cdna分子或dna分子；
术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于相对dna序列之编码序列的适当位置，以使调控序列指导蛋白质的表达。
本发明还涉及一种含有编码上述任一种蛋白质的核酸分子的重组细胞。重组细胞可以是原核细胞或者真核细胞，例如细菌(如大肠杆菌细胞)或酵母细胞。
上述重组蛋白和上述生物材料也属于本发明的保护范围。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了制备上述重组蛋白的方法，所述重组蛋白remspnxj按照包括如下步骤的方法制备：将所述重组蛋白remspnxj的编码基因导入受体大肠杆菌，得到表达所述重组蛋白remspnxj的重组大肠杆菌，培养所述重组大肠杆菌，表达得到所述重组蛋白remspnxj；所述重组蛋白regspnxj按照包括如下步骤的方法制备：将所述重组蛋白regspnxj的编码基因导入受体大肠杆菌，得到表达所述重组蛋白regspnxj的重组大肠杆菌，培养所述重组大肠杆菌，表达得到所述重组蛋白regspnxj。
上述方法中，所述重组蛋白regspnxj的编码基因为如下a1)、a2)或a3)所示的基因：
a1)编码链的编码序列是序列1所示的dna分子；
a2)编码链的编码序列是序列1的第22-1068位所示的dna分子；
a3)与a1)或a2)限定的dna分子具有80％以上的同一性且编码所述棘球绦虫serpin重组蛋白regspnxj。
所述重组蛋白remspnxj的编码基因为如下b1)、b2)或b3)所示的基因：
b1)编码链的编码序列是序列2所示的dna分子；
b2)编码链的编码序列是序列2的第22-1029位所示的dna分子；
b3)与b1)或b2)限定的dna分子具有80％以上的同一性且编码所述棘球绦虫serpin重组蛋白remspnxj；
上述方法中，表达所述重组蛋白regspnxj的重组大肠杆菌为将pet-30a-egspnxj导入大肠杆菌bl21(de3)得到的表达氨基酸序列是序列3的所述棘球绦虫serpin重组蛋白regspnxj的重组微生物，所述pet-30a-egspnxj为将载体pet-30a(+)的ndei和hindiii识别位点间的小片段替换为序列1第4-1068位所示的dna片段得到的重组载体。
表达所述重组蛋白remspnxj的重组大肠杆菌为将pet-30a-emspnxj导入大肠杆菌bl21(de3)得到的表达氨基酸序列是序列4的所述棘球绦虫serpin重组蛋白remspnxj的重组微生物；所述pet-30a-emspnxj为将载体pet-30a(+)的ndei和hindiii识别位点间的小片段替换为序列2第4-1029位所示的dna片段得到的重组载体。
含有上述重组蛋白和/或上述生物材料的下述任意一种产品也属于本发明的保护范围：
d1、泡型包虫病或/和囊型包虫病的诊断抗原产品；
d2、泡型包虫病或/和囊型包虫病的诊断试剂；
d3、泡型包虫病或/和囊型包虫病的诊断试剂盒；
d4、泡型包虫病或/和囊型包虫病的诊断试纸；
d5、泡型包虫病或/和囊型包虫病的抗体；
d6、预防和/或治疗泡型包虫病或/和囊型包虫病的疫苗或药品。
上述产品中，所述泡型包虫病或/和囊型包虫病为下述任一种：
e1)、哺乳动物泡型包虫病或/和囊型包虫病，
e2)、灵长目泡型包虫病或/和囊型包虫病，
e3)、人泡型包虫病或/和囊型包虫病。
本发明的实施例中使用制备的棘球绦虫serpin重组蛋白remspnxj作为包虫病抗原对泡型包虫病ae患者的诊断的敏感性为92.5％,分别比常用诊断两型包虫病的抗原em18和棘球绦虫天然抗原b(nagb)的敏感性高出4％和13.5％；对肝脏性疾病对照(ck-l)和健康人群对照(ck-h)的检测阳性率均为0％，表明remspnxj重组蛋白诊断的特异性为100％。因此本发明所制备的remspnxj重组蛋白可特异性的作为泡型包虫病的诊断抗原，能够识别病人血清，敏感性为92.5％，特异性为100％，优于目前诊断泡型包虫病的常用抗原em18和nagb。
附图说明
图1为egspnxj、emspnxj基因的pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳鉴定。m:marker显示的标准分子质量条带分布，1为egspnxj基因的目的条带分布，2为emspnxj基因的目的条带分布。
图2为egspnxj、emspnxj在棘球绦虫不同发育阶段的基因水平表达。p+(protoscolex，psc)代表棘球绦虫幼虫，gl(germinallayer,gl)代表棘球绦虫包囊生发层，aw(adultworm，aw)代表棘球绦虫成虫。
图3为重组蛋白regspnxj和remspnxj免疫印迹实验(westernblotting)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)实验。a中sds-page中泳道1为bsa(2ug)，泳道2为regspnxj(1ug)，m1为sds-pagemarker；a中westernblotting中m2为westernblottingmarker，泳道2为regspnxj(1ug)；b中sds-page中泳道1为bsa(1.5ug)，泳道2为remspnxj，m1为sds-pagemarker；b中westernblot中m2为westernblottingmarker，泳道2为remspnxj(1ug)。
图4为多克隆抗体与重组抗原的识别。m：marker，1：regspnxj(50ng)，2：remspnxj(50ng)。
图5为egspnxj、emspnxj在棘球绦虫不同发育阶段的蛋白水平表达。a中1代表egpsc(细粒棘球绦虫原头蚴)，2代表eggl(细粒棘球绦虫包囊生发层)，3代表egaw(细粒棘球绦虫成虫)；b中1代表empsc(多房棘球绦虫原头蚴)，2代表emgl(多房棘球绦虫包囊生发层)，β-actin为内参蛋白；c中纵坐标为egspnxj、emspnxj在棘球绦虫不同发育阶段中蛋白的相对表达量，egpsc代表细粒棘球绦虫原头蚴，empsc代表多房棘球绦虫原头蚴，eggl代表细粒棘球绦虫包囊生发层，emgl代表多房棘球绦虫包囊生发层,egaw代表细粒棘球绦虫成虫。
图6为egspnxj、emspnxj抗原与不同病人血清的识别。a代表ae病人血清，b代表ce病人血清，c代表为肝病病人血清，d代表健康人血清；1代表重组蛋白remspnxj，2代表重组蛋白regspnxj。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
试验所得数据用excel软件处理,并用graphpadprism软件中的单因素方差分析程序对数据进行方差分析和多重比较。
实施例1、egspnxj、emspnxj目的基因的扩增及测序鉴定
一、egspnxj基因和emspnxj基因的扩增及鉴定1.根据genbank发表的预测而得eg-serpina基因egspnxj(egr_03125)基因和em-serpinb基因emspnxj(emuj_001193100.1)基因序列设计扩增全长基因的上下游引物，由上海生工公司合成。引物序列见表1。
表1引物序列设计
2.cdna的获取
从病羊肝脏获得原头蚴(protoscoleces，psc)沉淀约100μl，命名为egpsc，从保种沙鼠体内获得原头蚴(protoscoleces，psc)沉淀约100μl，命名为empsc，分别于冻存管中置于液氮中。经过高压处理的无菌研钵中不断加入液氮使其冷却，将上述标本放入研钵中快速研磨，整个过程防止组织解冻变软，可适当补充液氮；将研磨充分的egpsc和empsc放到新的无rna酶的1.5mlep管中，加入1mltrizol，剧烈震动后室温静置10min，加入200μl氯仿，充分震荡混匀，室温放置10min，13500g(rcf)4℃离心15min；小心吸取上层水相液体400μl于新的无rna酶1.5mlep管中，加入等体积的异丙醇，上下轻轻颠倒混匀，室温放置15min，13500g(rcf)4℃离心10min；轻轻吸掉上清，沉淀中加入1ml75％酒精，轻轻吹洗沉淀，13500g(rcf)4℃离心10min；沉淀在生物安全柜中自然晾干至半透明状，分别加入30～50μlrnasefreedh2o溶解得到egpsc和empsc的总rna；充分溶解的rna使用核酸蛋白定量仪检测浓度。
反转录：根据takara反转录试剂盒说明书操作如下：
1)去除基因组dna，反应体系如表2和反应程序如下，得到去除基因组dna的rna；
表2去除基因组dna的反应体系
2)反转录反应，反应体系如表3和反应程序如下，得到cdna；
表3反转录的反应体系
反应总体积：20μl，短暂离心混匀后37℃15min，85℃5s后终止反应，得到egpsc和empsc的cdna。样本-20℃保存备用。
3.目的基因的扩增及测序鉴定
以egpsc和empsc的cdna为模板分别分别使用表1中的两对引物f1和r1、f2和r2扩增目的基因棘球绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因egspnxj和emspnxj。反应体系20μl：2×powertaqpcrmastermix10μl，上下游引物各0.4μl(10μm)，cdna2μl，rnasefreedh2o7.2μl。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃总延伸7min。pcr产物取5μl，dl2000作为dna分子质量标记，使用0.5×电泳缓冲液，1％琼脂糖凝胶电泳，电压90v，电泳25min，凝胶成像仪观察结果并拍照，结果如图1所示。条带1为egspnxj,条带2为emspnxj。其余产物送上海生工公司测序。测序结果表明egspnxj的pcr产物含有编码链的编码序列是序列表中序列5的egspnxj(egspnxj基因)；emspnxj的pcr产物含有编码链的编码序列是序列表中序列6的emspnxj(emspnxj基因)。
实施例2qrt-pcr法检测基因表达
为了检测egspnxj、emspnxj基因在棘球绦虫不同发育阶段的基因的表达水平，分别选择病羊肝脏获得原头蚴egpsc和保种沙鼠体内获得原头蚴empsc的不同发育阶段的样品提取rna，并反转录成cdna，cdna的获得方法同实施例1。所述不同发育阶段包括棘球绦虫幼虫阶段p+，棘球绦虫包囊生发层阶段gl，棘球绦虫成虫阶段aw。
1.根据基因序列设计qrt-pcr扩增引物，以eif3作为内参基因(表4)
表4qrt-pcr引物
2.分别以获得的eg和em不同发育阶段的cdna为模板，根据quantinovatmgreenpcrkit说明书进行qrt-pcr，反应体系为20μl(表5)：
表5qrt-pcr反应体系
3.每个样本设置三个重复，结果采用2-δδct的方法计算目的基因的相对表达量。
结果如图2所示，图2中a为egspnxj在细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达情况，在aw阶段表达量相对量较高。b为emspnxj在多房棘球绦虫不同发育阶段的表达情况，在psc(p+)阶段高表达。表明包虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在棘球绦虫的发育过程中有着重要的作用。
实施例3egspnxj和emspnxj重组蛋白regspnxj和remspnxj的表达与纯化
1.pet30a-egspnxj、pet30a-emspnxj的构建根据实施例1测序得到的egspnxj、emspnxj基因编码序列及蛋白表达序列分析和pet30a(+)原核表达载体上的多克隆位点，设计并合成特异性引物用于扩增egspnxj、emspnxj目的基因片段，为了便于定向克隆，在上、下游引物的5’端分别引入了一个酶切位点ndei/hindiii，引物序列为(单划线标注出代表酶切位点)：
egspnxj
f6:5’-catatgcatcaccatcatcatcacgaaacaagggaggaattgg-3’
r6:5’-aagcttctacttggattcgggatgaacaacatgacccatg-3’
emspnxj
f7:5’-catatgcatcaccatcatcatcacgaaacaagggaggaattgg-3’
r7:5’-aagcttctacttggattcgggatgaacaacatgacccatg-3’
egspnxj和emspnxj基因的pcr扩增产物和pet30a(+)均使用ndei和hindiii酶切处理：
表6酶切体系
egspnxj基因的pcr扩增产物与pet30a(+)经ndei和hindiii双酶切后，经过切胶回收纯化后，16℃条件下连接过夜；emspnxj基因的pcr扩增产物与pet30a(+)经ndei和hindiii双酶切后，经过切胶回收纯化后，16℃条件下连接过夜。反应体系：
表7连接体系
50℃水浴25min，放置2～3min使温度降低，进行转化及菌液涂布实验。
将连接产物转化到e.colitop10克隆菌株中并涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb平板上，37℃温育过夜。随机挑选平板中单克隆菌落，提取质粒，进行pcr和双酶切鉴定并测序。
测序结果表明egspnxj基因与载体pet-30a(+)的连接产物是用序列表中序列表1的第4-1068位所示的dna片段替换pet-30a(+)的ndei和hindiii识别位点间的片段(小片段)，保持pet-30a(+)的其它序列不变得到的重组表达载体，命名为pet30a-egspnxj。pet30a-egspnxj是含有his标签的his-egspnxj基因，his-egspnxj基因的核苷酸序列是序列表中序列1，编码序列3示的蛋白质his-egspnxj，简称regspnxj。
emspnxj基因与载体pet-30a(+)的连接产物是用序列表中序列表2的第4-1029位所示的dna片段替换pet-30a(+)的ndei和hindiii识别位点间的片段(小片段)，保持pet-30a(+)的其它序列不变得到的重组表达载体，命名为pet30a-emspnxj。pet30a-emspnxj是含有his标签的his-emspnxj基因，his-emspnxj基因的核苷酸序列是序列表中序列2，编码序列4所示的蛋白质his-emspnxj，简称remspnxj。
2.regspnxj、remspnxj蛋白的纯化
将构建好的原核表达质粒pet30a-egspnxj和pet30a-emspnxj分别转化到大肠杆菌bl21(de3)(sigma)感受态细胞中，冰浴30min。将上述混合物置于42℃水浴箱中90s后迅速取出冰浴2min，整个过程中勿摇动。加入1ml液体培养基，37℃，200rpm，恒温摇床孵育1h。取400μl培养物均匀涂布到含50μg/ml的卡那霉素lb平板上，之后倒置于37℃培养箱过夜。将含有pet30a-egspnxj的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/pet30a-egspnxj，bl21(de3)/pet30a-egspnxj能表达序列表中序列3所示的蛋白质his-egspnxj，即regspnxj蛋白。将含有pet30a-emspnxj的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/pet30a-emspnxj，bl21(de3)/pet30a-emspnxj能表达序列表中序列4所示的蛋白质his-emspnxj，即remspnxj蛋白。
从转化的平板中(分别为培养bl21(de3)/pet30a-egspnxj和bl21(de3)/pet30a-emspnxj的平板)挑选单克隆，接种到4ml含50μg/ml的硫酸卡那霉素lb培养基中，待培养至od600为0.6-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.2mm的异丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)，之后分别置于15℃诱导16h进行诱导表达，分别得到bl21(de3)/pet30a-egspnxj诱导表达的菌液和bl21(de3)/pet30a-emspnxj诱导表达的菌液。
之后将上述诱导表达的菌液于4℃、3500g(rcf-离心力)离心10min，收集菌体。其中regspnxj蛋白为包涵体表达，remspnxj为可溶性表达。从bl21(de3)/pet30a-egspnxj诱导表达的菌液中得到含有蛋白质his-egspnxj即regspnxj的包涵体，从bl21(de3)/pet30a-emspnxj诱导表达的菌液中得到含有蛋白质his-emspnxj即remspnxj的上清液。包涵体通过亲和层析纯化regspnxj：bl21(de3)/pet30a-egspnxj诱导表达的菌体采用20mmpb(ph7.2)，300mmnacl，20mmimidazole含1％tritonx-100，1mmdtt，1mmpmsf高压裂解和超声裂解，超声结束后，4℃，38500g(rcf)离心20min，收集沉淀。该沉淀为蛋白质regspnxj的包涵体。包涵体采用20mmpb(ph7.2)，300mmnacl含1％tritonx-100，2mmedta，5mmdtt洗涤后，以20mmpb(ph7.2)，300mmnacl，8murea，20mmimidazole缓冲液溶解包涵体，同时平衡ni-ida柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白regspnxj。
上清中亲和层析纯化remspnxj(整个纯化过程在低温下操作)：bl21(de3)/pet30a-emspnxj诱导表达的菌体收集上清液，结果从bl21(de3)/pet30a-emspnxj诱导表达的菌液中得到含蛋白质remspnxj上清液。采用20mmpb(ph7.2)，300mmnacl，20mmimidazole含1％tritonx-100，1mmdtt，1mmpmsf高压裂解和超声裂解，超声结束后，4℃，38500g(rcf)离心20min，收集上清液，该上清液中含蛋白质remspnxj。同时以20mmpb(ph7.2)，300mmnacl，20mmimidazole缓冲液平衡ni-ida亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液从上清液中洗脱目标蛋白remspnxj。
经ni-ida亲和层析纯化分析，收集纯度相对较高的目标蛋白，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液[1×pbs(ph7.4)，4mmgsh，0.4mmgssg，0.4ml-arginine，1murea]中复性。复性后目标蛋白最终透析于储存液1×pbs(ph7.4)溶液约6～8h，得到含regspnxj的液体和含remspnxj的液体。透析复性结束后，上清用0.22μm滤器过滤后分装，分别得到纯化后的大小为39.3kd的目的蛋白regspnxj和大小为37.9kd的目的蛋白remspnxj。
regspnxj和remspnxj蛋白的定量：使用bradford方法检测蛋白浓度，先配制1mg/ml牛血清白蛋白(bsa)母液，再向母液中加入磷酸缓冲液(pbs)配制一组浓度分别为1.0mg/ml、0.8mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml的bsa溶液各100ul，将配置好不同浓度蛋白标准溶液30ul加到1mlbradford工作液中，轻轻颠倒混匀，静止5min。将适量体积的样品用pbs稀释到30ul,加入1mlbradford工作液,轻轻颠倒混匀，静止5min。将反应好的溶液取300ul加入到96孔板的样品孔中，使用酶标仪测定a595nm吸光度，根据标曲计算得出regspnxj的浓度2.28mg/ml及remspnxj的浓度3.54mg/ml的浓度,用pbs稀释定量为1mg/ml的工作浓度。
实施例4regspnxj、remspnxj重组蛋白免疫动物制备多克隆抗体
1.选取balb/c雌性小鼠10只，体重18-20克/只，随机分组(每组5只)。
分别将150μg重组蛋白(实施例2中得到的含regspnxj的液体150ul和实施例2中得到的含remspnxj的液体150ul混匀后获得包含150μgregspnxj包含150μgremspnxj的液体150ul)和等量150ul的弗氏佐剂混合吸入离心管内，利用搅拌器与研磨杵，使佐剂和抗原溶液充分混合在一起，形成油包水的乳剂，整个过程冰上操作。免疫时先用75％酒精对小鼠腹部消毒，然后用无菌注射器进行注射。每只小鼠每次注射0.1ml，即每只小鼠的每次的免疫剂量均为25μgregspnxj和25μgremspnxj；免疫途径为前三次为腹部皮下多点注射，第四次为腹腔注射。首次时用重组蛋白加等量弗氏完全佐剂(fca)的混合乳化剂进行腹腔皮下免疫。隔一周后进行二次免疫。在第2次、第3次和第4次免疫时用重组蛋白加等量弗氏不完全佐剂(ica)增强免疫。在首次免疫前尾尖采血10μl全血溶到90μlpbs中作为阴性对照。末次免疫后尾部静脉采血检测血清特异性抗体水平。将血液在4℃冰箱静置过夜，3000g(rcf)离心10min，分离血清，-20℃保存。
2.elisa检测血清抗体效价
将抗原(regspnxj、remspnxj)用包被液配制抗原浓度为0.5μg/ml，加入elisa板的孔里，每孔100μl，放入湿盒中4℃冰箱过夜。弃掉抗原，用pbs洗3次，5min/次，350μl/孔。按照300μl/孔封闭液进行封闭，37℃孵育2h后pbst洗3次，5min/次，350μl/孔。将步骤1中得到的鼠抗血清(鼠抗regspnxj血清及鼠抗remspnxj血清)和阴性小鼠血清用pbst进行倍比稀释(1:1×104～1:128×104)，100μl/孔，37℃孵育2h。弃掉一抗后，pbst洗板3次。将二抗(山羊抗鼠igggoatantimouseigghrp，a90-116p，blthyl)用pbst按1:5000稀释，100μl/孔，37℃孵育1h。弃掉二抗，pbst洗板3次。用已配好的底物显色液进行显色，100μl/孔，37℃孵育15～30min。用酶标仪在od405nm波长下进行读值。
免疫后小鼠血清效价达到免疫前血清效价的2倍即可认为达到了最高效价。我们将随机分组的5只小鼠随机用耳标打孔器标记其名称分别为左上、左下、右上、右下、无。结果如表8所示，重组蛋白regspnxj和remspnxj蛋白免疫后的小鼠血清效价在稀释32万倍以后仍然可达到最高效价的指标，因此可以认为我们获得了重组蛋白regspnxj和remspnxj的高免血清。
表8regspnxj、remspnxj蛋白免疫小鼠后检测血清效价
因此，通过以上试验表明：regspnxj、remspnxj免疫小鼠后可得到高免血清。
1.重组蛋白抗原的质量鉴定
2.多克隆重组抗体对棘球绦虫不同发育阶段自然抗原的反应性
2.1多克隆抗体与重组抗原的识别
实施例3中得到的鼠抗regspnxj和鼠抗remspnxj血清，分别与重组蛋白regspnxj和remspnxj的识别结果如图4所示。图4中1代表regspnxj，2代表remspnxj通过westernblotting实验发现，抗regspnxj血清能够有效识别重组蛋白regspnxj；抗remspnxj血清能够有效识别重组蛋白remspnxj。且反应条带单一，显示反应特异性，
2.2多克隆抗体与棘球绦虫不同发育阶段自然抗原的反应
使用ripa裂解液(solarbio公司,r0020)参照试剂说明书提取囊型包虫和泡型包虫两种包虫不同阶段的蛋白。实施例4中得到的鼠抗regspnxj血清(图5中egspnxj所示)、鼠抗remspnxj1血清(图5中emspnxj所示)(1:600稀释)和正常鼠血清(图5中normal所示)(1:600稀释)作为一抗，实施例4中的山羊抗鼠(带有辣根过氧化物酶(hrp)标记)(1:5000稀释)作为二抗进行westernblotting,利用组成性表达蛋白β-actin作为与多克隆抗体结合的内参。实验方法同重组蛋白抗原性鉴定。
结果如图5所示。图5中a中条带1为egpsc，条带2为eggl(细粒棘球绦虫包囊生发层)，条带3为egaw(细粒棘球绦虫成虫)。b中条带1为empsc,条带2为emgl(多房棘球绦虫包囊生发层)。两种包虫不同阶段的蛋白分别与抗regspnxj血清(图5中egspnxj所示)、抗remspnxj血清(图5中emspnxj所示)和正常鼠血清(图5中normal所示)结合产生条带的情况结果表明，两型包虫egpsc和empsc阶段的蛋白均可与实施例4中得到的鼠抗regspnxj血清和鼠抗remspnxj1血清结合产生条带，而两型包虫不同阶段的蛋白与正常鼠血清均不能结合产生条带，此外，egaw阶段的棘球绦虫蛋白也可与实施例4中得到的鼠抗regspnxj血清和鼠抗remspnxj1血清结合产生条带。以上结果说明egspnxj、emspnxj均在两型包虫病中psc阶段高表达，实施例4中得到的多克隆抗体能有效检测两种包虫不同阶段egspnxj和emspnxj蛋白的表达情况。c为使用灰度扫描后进行统计学分析后说明egspnxj、emspnxj均在两型包虫病中psc阶段高表达且具有统计学意义。
因此，通过以上试验表明：实施例4中使用重组蛋白regspnxj、remspnxj制备的多克隆抗体可以识别棘球绦虫不同发育阶段的自然抗原。
实施例6regspnxj、remspnxj抗原与不同病人血清的识别
分别取ae病人、ce病人、肝病病人及健康人群的混合血清(1:100稀释)作为一抗，hrp标记的驴抗人igg(1:5000稀释)(donkeyantihumanigghrp，ab102410，abcam)作为二抗用于westernblotting反应，实验操作同重组蛋白抗原性鉴定，使用过氧化物酶底物显色法显色，加ddh2o终止反应。
结果如图6所示，a为ae病人血清，b为ce病人血清，c为肝病病人血清，d为健康人血清。条带1为重组蛋白regspnxj,条带2为重组蛋白remspnxj。重组蛋白regspnxj和remspnxj均不与健康人血清发生反应，regspnxj与ae病人、ce病人血清反应得到39.3kda的目的条带，remspnxj仅与ae病人血清反应得到37.9kda的目的条带。
检测血样均经影像学诊断和手术确诊的ae(多房棘球绦虫感染所致泡性包虫病)患者血清54份，ce(细粒棘球绦虫感染所致囊型包虫病)患者血清47份，肝脏性疾病患者血清(非包虫病)31例，健康体检人群血清40份，由新疆医科大学第一附属医院新疆重大疾病资源样本库提供。所有患者均签署知情同意书。其中肝脏性疾病患者(简称为ck-l)和健康体检人群(简称为ck-h)作为阴性对照。
所用抗原包括实施例2的重组蛋白抗原regspnxj和remspnxj，以及目前诊断两型包虫病的常用抗原em18(本实验室制备，孟存仁,张琼,张朝霞.em18抗原elisa法对泡球蚴病诊断价值的系统评价.中国循证医学杂志,2009.9(07):p.783-787.)及nagb(本实验室制备李艳红,孟存仁,张朝霞.抗原belisa法对细粒棘球蚴病诊断价值的meta分析.中国循证医学杂志,2013.13(03):p.332-338.)。
采用间接elisa法进行检测上述4种抗原对两型包虫病的诊断效果。分别使用上述4种抗原进行包被，包被浓度为0.5μg/ml，待测血清(ae患者血清、ce患者血清、ck-l患者血清和ck-h血清)均按1:100稀释，其中ae患者血清和ce患者血清中含有抗包虫病的抗体，ck-l和ck-h中不含抗包虫病的抗体；二抗为羊抗人igg4-hrp(southernbiotechcatno9190-05)(1:4000稀释)，底物显色液为abts，若上述4种抗原能与ae患者血清、ce患者血清中的抗包虫病的抗体(一抗)结合，则二抗与一抗结合后底物会显色。用酶标仪测定每孔的od405nm值。免疫诊断价值评价(以roc曲线法确定cut-off值为阴性对照平均值，od405nm值为cut-off值2.1倍及以上的患者被认为是诊断为包虫病的患者)，结果见表9所示。
表9、remspnxj对两型包虫病的特异性抗体血清学诊断的结果
remspnxj
em18
nagb
regspnxj
序列表
<110>新疆医科大学第一附属医院
<120>包虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在包虫病鉴别诊断中的应用
<130>gncsq201956
<160>6
<170>patentinversion3.5
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<211>1068
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<400>1
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<210>6
<211>1065
<213>多房棘球绦虫（echinococcusmultilocularis）
<400>6
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