本领域涉及糖苷水解酶，例如α-l-岩藻糖苷酶，并且具体地涉及它们在预防和/或治疗动物中的肠道病原体感染和/或腹泻中的用途。
背景技术：
抗生素在治疗人类和动物方面的使用导致了抗微生物抗性，现在已成为全球主要的健康威胁。因此，正在寻求开发抗生素替代品以解决该全球健康问题。
消费者非常关心抗生素在动物饲料中的广泛使用。零售商和农民将需要响应于消费者对无抗生素肉类的偏好的这种变化而进行改变。
产肠毒素大肠杆菌(e.coli)(etec)是幼畜(例如猪和小牛)中最常见类型的大肠杆菌病，通常表现为严重的水泻。这也是旅行者中腹泻(“旅行者腹泻”)和发展中国家儿童腹泻的重要原因。
已知几乎所有的etec细菌都通过蛋白质表面附属物(菌毛(fimbriae和pili))或通过非菌毛蛋白粘附于小肠上皮细胞上的受体。此外，它们分泌蛋白毒素(肠毒素)以减少吸收并增加小肠上皮细胞的液体和电解质分泌。肠毒素局部作用于肠细胞。动物中etec感染和腹泻的流行病学、发病机理、诊断和预防的细节可见于以下文献中：nagy和fekete(1999)，vetres.[兽医研究]30:259-84。
更具体地说，已经发现etec和肠毒血症(eteec)大肠杆菌(f18+e.coli)表达f18菌毛，所述f18菌毛在小肠中定殖并且在非常年幼的动物(例如仔猪和小牛)中引起腹泻，并且其是第三世界中人类死亡的一个主要原因。通过防止这类病原体对动物肠细胞的菌毛粘附，可以建立对这类疾病的保护。因此，有必要找到新的替代方法来预防和治疗病原体感染，例如etec。
技术实现要素：
在一方面，公开了一种预防和/或治疗动物肠道病原体感染和/或腹泻的方法，其中所述病原体感染和/或腹泻由能够结合动物肠细胞的病原体引起，其中所述病原体的结合依赖于病原体结合位点的存在，所述病原体结合位点具有被至少一个α-1,2-l-岩藻糖部分取代的至少一个聚糖结构，所述方法包括向所述动物施用有效量的能够从所述病原体结合位点去除至少一个α-1,2-l-岩藻糖部分的糖苷水解酶。在一些方面，所述糖苷水解酶是α-l-岩藻糖苷酶。
在另一方面，单独地或者与能够(a)将血型a抗原转化为血型h抗原或(b)将血型b抗原转化为血型h抗原的酶组合，所述α-l-岩藻糖苷酶能够从含有聚糖的结构中除去末端α-1,2-连接的岩藻糖基团。更具体地，所述α-l-岩藻糖苷酶选自糖苷水解酶家族95(gh95)和糖苷水解酶家族29(gh29)。
在第三方面，所述病原体是表达f18菌毛的大肠杆菌。
在第四方面，所公开的方法进一步包括向所述动物单独地或与至少一种蛋白酶组合施用有效量的与至少一种直接饲喂的微生物组合的α-l-岩藻糖苷酶，并且此外，所述α-l-岩藻糖苷酶是包入胶囊内的。
在第五方面，所公开的方法进一步包括，所述α-l-岩藻糖苷酶(无论包入胶囊内的还是未包入胶囊内的)和/或所述直接饲喂的微生物和/或所述蛋白酶在动物饲料或预混物中施用。此外，所述α-l-岩藻糖苷酶(无论包入胶囊内的还是未包入胶囊内的)都可以是呈用于动物饲料或预混合物的颗粒形式。
在第六方面，公开了一种用于预防和/或治疗患有肠道病原体感染和/或腹泻的动物的组合物，其中所述病原体感染和/或腹泻由能够结合动物肠细胞的病原体引起，其中所述病原体的结合依赖于病原体结合位点的存在，所述病原体结合位点具有被至少一个α-1,2-l-岩藻糖部分取代的至少一个聚糖结构，所述预防和/或治疗包括向所述动物施用有效量的能够从所述病原体结合位点去除至少一个α-1,2-l-岩藻糖部分的糖苷水解酶。在一些方面，所述糖苷水解酶是α-l-岩藻糖苷酶。
该α-l-岩藻糖苷酶能够单独地或者与能够(a)将血型a抗原转化为血型h抗原或(b)将血型b抗原转化为血型h抗原的酶组合从含有聚糖的结构中除去末端α-1,2-连接的岩藻糖基团。此外，所述α-l-岩藻糖苷酶选自糖苷水解酶家族95(gh95)和糖苷水解酶家族29(gh29)。
在第七方面，所述病原体是表达f18菌毛的大肠杆菌。
在第八方面，所公开的组合物进一步包含至少一种直接饲喂的微生物(单独地或与至少一种蛋白酶组合)，其中所述α-l-岩藻糖苷酶可以或不可以被包入胶囊内，并且可以用于动物饲料或预混物中。
在第九方面，所公开的组合物可以包含α-l-岩藻糖苷酶(无论是否包入胶囊内)，至少一种直接饲喂的微生物和/或至少一种蛋白酶作为饲料或预混物向动物施用，并且所述α-l-岩藻糖苷酶可以呈用于动物饲料或预混物中的颗粒形式。
附图说明
图1a描绘了p3jm的示例性质粒图谱。
图1b描绘了p2jm的示例性质粒图谱。
图2描绘了pgxt-goi的示例性质粒图谱。
图3是通过水解2'-岩藻糖基乳糖的在粗制培养上清液中的α-1,2-岩藻糖苷酶活性的图。
图4是ph对岩藻糖苷酶对2'-岩藻糖基乳糖的活性的影响的图。
图5是温度对岩藻糖苷酶对2'-岩藻糖基乳糖的活性的影响的图。
图6a是在胃蛋白酶存在和不存在下测定的岩藻糖苷酶的图。
图6b是在胃蛋白酶存在和不存在下测定的岩藻糖苷酶的图。
图7是猪胃黏蛋白(ii型)在ph6.8和37℃下的水解图。
图8是h抗原三糖(i型)在ph6.8和37℃下的水解图。
图9描绘了ab和o抗原的末端结构。
图10描绘了abo血型抗原的结构基础。
图11描绘了岩藻糖苷酶从来自仔猪小肠的组织样品中诱导释放岩藻糖。
具体实施方式
引用的所有专利、专利申请和出版物均通过引用将其全文结合在此。
在本公开中，使用了许多术语和缩写。除非另有特别说明，以下定义适用。
在元素或组分前的冠词“一个/种(a/an)”和“所述(the)”在关于所述元素或组分的实例(即，出现)的数目旨在是非限制性的。因此，“一个/种(a/an)”和“所述(the)”应理解为包括一个/种或至少一个/种，并且元素或组分的单数词语形式还包括复数，除非该数字明显意指单数。
术语“包含”意指如权利要求中所提及的说明的特征、整数、步骤或组分的存在，而并未排除一个或多个其他特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。术语“包含”旨在包括术语“基本上由…组成”和“由…组成”所涵盖的实施例。类似地，术语“基本上由…组成”旨在包括由术语“由…组成”涵盖的实施例。
在存在的情况下，所有的范围都是包含性的和可组合的。例如，当列举“1至5”的范围时，所列举的范围应解释为包括“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等范围。
如在此所用的，关于数值，术语“约”是指数值的+/-0.5的范围，除非术语在上下文中另有具体定义。例如，短语“约6的ph值”是指ph值为从5.5至6.5，除非ph值另有具体定义。
在本说明书全文中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，如同此类较低数值限度在此明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，如同此类较高数值限度在此明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在此全部明确写出一样。
术语“糖苷水解酶”可与“糖苷酶”和“糖基水解酶”互换使用。糖苷水解酶有助于复合糖(多糖)中糖苷键的水解。与糖基转移酶一起，糖苷酶形成用于糖苷键合成和破坏的主要催化机制。糖苷水解酶被分类为ec3.2.1，作为催化o-或s-糖苷水解的酶。糖苷水解酶也可根据水解反应的立体化学结果进行分类：因此它们可被分类为构型保持酶(retainingenzyme)或构型翻转酶(invertingenzyme)。糖苷水解酶也可分为外切或内切作用，取决于它们分别作用于(通常非还原)寡糖/多糖链的末端还是中间。糖苷水解酶也可以通过基于序列或结构的方法进行分类。它们通常以它们所作用的底物命名。
术语“糖基转移酶”是指催化单糖之间糖苷键形成的酶。
术语“α-l-岩藻糖苷酶”、“α-l-岩藻糖苷岩藻糖水解酶”和“α-岩藻糖苷酶”在此可互换使用，并且是指ec类别号3.2.1.51中的酶，其将l-岩藻糖从α-l-岩藻糖苷中除去。α-l-岩藻糖苷酶是在各种生物体和哺乳动物中发现的外切糖苷酶。α-l-岩藻糖苷酶已被分成两个不同的糖苷水解酶家族：使用保持机制催化水解的α-l-岩藻糖苷酶属于熟知的糖苷水解酶家族29(gh29)。使用翻转机制催化水解的α-l-岩藻糖苷酶属于糖苷水解酶家族95(gh95)。
术语“α-1,2-l-岩藻糖苷酶”、“杏仁杏仁酪岩藻糖苷酶ii”、“α-2-l-岩藻糖吡喃糖基-β-d-半乳糖苷岩藻糖水解酶”和“α-(1->2)-l-岩藻糖苷酶”在此可互换使用，并且是指ec类别号3.2.1.63中的酶，其催化通过1,2-α键连接到d-半乳糖残基的非还原性末端l-岩藻糖残基的水解。术语“α-1,3-l-岩藻糖苷酶”、“杏仁杏仁酪岩藻糖苷酶i”和“α-3-l-岩藻糖-n-乙酰葡糖胺基-糖蛋白岩藻糖水解酶”在此可互换使用，并且是指ec类别号3.2.1.111中的酶，其水解α-l-岩藻糖和n-乙酰葡糖胺残基之间的(1->3)-键。
术语“α-1,6-l-岩藻糖苷酶”、“α-l-岩藻糖苷酶”和“1,6-l-岩藻糖-n-乙酰-d-葡糖胺基糖肽岩藻糖水解酶”在此可互换使用，是指ec类别号3.2.1.127中的酶，其水解α-l-岩藻糖和n-乙酰-d-葡糖胺残基之间的(1->6)-键。
术语“去岩藻糖基化(defucosylate)”和“去岩藻糖基化(defucosylating)”可互换使用，并且是指能够从含聚糖结构中去除岩藻糖基基团的酶。
术语“聚糖”和“多糖”在此可互换地使用。聚糖是指多糖或寡糖，或糖缀合物的碳水化合物部分，如糖蛋白、糖脂或蛋白多糖，即使所述碳水化合物仅为寡糖。聚糖可以是单糖残基的同聚物或杂聚物。它们可能是线性或支链分子。可以发现，如在糖蛋白和蛋白多糖中一样，聚糖附接于蛋白质。一般来说，它们可以在细胞的外表面找到。o-和n-连接的聚糖在真核生物中非常常见，但是也可以在原核生物中发现，尽管不太常见。
如在此所用的术语“含有聚糖的结构”是指聚糖可以以任何方式附接于其上的任何结构，如蛋白质、脂质等。
术语“含n-乙酰-半乳糖胺的部分”是n-乙酰-半乳糖胺所附接的结构。这类结构包括但不限于碳水化合物等。
如在此所用的术语“fut1”是指α-1,2-岩藻糖基转移酶1。岩藻糖基转移酶是将l-岩藻糖从gdp-岩藻糖供体底物转移至受体底物的酶。所述受体底物可以是另一种糖，例如在n-连接的糖基化的情况下将岩藻糖转移至核心glcnac糖，或者在通过o-岩藻糖基转移酶的o-连接的糖基化的情况下将岩藻糖转移至蛋白质。该组中的一些蛋白质负责血型抗原，红血球膜外层的表面标记，的分子基础。
如在此所用的术语“动物”包括所有非反刍动物(包括人类)和反刍动物。在具体的实施例中，所述动物是非反刍动物，例如马和单胃动物。单胃动物的实例包括但不限于：猪(pig和swine)，例如仔猪、生长猪、母猪；家禽，例如火鸡、鸭、小鸡、肉仔鸡、蛋鸡；鱼，例如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳类，例如虾和对虾。在一个另外的实施例中，动物是反刍动物，包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。
如在此所用的术语“病原体”意指任何疾病的致病物。这样的致病物可以包括但不限于细菌、病毒、真菌致病物等。
如在此所用的，术语“病原体结合位点”意指酶可将其自身附接于化合物并与其反应的区域或区。在本公开中，优选的病原体结合位点是具有被至少一个α-1,2-l-岩藻糖部分取代的至少一个聚糖结构的结合位点。
术语“f18+大肠杆菌(e.coli)”意指任何能够表达f18菌毛的大肠杆菌。
“饲料”和“食品”分别意指任何天然或人造饮食、膳食等，或此类膳食的组分，其意在或适合于分别被非人类动物和人类食用、摄取、消化。
如在此所用的，术语“食品”以广义使用-并且涵盖用于人类的食品和食品产品以及用于非人类动物的食品(即饲料)。
关于在饲养家畜时喂养动物的产品，使用术语“饲料”。术语“饲料”和“动物饲料”可以互换使用。在优选的实施例中，所述食品或饲料供非反刍动物和反刍动物食用。
如在此所用的术语“蛋白酶”是指能够切割肽键的酶。术语“蛋白酶(protease)”、“肽酶”和“蛋白酶(proteinase)”可以互换使用。蛋白酶可以在动物、植物、细菌、古细菌和病毒中找到。蛋白质水解可通过目前被分为以下六大组的酶实现：天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。
术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”在此可互换使用，并且指通过肽键连接在一起的氨基酸的聚合物。“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。贯穿本披露使用了遵照iupac-iub生物化学术语联合委员会(jointcommissiononbiochemicalnomenclature，jcbn)定义的氨基酸的单字母和3字母代码。单字母x是指二十个氨基酸中的任一个。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。突变可以由亲本氨基酸的单个字母代码命名，随后是位置编号，然后是变体氨基酸的单个字母代码。例如，将在位置87处的甘氨酸(g)突变为丝氨酸(s)表示为“g087s”或“g87s”。当描述修饰时，位置后面在括号中列出的氨基酸表示由任何列出的氨基酸在该位置处的取代清单。例如，6(l,i)意指位置6可以被亮氨酸或异亮氨酸取代。有时，在序列中，将斜线(/)用于定义取代，例如，f/v表示特定位置，在该位置处可以具有苯丙氨酸或缬氨酸。
突变可以由亲本氨基酸的单个字母代码命名，随后是位置编号，然后是变体氨基酸的单个字母代码。例如，将在位置87处的甘氨酸(g)突变为丝氨酸(s)表示为“g087s”或“g87s”。
术语“成熟”形式的蛋白质、多肽或肽是指没有信号肽序列和前肽序列的蛋白质、多肽或酶的功能形式。
术语“前体”形式的蛋白质或肽是指具有有效地连接到该蛋白质的氨基或羧基末端的原序列的成熟形式的蛋白质。前体还可以具有有效地连接到原序列的氨基末端的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性的另外的多肽(例如，从其切割以留下成熟形式的蛋白质或肽的多肽)。
“前序列”或“前肽序列”是指在信号肽序列与成熟酶序列(例如，岩藻糖苷酶)之间的、酶的正确折叠和分泌所必需的氨基酸序列；它们有时被称为分子内伴侣。原序列或前肽序列的切割产生成熟的活性酶，其通常表达为前酶。
术语“信号序列”和“信号肽”是指可以参与蛋白质的成熟或前体形式的分泌或定向转运的氨基酸残基序列。典型地，信号序列位于前体或成熟蛋白序列的n-末端。信号序列可以是内源的或外源的。成熟蛋白中一般不存在信号序列。典型地，在蛋白质转运后，信号序列通过信号肽酶从蛋白质切割。目的基因可以在有或没有信号序列的情况下表达。
关于氨基酸序列或核酸序列，术语“野生型”表示氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然发生的序列。如在此所用的术语“天然发生的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。相反，术语“非天然发生”是指在自然界中没有发现的任何物质(例如，在实验室中生产的重组核酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。
术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。因此，氨基酸丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基取代另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸取代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基取代另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸取代精氨酸)的改变也可以预期产生功能上等效的产物。在许多情况下，导致蛋白分子的n-末端和c-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变所述蛋白的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留情况。
术语“密码子优化的”，如它是指用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区域，是指核酸分子的基因或编码区域中密码子的改变，以反映宿主生物体的典型密码子使用，而不改变dna编码的多肽。
术语“有效地连接”是指核酸序列在单个核酸分子上的缔合，使得一个核酸片段的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列在启动子的转录控制下)时，启动子与该编码序列有效地连接。编码序列可以在正义或反义方向上有效地连接到调节序列上。
术语“调控序列”或“控制序列”在此可互换使用，并且是指能够增加或减少生物体内特定基因表达的核苷酸序列区段。调控序列的实例包括但不限于启动子、信号序列、操纵子等。如上所述，调控序列可以以正义或反义方向有效地连接至目的编码序列/基因。
“启动子”或“启动子序列”是指定义在何处rna聚合酶开始基因转录的dna序列。启动子序列通常直接位于转录起始位点的上游或5'末端。启动子可以全部衍生自天然或天然发生的序列，或者由衍生自在自然界发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的dna区段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可能引导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或者响应于不同环境或生理条件的表达(“诱导型启动子”)。
所述“3'非编码序列”是指位于编码序列下游的dna序列，并包括编码能够影响mrna加工或基因表达(例如转录终止)的调控信号的序列。
如在此所用的术语“转化”是指将核酸分子转移或引入到宿主生物体中。所述核酸分子可以作为线性或环状形式的dna引入。所述核酸分子可以是自主复制的质粒，或者它可以整合进生产宿主的基因组中。含有转化的核酸的生产宿主被称为“转化的”或“重组的”或“转基因的”生物体或“转化体”。
如在此所用的，术语“重组”是指例如通过化学合成或者通过经基因工程技术操纵分离的核酸区段来将两个原本分离的核酸序列区段进行人工组合。例如，其中一个或多个区段或基因已经被插入的dna，其自然地或通过实验室操作，从不同的分子、同一分子的另一部分或人工序列插入，导致在基因中引入新的序列并随后在生物体中引入。术语“重组”、“转基因”、“转化”、“工程化”或“外源基因表达修饰”在此可互换地使用。
术语“生产宿主”、“宿主”和“宿主细胞”在此可互换使用，并且指任何生物体或其细胞，无论是人类还是非人类，其中重组构建体可以稳定或瞬时引入以表达基因。该术语涵盖了亲本细胞的任何后代，由于在繁殖过程中发生的突变，其与亲本细胞不同。
可以使用lasergene生物信息计算包的megalign程序(dnastar公司，麦迪逊，威斯康星州)、vectorntiv.7.0的alignx程序(informax公司，贝塞斯达，马里兰州)或emboss开放软件包(embl-ebi；rice等人，trendsingenetics[遗传学趋势]16,(6):276-277(2000))进行序列比对和百分比同一性计算。可以使用具有默认参数的clustal比对方法(例如clustalw；例如版本1.83)(higgins和sharp，cabios，5:151-153(1989)；higgins等人，nucleicacidsres.[核酸研究]22:4673-4680(1994)；和chenna等人，nucleicacidsres[核酸研究]31(13):3497-500(2003))(其可通过欧洲生物信息学研究所从欧洲分子生物学实验室获得)来执行序列的多重比对。用于clustalw蛋白比对的合适参数包括gap存在罚分＝15、gap延伸＝0.2、矩阵＝gonnet(例如，gonnet250)、蛋白endgap＝-1、蛋白gapdist＝4和ktuple＝1。在一个实施例中，在慢比对情况下，使用快或慢比对以及默认设置。可替代地，可以修饰使用clustalw方法(例如版本1.83)的参数以同样使用ktuple＝1、空位罚分＝10、gap延伸＝1、矩阵＝blosum(例如blosum64)、窗口(window)＝5和顶部存储的对话框(topdiagonalssaved)＝5。
作为某些方面的特征，在此公开了各种多肽氨基酸序列和多核苷酸序列。在某些实施例中可以使用与在此公开的序列具有至少约70％-85％、85％-90％、或90％-95％同一性的这些序列的变体。可替代地，某些实施例中的变体多肽序列或多核苷酸序列可以与在此公开的序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述变体氨基酸序列或多核苷酸序列具有与所公开的序列相同的功能，或具有所公开的序列的功能的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。
关于多肽，术语“变体”是指与指定的野生型、亲本或参比多肽不同的多肽，因为它包括一种或多种天然发生的或人造的氨基酸取代、插入或缺失。类似地，关于多核苷酸，术语“变体”是指在核苷酸序列中与指定的野生型、亲本或参比多核苷酸不同的多核苷酸。野生型、亲本或参比多肽或多核苷酸的身份将从上下文中显而易见。
如在此所用的，术语“表达”是指处于前体抑或成熟形式的功能性终产物(例如，mrna或蛋白质)的产生。表达也可指将mrna翻译成多肽。
基因的表达涉及该基因的转录并将mrna翻译成前体或成熟蛋白。“反义抑制”是指能够抑制靶蛋白表达的反义rna转录物的产生。“共抑制”是指能够抑制相同的或基本上相似的外源或内源基因的表达的正义rna转录物的产生(美国专利号5,231,020)。“成熟”蛋白指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。“前体”蛋白质指mrna的翻译初级产物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽或原肽可以是但不限于细胞内定位信号。“稳定转化”是指将核酸片段转移至宿主生物体的基因组中，包括细胞核的和细胞器的基因组，导致遗传稳定的遗传。相比之下，“瞬时转化”是指将核酸片段转移至宿主生物体的细胞核中或含有dna的细胞器中，导致基因表达而无整合或稳定的遗传。含有经转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因的”生物体。
如在此所用的，“同源蛋白质”或“同源酶”是指在一级、二级和/或三级结构中具有不同相似性的蛋白质。当比对蛋白质时，蛋白质同源性可以是指线性氨基酸序列的相似性。蛋白质序列的同源搜索可以使用来自ncbiblast的blastp和psi-blast使用阈值(e值截止值)0.001进行。(altschulsf、maddetl、shafferaa、zhangj、zhangz、millerw、lipmandj，gappedblastandpsiblastanewgenerationofproteindatabasesearchprograms[空位blast和psiblast：新一代蛋白质数据库搜索程序]，nucleicacidsres[核酸研究]1997年第1组；25(17):3389-402)。使用该信息，可以将蛋白质序列分组。可以使用氨基酸序列构建系统发生树。可以在例如vectorntiadvance套件等程序中输入氨基酸序列，并且可以使用邻接(neighborjoining，新泽西州)法创建引导树(saitou和nei，molbiolevol[分子生物学与进化]，4:406-425,1987)。可以使用针对序列距离的kimura校正并且忽略具有空位的位置来计算树结构。程序例如alignx可以在系统发生树上显示的分子名称之后的括号内显示计算的距离值。
了解分子之间的同源性可以揭示分子的进化历史以及它们的功能信息；如果新测序的蛋白质与已经表征的蛋白质同源，则存在新蛋白质的生物化学功能的强烈指示。两个实体之间最基本的关系是同源性；如果两个分子衍生自共同的祖先，则它们被称为是同源的。同源分子或同系物可以分为两类，旁系同源物和直系同源物。旁系同源物是存在于一个物种内的同系物。旁系同源物在它们的详细生物化学功能上往往不同。直系同源物是存在于不同物种内并且具有非常相似或完全相同功能的同系物。蛋白质超家族是可以推断出共同祖先的蛋白质的最大分组(进化枝)。通常这个共同祖先是基于序列比对和机械相似性。典型地，超家族含有若干个在该家族内显示序列相似性的蛋白质家族。基于merops蛋白酶分类系统，术语“蛋白质宗族”通常用于蛋白酶超家族。
clustalw算法是序列比对算法的另一个实施例(参见thompson等人，nucleicacidsres[核酸研究]22:4673-4680,1994)。clustalw算法的默认参数包括：空位开放罚分＝10.0；空位延伸罚分＝0.05；蛋白质重量矩阵＝blosum系列；dna重量矩阵＝iub；延迟发散序列％＝40；空位分隔距离＝8；dna转换重量＝0.50；列表亲水残基＝gpsndqekr；使用负性矩阵＝关；切换特殊残基罚分＝开；切换亲水罚分＝开；以及切换结束空位分隔罚分＝关。在clustal算法中，包括在任一末端发生的缺失。例如，500个氨基酸的多肽的任一末端(或多肽内)具有5个氨基酸缺失的变体相对于“参比”多肽具有99％(495/500个相同残基×100)的百分比序列同一性。这样的变体将被与该多肽具有“至少99％的序列同一性”的变体所涵盖。
如在此所用的，术语“功能测定”是指提供蛋白质活性指示的测定法。在一些实施例中，该术语是指其中针对以其通常的能力发挥功能的能力来分析蛋白质的测定系统。例如，在α-l-岩藻糖苷酶的情况下，功能测定可涉及确定α-l-岩藻糖苷酶水解α-l-岩藻糖苷底物的有效性。
含有l-岩藻糖的糖缀合物对于无数的生理和病理活动(例如炎症、细菌和病毒感染等)是重要的。
针对f18的肠道受体的存在与否是遗传控制的。已经证明，携带f18的大肠杆菌在水肿病中定植的易感性受显性等位基因控制和抗性受隐性等位基因的控制(vogeli等人，(1996)animgenet.[动物遗传学]27(5):321-8)。
已显示控制大肠杆菌f18受体表达的基因链接到α(1,2l-岩藻糖基转移酶1基因(fut1)。fut1基因编码半乳糖苷2-α-l-岩藻糖基转移酶，该酶修饰发生粘附的聚糖末端。
etec抗性动物显示出显著较低水平的fut1酶(francisdh(2002)，jswinehealthprod.[猪健康与生产杂志]，10(4):171-5；meijerink等人，(1997)mammaliangenome[哺乳动物基因组]8:736-41)。已显示岩藻糖基转移酶参与肠上皮细胞的岩藻糖基化，并且此外，在动物发育过程中岩藻糖基化水平不同(torres-pinedo和mahmood(2004)biochembiophysrescommun[生物化学和生物物理研究通讯]125:546-53；ruggiero-lopez等人，(1991)biochemj[生物化学杂志]279:801-6；biol等人，(1987)pediatrres[儿科研究]22:250-6)。
血型抗原是红细胞膜上的表面标记。它们通常被定义为通过向在红细胞和某些上皮细胞(包括覆盖胃肠道、泌尿道和呼吸道的那些)上检测到的脂质和蛋白质的碳水化合物侧链上连续添加糖类而形成的分子。
特定的寡糖抗原附接于红细胞表面上的蛋白质和脂质。所附接的最基本寡糖称为o抗原(也称为h抗原)。人类血型取决于糖基转移酶(催化单糖之间形成糖苷键的酶)的功能。特定的寡糖抗原附接于红细胞表面上的蛋白质和脂质。
该o(或h)抗原是在所有三种血型ab、a和b中发现的碱基寡糖。所述o抗原是(-脂质-葡萄糖-半乳糖-n-乙酰葡糖胺-半乳糖-岩藻糖)形式。血型o只有附接于红细胞上的o抗原。
已经发现α-1-2岩藻糖基转移酶对于形成血型抗原是必需的。所述o或h抗原是α-1,2-连接到半乳糖的岩藻糖。在血型a抗原中，将galnac添加到h抗原中的半乳糖中。h和a抗原存在于人类和猪中。
决定血型a特异性的免疫显性单糖是末端α-1,3-连接的n-乙酰半乳糖胺(galnac)，而血型b特异性的相应单糖是α-1,3-连接的半乳糖(gal)。o型细胞在它们的寡糖链末端缺少这两种单糖，而是用α-1,2-连接的岩藻糖(fuc)残基封端并指定为h抗原。
图9描绘了ab和o抗原的末端结构。应该注意的是，虽然以血液抗原最为熟知，但是这些抗原在身体的大部分组织和上皮细胞和内皮细胞上表达。
图10描绘了abo血型抗原的结构基础。a和b三糖表位由常见的h双糖底物α-1,3-n-乙酰半乳糖胺转移酶(gta)和α-半乳糖基转移酶(gtb)形成。相反，用于将血型a和b抗原酶促转化为h的策略涉及特异性水解α-1,3-galnac(使用α-n-乙酰半乳糖苷酶，a-zyme)或α-1,3-半乳糖(使用α-半乳糖苷酶，b-zyme)以形成在orbc上发现的常见h结构的外切糖苷酶。
如以下实例所证明的，似乎α-l-岩藻糖苷酶能够从h1抗原三糖中去除岩藻糖残基，但似乎难以从a抗原四糖中去除岩藻糖残基，这可能是由于空间位阻造成的。然而，据信当α-l-岩藻糖苷酶与能够去除含α-n-乙酰半乳糖胺的部分的酶组合时，那么α-l-岩藻糖苷酶可以从含a抗原葡聚糖的结构中去除岩藻糖。
使用α-半乳糖苷酶将血型b抗原转化为h抗原也是可能的。能够从含葡聚糖的结构中去除含α-n-乙酰半乳糖胺的部分的这类酶的实例包括但不限于可得自新英格兰生物实验室(newenglandbiolabs)的n-乙酰半乳糖胺酶(#p0734)。
本公开涉及一种预防和/或治疗动物肠道病原体感染和/或腹泻的方法，其中所述病原体感染和/或腹泻由能够结合动物肠细胞的病原体引起，其中所述病原体的结合依赖于病原体结合位点的存在，所述病原体结合位点具有被至少一个α-1,2-l-岩藻糖部分取代的至少一个聚糖结构，所述方法包括向所述动物施用有效量的能够从所述病原体结合位点去除至少一个α-1,2-l-岩藻糖部分的糖苷水解酶。
也在本公开范围内的是用于预防和/或治疗动物肠道病原体感染和/或腹泻的组合物，其中所述病原体感染和/或腹泻由能够结合动物肠细胞的病原体引起，其中所述病原体的结合依赖于病原体结合位点的存在，所述病原体结合位点具有被至少一个α-1,2-l-岩藻糖部分取代的至少一个聚糖结构，所述方法包括向所述动物施用有效量的能够从所述病原体结合位点去除至少一个α-1,2-l-岩藻糖部分的糖苷水解酶。
在此所公开的所有方面(所述方法、组合物、或其用途)，α-l-岩藻糖苷酶能够单独地或者与能够从含聚糖结构中除去含n-乙酰半乳糖胺部分的酶组合从含聚糖的结构中除去末端α-1,2-连接的岩藻糖基团。这在下面的实例中进一步讨论。
不受理论束缚，据信末端α1,2连接的岩藻糖的水解防止了与肠细胞的粘附，例如，如在由etec表达的f18菌毛的情况下。
可以使用任何能够去除至少一个岩藻糖基部分的酶，例如糖苷水解酶，无论所述岩藻糖基部分从病原体结合位点去除还是所述病原体结合位点的较大部分被去除，只要所述岩藻糖基部分也去除。优选地，可以使用α-l-岩藻糖苷酶多肽。本公开的糖苷水解酶，例如α-l-岩藻糖苷酶多肽包括分离的、重组的、基本上纯的、或非天然发生的多肽。
优选地，α-l-岩藻糖苷酶多肽来自糖苷水解酶家族95(gh95)或糖苷水解酶家族29(g29)。最优选地，此类α-l-岩藻糖苷酶多肽在gh95家族中。
可能希望的是工程化α-l-岩藻糖苷酶，使得其在低ph下稳定并且对胃蛋白酶也是稳定的。此外，也可能希望工程化α-l-岩藻糖苷酶以具有更广的底物特异性，例如能够接受a(并且甚至b)血型抗原作为底物。换句话说，扩大底物特异性，使得工程化的α-l-岩藻糖苷酶能够从a四糖中去除岩藻糖残基而不需要添加α-n-乙酰半乳糖胺酶。
在一些实施例中，所述多肽可用于预防和/或治疗病原体感染，并可掺入预防性和/或治疗性组合物中。
如在此所述，同源性可以通过氨基酸序列比对例如，使用程序例如blast、align、或clustal来确定。在一些实施例中，所述多肽是分离的、重组的、基本上纯的、或非天然发生的酶，其能够至少从所述病原体结合位点去除至少一个岩藻糖基部分。可能的是，该多肽可以去除所述病原体结合位点的更大部分，条件是也去除至少一个岩藻糖基部分。优选地，所述酶具有α-l-岩藻糖苷酶活性，或催化从多糖(例如α-l-岩藻糖苷)切割末端α-1,2-连接的岩藻糖基团。
对于本领域技术人员显而易见的是，全长和/或成熟的α-l-岩藻糖苷酶可以使用本领域中任何熟知的技术来制备。
在另一方面，包含编码任何多肽(包括任何融合蛋白等)的核苷酸序列的任何分离的、重组的、基本上纯的、合成方式衍生的、或非天然发生的核酸能够至少从所述病原体结合位点去除至少一个岩藻糖基部分。可能的是，该多肽可以去除所述病原体结合位点的更大部分，条件是也去除至少一个岩藻糖基部分。
另外感兴趣的是包含编码葡萄糖水解酶(例如α-l-岩藻糖苷酶，其从α-1,2-l-岩藻糖苷中水解l-岩藻糖部分)的多核苷酸的载体。
对技术人员将显而易见的是，该载体可以是任何合适的表达载体并且对载体的选择可因载体待插入其中的细胞的类型而异。合适的载体包括pgapt-pg、prax1、pgamd、pgpt-pyrg1、pc194、pjh101、pe194和php13(参见harwood和cutting[编辑]，第3章，molecularbiologicalmethodsforbacillus[针对芽孢杆菌的分子生物学方法]，约翰威利父子公司(johnwiley&sons)[1990])。还参见，perego，integrationalvectorsforgeneticmanipulationsinbacillussubtilis[在枯草芽孢杆菌中用于遗传操作的整合载体]，在：sonenshein等人[编辑]，bacillussubtilisandothergram-positivebacteria:biochemistry,physiologyandmoleculargenetics[枯草芽孢杆菌和其他革兰氏阳性细菌：生物化学、生理学和分子遗传学]，americansocietyformicrobiology[美国微生物学会]，华盛顿[1993]，第615-624页，和p2jm103bbi。
控制转录终止的dna片段也可以衍生自对优选的生产宿主细胞来说是天然的各种基因。在某些实施例中，包括终止控制区域是任选的。在某些实施例中，所述表达载体包括衍生自优选的宿主细胞的终止控制区域。
所述表达载体可以包括在所述生产宿主中，特别是在微生物生产宿主的细胞中。所述生产宿主细胞可以是在真菌或细菌家族中发现的微生物宿主，并且其在大范围的温度、ph值和溶剂耐受性下生长。例如，预期细菌、藻类和真菌(例如丝状真菌和酵母)中的任何一种可以合适地容纳所述表达载体。
在所述生产宿主细胞中包括所述表达载体可以用于表达目的蛋白质，使得其可以存在于细胞内、细胞外或细胞内和细胞外的组合中。与用于回收细胞内表达所产生的蛋白质的方法相比，细胞外表达使从发酵产物中回收所需蛋白质更容易。
重组表达载体可以是任何载体，如质粒或病毒，其可以方便地进行重组dna程序并导致核苷酸序列的表达。载体选择通常取决于载体与所述载体待引入的生产宿主的相容性。所述载体可以是线性或闭环质粒。所述载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。所述载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，所述载体可以是当被引入生产宿主时整合到基因组中并与已整合到其中的染色体一起复制的载体。这类载体的一些非限制性实例提供于fungalgeneticsstockcentercatalogueofstrains[真菌遗传学库存中心菌株目录](fgsc，<www.fgsc.net》)中，合适的表达和/或整合载体的另外实例提供于sambrook等人，(1989)，同上，ausubel(1987)，同上，vandenhondel等人，(1991)，bennett和lasure(编辑)，moregenemanipulationsinfungi[真菌中更多的基因操作]，学术出版社(academicpress)，396-428和美国专利号5,874,276中。特别有用的载体包括ptrex、pfb6、pbr322、puci8、puci00和pentr/d。适用于细菌细胞的质粒包括允许在大肠杆菌中复制的pbr322和puc19，和例如允许在芽孢杆菌中复制的pe194。
所述载体系统可以是单个载体或质粒，或者两个或更多个载体或质粒，它们一起含有待引入宿主细胞基因组的总dna，或转座子。
所述载体还可以含有一个或多个可选择标记以允许容易选择转化的细胞。可选择标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性等。可选择标记的实例包括赋予抗微生物抗性的标记。营养标记也可用于本发明，包括本领域作为amds、argb和pyr4已知的那些标记。可用于转化木霉的标记是本领域已知的(参见例如，finkelstein，第6章，在biotechnologyoffilamentousfungi[丝状真菌的生物技术]，finkelstein等人编辑，巴特沃斯海涅曼出版社(butterworth-heinemann)，波士顿，马萨诸塞州(1992)和kinghorn等人，(1992)appliedmoleculargeneticsoffilamentousfungi[丝状真菌的应用分子遗传学]，blackieacademicandprofessional[黑人的学术和专业]，c-h出版社(chapmanandhall)，伦敦)。在一些实施例中，所述表达载体也包括复制子、编码允许选择携带重组质粒的细菌的抗生素抗性的基因、和在质粒的非必需区域中的允许插入异源序列的独特限制性位点。所选择的特定抗生素抗性基因不是决定性的；本领域已知的许多抗性基因中的任一种都是合适的。优选地选择原核序列，使得它们不干扰dna在里氏木霉中的复制或整合。
所述载体还可以含有允许所述载体稳定整合到产物宿主基因组中或者允许载体在独立于所述细胞基因组的生产宿主中的自主复制的一种或多种元件。为了整合到宿主细胞基因组中，所述载体可以依赖于编码天冬氨酸蛋白酶的核苷酸序列或所述载体的任何其他元件，用于通过同源或非同源重组将载体稳定整合到所述基因组中。
对于自主复制，所述载体可以进一步包含使所述载体能够在生产宿主中自主复制的复制起点。
可将编码α-l-岩藻糖苷酶的核苷酸序列的多于一个拷贝插入生产宿主中以增加α-l-岩藻糖苷酶的产生。核苷酸序列拷贝数的增加可以通过将至少一个额外的序列拷贝整合到生产宿主的基因组中或通过包括可扩增的可选择标记基因来获得，并且因此可以通过在合适的选择剂存在下培养生产宿主细胞来选择核苷酸序列的额外拷贝。
将包含编码α-l-岩藻糖苷酶的核苷酸序列的载体引入生产宿主中，使得所述载体维持为染色体整合体或维持为自我复制的染色体外载体。一般认为整合是一个优点，因为所述核苷酸序列更可能稳定地维持在生产宿主中。如上所讨论的，将载体整合到生产宿主染色体中可以通过同源或非同源重组发生。
示例性载体包括但不限于pgxt(与公开的pct申请wo2015/017256中所述的ptttpyr2载体相同)。还可以提及标准的细菌表达载体，包括噬菌体λ和m13，以及质粒如基于pbr322的质粒，pskf，pet23d和融合表达系统如mbp、gst和lacz。也可以将表位标签，例如c-myc，添加到重组蛋白中以提供便利的分离方法。
生产宿主的选择可以是任何合适的微生物，如细菌、真菌和藻类。通常，所述选择取决于编码目的糖苷水解酶(例如α-l-岩藻糖苷酶)的基因。
合适的生产宿主的实例包括但不限于细菌、真菌、植物细胞等。优选地是，所述生产宿主可以选自大肠杆菌，链霉菌属，汉逊酵母属(hansenula)，木霉属(trichoderma)(特别是里氏木霉(t.reesei))，芽孢杆菌属，乳杆菌属，曲霉属(特别是黑曲霉)，植物细胞和/或芽孢杆菌属、木霉属或曲霉属的孢子。
在一些实施例中，重组α-l-岩藻糖苷酶可用于在此公开的方法和组合物中。在优选的方面，提供了食品或饲料添加剂，其包含能够从α-l-岩藻糖苷酶水解l-岩藻糖的α-l-岩藻糖苷酶。
然而，可以使用用于将外源核苷酸序列引入宿主细胞的任何熟知的程序。这些包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、基因枪法、脂质体、显微注射、原生质载体、病毒载体，以及用于将克隆的基因组dna、cdna、合成dna、或其他外源遗传材料引入宿主细胞的任何其他熟知方法(参见例如，sambrook等人，同上)。还使用的是美国专利号6,255,115中描述的农杆菌介导的转染方法。只需要使用能够成功地将至少一个基因引入能够表达该基因的宿主细胞中的具体遗传工程化程序。
取决于所使用的宿主细胞，可以进行转录后和/或翻译后修饰。转录后和/或翻译后修饰的一个非限制性实例是多肽的“剪切”或“截短”。例如，这可以导致使如在此所述的糖苷水解酶(例如α-l-岩藻糖苷酶)从无活性或基本上无活性的状态变为活性状态，如前肽在进行进一步的翻译后加工后成为具有酶活性的成熟肽的情况一样。在另一个情况下，该剪切可导致获得如在此所述的成熟糖苷水解酶(例如α-l-岩藻糖苷酶多肽)并且进一步去除n或c-末端氨基酸以产生截短形式的保留酶活性的α-l-岩藻糖苷酶。
转录后或翻译后修饰的其他实例包括但不限于肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化。本领域技术人员将认识到蛋白质可能经历的转录后或翻译后修饰的类型可取决于表达蛋白质的宿主生物体。
将表达载体引入细胞后，在有利于表达在启动子序列控制下的基因的条件下培养转染或转化的细胞。在一些情况下，所述启动子序列是cbh1启动子。大批量的转化细胞可以如ilmen等人1997中所述进行培养(“regulationofcellulasegeneexpressioninthefilamentousfungustrichodermareesei.[丝状真菌里氏木霉中纤维素酶基因表达的调控]”appl.envir.microbiol.[应用与环境微生物学]63:1298-1306)。
取决于钙离子浓度，将dna摄取到宿主木霉属物种菌株中。通常，在摄取溶液中使用约10mm-50mmcacl2。另外的合适的化合物包括缓冲系统，例如te缓冲液(10mmtris，ph7.4；1mmedta)或10mmmops(ph6.0)和聚乙二醇。据信聚乙二醇使细胞膜融合，从而允许培养基的内容物被递送至木霉属物种菌株的细胞质中。此融合时常留下整合到宿主染色体中的多个拷贝的质粒dna。
通常，使用已经进行了渗透性处理的原生质体或细胞转化木霉属物种，通常以105至107/ml、特别是2x106/ml的密度进行。将在合适溶液(例如1.2m山梨糖醇和50mmcacl2)中的体积为100μl的这些原生质体或细胞与所需dna混合。通常，向摄取溶液中添加高浓度的peg。可以将从0.1至1体积的25％peg4000添加到原生质体悬浮液中；然而，向原生质体悬浮液中添加约0.25体积是有用的。也可以将添加剂例如二甲亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等添加到摄取溶液中以促进转化。类似的程序可用于其他真菌宿主细胞。参见，例如美国专利号6,022,725。
用于培养细胞的培养基可以是适合于使宿主细胞生长和获得α-岩藻糖苷酶多肽的表达的任何常规培养基。适合的培养基和培养基组分可从商业供应商获得或可以根据公开的配方(例如，如在美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)的目录中所述)来制备。
在一些实施例中，可以使用本领域已知的任何培养方法来实现重组微生物的所消耗的全发酵液的制备，从而导致目的酶的表达。因此，发酵可以理解为包括在实验室或工业发酵罐中在合适的培养基和酶能够被表达或分离的条件下进行的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)。术语“所消耗的全发酵液”在此定义为包括培养基、胞外蛋白质(例如，酶)和细胞生物质的发酵材料的未分级内容物。应该理解，术语“所消耗的全发酵液”还涵盖已经使用本领域熟知的方法裂解或透化的细胞生物质。
宿主细胞可以在允许表达α-葡糖苷酶的合适条件下培养。这些酶的表达可以是组成型的，使得它们能被连续产生，或诱导型的，需要刺激来启动表达。在诱导型表达的情况下，当需要时可通过例如向培养基中添加诱导物质，例如地塞米松或iptg或槐糖来启动蛋白质生产。
本领域熟知的任何发酵方法都可以合适用来使如上所述的转化的或衍生的真菌菌株发酵。
经典的分批发酵是封闭的系统，其中在发酵开始时设定培养基的组成，并且该组成在发酵期间不改变。在发酵开始时，用一种或多种所希望的生物体接种培养基。换言之，整个发酵过程发生而自始至终没有向发酵系统添加任何组分。
连续发酵是另一种已知的发酵方法。它是开放的系统，在该系统中，将定义的发酵培养基连续添加到生物反应器中，同时除去等量的条件培养基以用于处理。连续发酵通常将培养物保持在恒定的密度，其中将细胞主要维持在对数期生长。连续发酵允许对一种或多种影响细胞生长和/或产物浓度的因素进行调节。例如，限制营养素(例如碳源或氮源)可以维持在固定的速率，并允许调节所有其他参数。在其他系统中，影响生长的许多因素可以不断改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力维持稳定态的生长条件。因此，由于转移培养基而引起的细胞损失应当与发酵中的细胞生长速率相平衡。调节用于连续发酵过程的营养素和生长因子的方法以及最大化产物形成速率的技术在工业微生物学领域中是熟知的。
分离和浓缩技术是本领域已知的，并且常规方法可用于制备包含本发明的α-葡糖苷酶多肽的浓缩溶液或肉汤。
发酵后，获得发酵液，通过常规分离技术除去微生物细胞和各种悬浮固体(包括剩余的粗发酵材料)，以便获得含酶溶液。通常使用过滤、离心、微滤、旋转真空鼓式过滤、超滤、离心然后超滤、提取或色谱法等。
可以使用常规浓缩技术浓缩含酶溶液直至获得所需酶水平。含酶溶液的浓缩可以通过在此所讨论的技术中的任一种来实现。富集和纯化方法的实例包括但不限于旋转真空过滤和/或超滤。
可以使用本领域已知的各种测试来测试在此所述的糖苷水解酶(如在此所述的α-l-岩藻糖苷酶)的活性。例如，可以根据需要通过将所述酶与糖蛋白或寡糖和水合并来测试活性。活性可以通过分析反应产物来测量，所述反应产物可以通过例如薄层色谱法或分光光度法来分离和可视化。岩藻糖分光光度测定的实例是梅格泽姆公司(megazyme)k-fucose试剂盒是(cao等人，(2014)jbiolchem[生物化学杂志]289(37):25624-38)。
在此所公开的方法进一步包括单独地或与至少一种蛋白酶组合向所述动物施用有效量的与至少一种直接饲喂的微生物组合的糖苷水解酶(例如α-l-岩藻糖苷酶)。
此外，可以将如在此所述的糖苷水解酶(例如α-l-岩藻糖苷酶，单独或与至少一种直接饲喂的微生物组合)单独地和/或与至少一种蛋白酶组合包入胶囊内用于动物饲料或预混物中。此外，如在此所述的糖苷水解酶(例如α-l-岩藻糖苷酶，单独或与至少一种直接饲喂的微生物组合)单独地和/或与至少一种蛋白酶组合，无论包入胶囊内与否，可以呈颗粒的形式。
此外，如在此所述的糖苷水解酶(例如，α-l-岩藻糖苷酶)可以被包入胶囊内以承受在胃中发现的酸性ph。
如在此所述的糖苷水解酶，例如α-l-岩藻糖苷酶，无论是否包入胶囊内，可以单独使用或与至少一种直接饲喂的微生物组合使用，并且可以在动物饲料或预混物中施用。
如在此所述的糖苷水解酶，例如α-l-岩藻糖苷酶，无论是否包入胶囊内，可以单独使用或与至少一种直接饲喂的微生物和至少一种蛋白酶组合使用，并且可以在动物饲料或预混物中施用。
此外，如在此所述的糖苷水解酶，例如α-l-岩藻糖苷酶，无论是否包入胶囊内，可以单独使用或与至少一种直接饲喂的微生物组合使用，并且可以在动物饲料或预混物中施用，并且所述α-l-岩藻糖苷酶可以呈颗粒或液体的形式。优选的形式是颗粒。
也包括在本公开范围内的是用于预防和/或治疗患有肠道病原体感染和/或腹泻的动物的组合物，其中所述病原体感染由能够结合动物肠细胞的病原体引起，其中所述病原体的结合依赖于病原体结合位点的存在，所述病原体结合位点具有被至少一个α-1,2-l-岩藻糖部分取代的至少一个聚糖结构，所述预防和/或治疗包括向所述动物施用有效量的能够从所述病原体结合位点去除至少一个α-1,2-l-岩藻糖部分的糖苷水解酶。
如上所指出，糖苷水解酶(例如α-l-岩藻糖苷酶)应该能够单独地或者与能够从含聚糖结构中除去含n-乙酰半乳糖胺部分的酶组合从含聚糖的结构中除去末端α-1,2-连接的岩藻糖基团。优选地，所述α-l-岩藻糖苷酶选自糖苷水解酶家族95(gh95)和糖苷水解酶家族29(gh29)，并且最优选地，所述α-l-岩藻糖苷酶选自糖苷水解酶家族95(gh95)。
如上所讨论的，该组合物可用于预防和/或治疗任何肠道病原体感染。一种目的病原体是表达f18菌毛的大肠杆菌。
从上述讨论可以清楚地看出，所述组合物可以进一步包含单独的或与至少一种蛋白酶组合的至少一种直接饲喂的微生物。
可以将糖苷水解酶(例如α-l-岩藻糖苷酶，单独或与至少一种直接饲喂的微生物组合)单独地和/或与至少一种蛋白酶组合包入胶囊内用于动物饲料或预混物中。此外，糖苷水解酶(例如α-l-岩藻糖苷酶，单独或与至少一种直接饲喂的微生物组合)单独地和/或与至少一种蛋白酶组合，无论包入胶囊内与否，可以呈颗粒的形式。
动物饲料可以包括植物材料，例如玉米，小麦，高粱，大豆，低芥酸菜籽，向日葵，或针对家禽、猪、反刍动物、水产养殖和宠物的这些植物材料或植物蛋白源中的任何的混合物。预期动物性能参数，例如生长、采食量和饲料效率，但同时改善的均匀性、降低的动物房内的氨浓度以及因此改善的动物的福利和健康状况，都将得到改善。更具体地，如在此所用的“动物性能”可以通过动物的饲料效率和/或增重和/或通过饲料转化率和/或通过饲料中的营养物质的消化率(例如氨基酸消化率)和/或饲料中的可消化能或代谢能和/或通过氮保留量和/或通过动物以防坏死性肠炎的负面影响的能力和/或通过受试者的免疫应答来确定。
当用作饲料(例如功能饲料)或用于饲料(例如功能饲料)的制备时，本发明的酶或饲料添加剂组合物可以与以下各项中的一种或多种组合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。例如，可以提及至少一种选自下组的组分，该组由以下组成：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、偏亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
在一个优选的实施例中，将本发明的酶或饲料添加剂组合物与饲料组分混合以形成喂养料。在此所用的术语“饲料组分”意指喂养料的全部或部分。喂养料的部分可意指喂养料的一种成分或喂养料的一种以上(例如2种或3种或4种或更多种)成分。在一个实施例中，术语“饲料组分”涵盖预混物或预混物成分。优选地，饲料可以是秣料或其预混物、复合饲料或其预混物。可将根据本发明的饲料添加剂组合物与复合饲料、复合饲料组分混合或将其混合至复合饲料的预混物或混合至秣料、秣料组分或秣料的预混物中。
在此所用的术语“秣料”意指提供给动物的任何食物(而不是动物必须自己觅食)。秣料涵盖已经切下的植物。此外，秣料包括青贮饲料、压缩的和压成丸粒的饲料、油和混合给养，也包括发芽谷物和豆类。
秣料可以获得自选自以下的植物中的一种或多种：玉米(玉蜀黍)、苜蓿(紫苜蓿)、大麦、百脉根、芸苔属、chaumoellier、羽衣甘蓝、油菜籽(低芥酸菜籽)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、萝卜、三叶草、杂种三叶草、红三叶草、地下三叶草、白三叶草、羊茅草、雀麦草、谷子、燕麦、高粱、大豆、树(用作树干草的修剪下的树嫩枝)、小麦、和豆科植物。
术语“复合饲料”意指呈粗粉、丸粒、球丸(nut)、饼或碎屑形式的商业饲料。复合饲料可由多种原料和添加剂共混而来。根据目标动物的特定需求配制这些共混物。
复合饲料可以是提供所有每日所需营养物质的完全饲料、提供口粮(蛋白质、能量)的一部分的浓缩物或仅提供另外的微量营养物质(例如矿物质和维生素)的补充剂。
用于复合饲料中的主要成分是饲料谷物，其包括玉米、小麦、低芥酸菜籽粉、油菜籽粉、羽扇豆、大豆、高粱、燕麦和大麦。
合适地，在此所提及的预混物可以是由微量成分构成的组合物，该微量成分为例如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于共混进商业口粮内的组合物。
在一个实施例中，喂养料包含以下或由以下组成：玉米、ddgs(例如，cddgs)、小麦、小麦麸、或其任何组合。
在一个实施例中，饲料组分可为玉米、ddgs(例如，cddgs)、小麦、小麦麸、或其组合。在一个实施例中，喂养料包含以下或由以下组成：玉米、ddgs(例如，cddgs)或其组合。
在此所述的喂养料可含有按重量计至少30％、至少40％、至少50％或至少60％的玉米和大豆粉或玉米及全脂大豆、或者小麦粉或向日葵粉。
例如，喂养料可以含有约5％至约40％的玉米ddgs。对于家禽，所述喂养料平均可含有约7％至15％的玉米ddgs。对于猪(swine或pigs)，所述喂养料可含有平均5％至40％的玉米ddgs。它也可以含有玉米作为单一谷物，在这种情况下，所述喂养料可以包含约35％至约80％的玉米。
在包含混合谷物(例如包含如玉米和小麦)的喂养料中，所述喂养料可包含至少10％的玉米。
所述饲料可为以下中的一者或多者：复合饲料和预混物，包括丸粒、坚果或(牲畜)饼状物；作物或作物残余物：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、椰子核、稻草、谷壳、甜菜残渣；鱼粉；肉粉和骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；低聚糖；糖渍饲用植物：青贮饲料；海草；种子和谷物，完整的或通过压碎、碾磨等制备；发芽谷物及豆类；酵母提取物。
如在此所用的术语“饲料”在一些实施例中涵盖宠物食品。宠物食品是旨在由宠物消费的植物或动物材料，例如狗食品或猫食品。宠物食品(例如狗和猫食品)可以干燥形式(例如用于狗的磨碎食物)或湿罐装形式。猫食品可含有氨基酸牛磺酸。
动物饲料还可以包括鱼食。鱼食通常含有使养殖鱼保持良好健康所需的大量营养素、痕量元素和维生素。鱼食可以呈小片、丸粒或片的形式。压成丸粒的形式(其中的一些快速沉降)经常用于较大鱼或底饲物种。一些鱼食还含有添加剂(例如β胡萝卜素或性激素)以人工增强观赏性鱼的颜色。
在仍另一方面，动物饲料涵盖鸟食。鸟食包括用于喂鸟器中以及用于饲喂宠物鸟的食物。典型地，鸟食由多种种子组成，但也可涵盖板油(牛或羊脂肪)。
如在此所用的，术语“接触的”是指间接或直接施用如在此所述的糖苷水解酶，例如α-l-岩藻糖苷酶，(或包含如在此所述的糖苷水解酶(例如α-l-岩藻糖苷酶)的组合物)至产品(例如饲料)。可以使用的施用方法的实例包括但不限于：在包含饲料添加剂组合物的材料中处理产品、通过将饲料添加剂组合物与产品混合而直接应用、将饲料添加剂组合物喷涂至产品表面上或将产品浸入饲料添加剂组合物的制剂中。在一个实施例中，优选将本发明的饲料添加剂组合物与产品(例如饲料)混合。可替代地，喂养料的乳液或原始成分中可包括饲料添加剂组合物。这允许所述组合物赋予性能益处。
术语“热稳定”意指加热至指定温度之前添加剂中存在/有活性的酶的至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％在冷却至室温之后仍存在/有活性。优选地，加热至指定温度之前添加剂中存在且有活性的酶的至少约80％在冷却至室温之后仍存在且有活性。
也可能的是，在此所述的α-l-岩藻糖苷酶(或包含α-l-岩藻糖苷酶的组合物)可以均化以产生粉末。
在替代性优选实施例中，将如在此所述的糖苷水解酶，例如α-l-岩藻糖苷酶，(或包含如在此所述的糖苷水解酶(例如，α-l-岩藻糖苷酶)的组合物)配制成如wo2007/044968(称作tpt颗粒)或wo1997/016076或wo1992/012645中所述的颗粒，将这些文献通过引用结合在此。“tpt”意指热保护技术。
在另一方面，当将饲料添加剂组合物配制成颗粒时，这些颗粒包含包覆在蛋白质核心上的水合屏障盐。这样的盐包衣的优点在于使耐热性改善、使保藏稳定性改善和保护免受其他原本会不利影响该酶的饲料添加剂的影响。优选地，用于盐包衣的盐在20℃下具有大于0.25的水活度或大于60％的恒定湿度。在一些实施例中，盐包衣包含na2s04。
制备如在此所述的糖苷水解酶，例如α-l-岩藻糖苷酶，(或包含如在此所述的糖苷水解酶(例如α-l-岩藻糖苷酶)的组合物)的方法还可以包含将粉末制成粒料的进一步步骤。粉末可以与本领域已知的其他组分进行混合。可强加力使粉末、或包含粉末的混合物通过模具，并将所得线料切成适宜的不同长度的粒料。
技术人员会认识到，不同的动物要求不同的喂养料，甚至同一种动物也可能要求不同的喂养料，这取决于饲养该动物的目的。
任选地，喂养料还可含有另外的矿物质(例如钙)和/或另外的维生素。在一些实施例中，喂养料为玉米大豆粉混合物。
喂养料典型地在饲料磨机中生产，在磨机中首先将原料研磨成合适的粒度，然后与适当的添加剂混合。然后，可以将喂养料生产成糊状或丸粒；后者通常涉及这样的方法，通过该方法将温度升高至目标水平，然后使饲料通过模具从而生产出特定大小的丸粒。让丸粒冷却。随后，可添加液体添加剂例如脂肪和酶。制备喂养料也可涉及另外的步骤，该步骤包括制粒之前的挤出或膨化，尤其是通过至少可包括使用蒸汽的适宜技术进行的挤出或膨化。
所述喂养料可为用于以下的喂养料：单腹动物，例如家禽(例如肉鸡、下蛋鸡、肉用种鸡、产仔鸡、火鸡、鸭、鹅、水禽)和猪类(所有年龄类别)；反刍动物，例如牛(例如奶牛或公牛(包括牛犊))、马、绵羊、宠物(例如狗、猫)或鱼(例如无胃鱼，有胃鱼，淡水鱼，如鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼和鲤鱼(例如锦鲤鱼)，海鱼(例如黑鲈)；和甲壳类动物，例如虾、贻贝和扇贝)。优选地，所述喂养料用于猪。
所述饲料添加剂组合物和/或包含其的喂养料可以任何合适的形式使用。所述饲料添加剂组合物能以固体或液体制剂或其替代物形式使用。固体制剂的实例包括粉剂、糊剂、大丸粒、胶囊剂、丸粒、片剂、尘剂和颗粒，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的实例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液、混悬液和乳剂。
在一些应用中，可将所述饲料添加剂组合物与饲料混合或在饮用水中施用。
饲料添加剂组合物，包含将如在此所教导的岩藻糖苷酶与饲料可接受载体、稀释剂或赋形剂混合，并且(任选地)进行包装。
可使喂养料和/或饲料添加剂组合物与至少一种矿物质和/或至少一种维生素混合。由此衍生的组合物可在此称为预混物。所述喂养料可包含按重量计至少0.0001％的饲料添加剂。合适地，喂养料可以包含按重量计至少0.0005％、至少0.0010％、至少0.0020％、至少0.0025％、至少0.0050％、至少0.0100％、至少0.020％、至少0.100％、至少0.200％、至少0.250％、至少0.500％的饲料添加剂。
优选地，食品或饲料添加剂组合物可以进一步包含至少一种生理学上可接受的载体。所述生理学上可接受的载体优选选自以下中的至少一者：麦芽糖糊精、石灰岩(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、na[2]s0[4]、滑石、pva、及其混合物。在一个另外的实施例中，食品或饲料添加可还包含金属离子螯合剂。金属离子螯合剂可选自edta或柠檬酸。
在一些实施例中，食品或饲料添加剂组合物包含水平为至少0.0001g/kg、0.001g/kg、至少0.01g/kg、至少0.1g/kg、至少1g/kg、至少5g/kg、至少7.5g/kg、至少10.0g/kg、至少15.0g/kg、至少20.0g/kg、至少25.0g/kg的如在此所述的糖苷水解酶，例如α-l-岩藻糖苷酶。在一些实施例中，所述食品或饲料添加剂包含一定水平的α-l-岩藻糖苷酶，使得当添加至食品或饲料材料时，所述饲料材料包含1-500mg/kg、1-100mg/kg、2-50mg/kg或2-10mg/kg范围的α-l-岩藻糖苷酶。在本发明的一些实施例中，食品或饲料材料包含至少100、1000、2000、3000、4000、5000、10000、20000、30000、50000、100000、500000、1000000或2000000单位的糖苷水解酶(例如α-l-岩藻糖苷酶)/千克饲料或食品材料。在一些实施例中，一个单位的α-1,2-岩藻糖苷酶活性可以被定义为在实例2中所述测定条件下每分钟可以从2'-岩藻糖基乳糖催化释放1μmolel-岩藻糖的酶的量。
范围可以包括但不限于上面讨论的较低和较高范围的任何组合。
包含如在此所述的任何糖苷水解酶(例如α-l-岩藻糖苷酶)和在此所述的组合物的配制品可以以任何合适的方式制备以确保所述配制品包含活性酶。这种配制品可以是液体、干粉或颗粒。优选地，所述饲料添加剂组合物呈固体形式，适合于添加在饲料丸粒上或添加至饲料丸粒。
干粉或颗粒可以通过本领域技术人员已知的手段制备，例如高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床附聚、流化床喷雾干燥。
如在此所述的糖苷水解酶(例如α-l-岩藻糖苷酶)和在此所述的组合物可以被包衣，例如包入胶囊内。在一个实施例中，包衣保护酶免受热影响并且可视为防热剂。在一个实施例中，包衣保护酶避免低ph。是可以使用的包衣材料的一个实例。
将在此所述的饲料添加剂组合物配制成干粉或颗粒，如wo2007/044968(称为tpt颗粒)或wo1997/016076或wo1992/012645中所述(所述文献各自通过引用全部结合在此)。
在一个实施例中，可将动物饲料配制成包含以下的饲料组合物的颗粒：芯；活性剂；和至少一个包衣，在选自以下中的一种或多种的条件后，颗粒的活性剂保持至少50％活性、至少60％活性、至少70％活性、至少80％活性：a)饲料制丸工艺，b)蒸汽加热的饲料预处理工艺，c)储存，d)作为未经制丸混合物中的成分储存，和e)作为包含选自以下的至少一种化合物的饲料基础混合物或饲料预混物中的成分储存：微量矿物质、有机酸、还原糖、维生素、氯化胆碱以及产生酸性或碱性饲料基础混合物或饲料预混物的化合物。
关于颗粒，至少一个涂层可包含构成所述颗粒的至少55％w/w的水分水合材料；和/或至少一个包衣可包含两层包衣。所述两层包衣可为水分水合包衣和水分屏障包衣。在一些实施例中，所述水分水合包衣可为所述颗粒的25％w/w至60％w/w并且所述水分屏障包衣可为所述颗粒的2％w/w至15％w/w。所述水分水合包衣可选自无机盐、蔗糖、淀粉和麦芽糖糊精，并且所述水分屏障包衣可选自聚合物、树胶、乳清和淀粉。
所述颗粒可使用饲料制丸工艺制备并且所述饲料预处理工艺可在70℃至95℃(例如在85℃至95℃)进行多达若干分钟。
可将饲料添加剂组合物配制成用于动物饲料的颗粒，其包含：芯；活性剂，在储存之后以及在颗粒作为一种成分的蒸汽加热制粒工艺之后，所述颗粒的活性剂保持至少80％活性；水分屏障包衣；和水分水合包衣，其至少为所述颗粒的25％w/w，该颗粒在蒸汽加热制粒工艺之前具有小于0.5的水活性。
所述颗粒可具有选自聚合物和树胶的水分屏障包衣并且所述水分水合材料可为无机盐。所述水分水合包衣可为所述颗粒的25％w/w至45％w/w并且所述水分屏障包衣可为所述颗粒的2％w/w至10％w/w。
颗粒可使用蒸汽加热制丸工艺制备，该工艺可在85℃至95℃进行多达若干分钟。
可替代地，所述组合物处于适合消耗的液体配制品中，优选地，这种液体消费品含有以下中的一种或多种：缓冲剂、盐、山梨糖醇和/或甘油。
此外，可通过将一种或多种酶施用(例如喷涂)于载体底物(例如碾碎的小麦)上来配制饲料添加剂组合物。
在一个实施例中，饲料添加剂组合物可以被配制成预混物。仅举个实例，该预混物可包含一种或多种饲料组分，例如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。
在一个实施例中，将至少一种dfm和/或糖苷水解酶，例如α-l-岩藻糖苷酶(无论是否包入胶囊内)和/或至少一种蛋白酶用至少一种生理学上可接受的载体配制，该载体选自以下中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰岩(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、na2so4、滑石、pva、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐及其混合物。
在一些实施例中，糖苷水解酶(例如α-l-岩藻糖苷酶)将处于生理学上可接受的载体中。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和失活病毒颗粒。可以使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。治疗组合物中的药学上可接受的载体可另外含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，辅助物质，例如润湿剂或乳化剂或ph缓冲物质，可能存在于这类组合物中。此类载体使得药物组合物能够配制成用于被患者摄取的片剂、丸剂、糖衣糖、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂和混悬剂。一旦配制，可以直接向受试者施用本发明的组合物。待治疗的受试者可以是动物。然而，在一个或多个实施例中，这些组合物适合于向人类受试者施用。
在此公开的组合物和方法的非限制性实例包括：
1.一种预防和/或治疗动物肠道病原体感染和/或腹泻的方法，其中所述病原体感染和/或腹泻由能够结合动物肠细胞的病原体引起，其中所述病原体的结合依赖于病原体结合位点的存在，所述病原体结合位点具有被至少一个α-1,2-l-岩藻糖部分取代的至少一个聚糖结构，所述方法包括向所述动物施用有效量的能够从所述病原体结合位点去除至少一个α-1,2-l-岩藻糖部分的糖苷水解酶。
2.如实施例1所述的方法，其中所述糖苷水解酶是α-l-岩藻糖苷酶。
3.如实施例2所述的方法，其中所述α-l-岩藻糖苷酶选自糖苷水解酶家族95(gh95)和糖苷水解酶家族29(gh29)。
4.如实施例2所述的方法，其中单独地或者与能够(a)将血型a抗原转化为血型h抗原或(b)将血型b抗原转化为血型h抗原的酶组合，所述α-l-岩藻糖苷酶能够从含有聚糖的结构中除去末端α-1,2-连接的岩藻糖基团。
5.如实施例1所述的方法，其中所述病原体是表达f18菌毛的大肠杆菌。
6.如实施例1或2所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述动物施用有效量的与至少一种直接饲喂的微生物组合的糖苷水解酶或α-l-岩藻糖苷酶。
7.如实施例6所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述动物施用有效量的与至少一种直接饲喂的微生物和至少一种蛋白酶组合的糖苷水解酶或α-l-岩藻糖苷酶。
8.如实施例1或7中任一项所述的方法，其中所述α-l-岩藻糖苷酶是包入胶囊内的。
9.如实施例6所述的方法，其中所述α-l-岩藻糖苷酶是包入胶囊内的。
10.如实施例1或7中任一项所述的方法，其中所述α-l-岩藻糖苷酶和/或所述直接饲喂的微生物和/或所述蛋白酶在动物饲料或预混物中施用。
11.如实施例6所述的方法，其中所述α-l-岩藻糖苷酶和/或所述直接饲喂的微生物和/或所述蛋白酶在动物饲料或预混物中施用。
12.如实施例1或7中任一项所述的方法，其中所述α-l-岩藻糖苷酶呈颗粒的形式。
11.如实施例6所述的方法，其中所述α-l-岩藻糖苷酶呈颗粒的形式。
12.一种用于预防和/或治疗患有肠道病原体感染和/或腹泻的动物的组合物，其中所述病原体感染由能够结合动物肠细胞的病原体引起，其中所述病原体的结合依赖于病原体结合位点的存在，所述病原体结合位点具有被至少一个α-1,2-l-岩藻糖部分取代的至少一个聚糖结构，所述预防和/或治疗包括向所述动物施用有效量的能够从所述病原体结合位点去除至少一个α-1,2-l-岩藻糖部分的糖苷水解酶。
13.如实施例12所述的组合物，其中所述糖苷水解酶是α-l-岩藻糖苷酶。
14.如实施例13所述的组合物，其中所述α-l-岩藻糖苷酶选自糖苷水解酶家族95(gh95)和糖苷水解酶家族29(gh29)。
15.如实施例13所述的组合物，其中单独地或者与能够(a)将血型a抗原转化为血型h抗原或(b)将血型b抗原转化为血型h抗原的酶组合，所述α-l-岩藻糖苷酶能够从含有聚糖的结构中除去末端α-1,2-连接的岩藻糖基团。
16.如实施例12所述的方法，其中所述病原体是表达f18菌毛的大肠杆菌。
17.如实施例12或13所述的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种直接饲喂的微生物。
18.如实施例17所述的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种直接饲喂的微生物和至少一种蛋白酶。
19.如实施例12或18中任一项所述的组合物，其中所述α-l-岩藻糖苷酶是包入胶囊内的。
20.如实施例17所述的组合物，其中所述α-l-岩藻糖苷酶是包入胶囊内的。
21.如实施例12或18中任一项所述的组合物，其中所述α-l-岩藻糖苷酶和/或所述直接饲喂的微生物和/或所述蛋白酶作为饲料或预混物向动物施用。
22.如实施例17所述的组合物，其中所述α-l-岩藻糖苷酶和/或所述至少一种直接饲喂的微生物和/或所述至少一种蛋白酶作为饲料或预混物向动物施用。
23.如实施例12或18中任一项所述的组合物，其中所述α-l-岩藻糖苷酶以颗粒形式施用。
24.如实施例17所述的组合物，其中所述α-l-岩藻糖苷酶以颗粒形式施用。
实例
除非在此另外定义，在此所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。singleton等人，dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology[微生物学和分子生物学词典]，2d版，约翰威利父子公司(johnwileyandsons)，纽约(1994)，以及hale和marham，theharpercollinsdictionaryofbiology[哈珀柯林斯生物学词典]，harperperennial[哈珀永久出版社]，纽约州(1991)为技术人员提供了本披露中所使用的许多术语的通用词典。
本披露在下面的实例中进一步定义。应该理解，这些实例尽管说明了某些实施例，但仅以示例的方式给出。从以上的讨论和所述实例中，本领域的技术人员能够确定本披露的本质特性，并且在不脱离本披露的实质和范围的情况下，可进行各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。
一般方法
标准重组dna和分子克隆技术是在本领域熟知的，并且描述于以下文献中：sambrook,j.和russell,d.,molecularcloning:alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册]，第三版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约州(2001)；和silhavy,t.j.、bennan,m.l.和enquist,l.w.，experimentswithgenefusions[基因融合实验],冷泉港实验室，冷泉港出版社，纽约州(1984)；以及ausubel,f.m.等人，shortprotocolsinmolecularbiology[简明分子生物学试验方案]，第5版，currentprotocols[当前试验方案]，约翰威利父子公司(johnwileyandsons，inc)，纽约州，2002。
实例1
岩藻糖苷酶的鉴定、克隆和表达
a.在枯草芽孢杆菌中克隆和表达细菌性岩藻糖苷酶
将编码成熟细菌性岩藻糖苷酶序列的合成基因经密码子优化并由捷瑞公司(generay)(上海，中国)合成。将合成的基因插入p2jm和p3jm载体(vogtentanz(2007)，proteinexpr.purif.[蛋白质表达与纯化]，55:40-52)。克隆到两种载体中的基因都处于apre启动子的控制下，不同之处在于p2jm载体还含有apre信号序列(其用于引导枯草芽孢杆菌中的靶蛋白分泌)，和编码肽ala-gly-lys以促进该靶蛋白分泌的称为agk-proapre的寡核苷酸。对于插入p3jm载体中的基因，将起始密码子和编码成熟蛋白的基因序列置于apre启动子之后。示例性质粒图谱示于图1a和1b中。
使用illustratempliphi100扩增试剂盒(ge医疗集团生命科学部(gehealthcarelifesciences)，新泽西州)扩增所述质粒。使用本领域已知的方法(wo01/14490)用扩增产物转化合适的枯草芽孢杆菌菌株。在补充有5ppm氯霉素的luria琼脂板上选择枯草芽孢杆菌转化体。将来自转化板的菌落接种到5mllb培养基中，并在37℃下孵育过夜。含有这些质粒的枯草芽孢杆菌转化体的选择性生长在37℃下在含有5ppm氯霉素的mbd培养基(基于mop缓冲液的富集的半定义培养基，以尿素为主要氮源，以葡萄糖为主要碳源，并补充有4％大豆蛋白胨用于稳健的细胞生长)中进行40小时。通过离心收获细胞，并通过sds-page分析细胞和上清液。用sds-page凝胶上的可见蛋白条带证实细菌性岩藻糖苷酶表达。
b.在里氏木霉中克隆和表达所选的岩藻糖苷酶
基于预测的蛋白质序列对真菌性岩藻糖苷酶基因进行密码子优化，并由捷瑞公司(上海，中国)合成。将合成的和扩增的基因都插入pgxt载体(与公开的pct申请wo2015/017256中所述的ptttpyr2载体相同)中。使在pgxt载体中克隆的基因处于cbh1启动子的控制之下，并且将天然信号肽用于表达。示例性质粒图谱显示在图2中。
使用原生质体转化，用表达质粒转化合适的里氏木霉菌株(在公开的pct申请wo05/001036中描述的方法)(te’o等人(2002)，j.microbiol.methods[微生物学方法杂志]，51:393-99)。在含有乙酰胺(作为唯一氮源)的培养基上选择转化体。在乙酰胺板上生长5天后，收集转化体并使其在含有葡萄糖和槐糖混合物的限定培养基中的250ml摇瓶中发酵。通过过滤收集发酵液的上清液并进行sds-page用于表达。用sds-page凝胶上的可见蛋白条带证实真菌性岩藻糖苷酶表达。
实例2
使用岩藻糖基乳糖底物对岩藻糖苷酶进行生物化学表征
1.针对粗培养上清液中的α-1,2-岩藻糖苷酶活性的测定
为了鉴定活性α-1,2-岩藻糖苷酶，使用10mm2'-岩藻糖基乳糖作为底物，在37℃下测定表达的细菌性和真菌性岩藻糖苷酶的粗培养上清液。通过将5μl粗样品分别添加至在50mm乙酸钠缓冲液(ph5.0)和50mmnaoh-hepes缓冲液(ph8.2)中的45μl底物溶液中来引发反应。在与空白对照相同的条件下测定没有所表达的酶的粗样品。10min后，使用k-岩藻糖试剂盒(梅格泽姆公司，爱尔兰)检测释放的l-岩藻糖。观察到的岩藻糖苷酶活性，在340nm处以吸光度(减去酶空白)进行测量，报道于图3中。
2.对特定的α-1,2-岩藻糖苷酶活性的测量
纯化若干种所表达的岩藻糖苷酶用于进一步表征。用10mm2'-岩藻糖基乳糖测量纯化的岩藻糖苷酶的比活性。在反应之前，从适当的剂量(例如5ppm)开始，通过六轮的2倍连续稀释来制备酶溶液。通过向在50mm磷酸钠缓冲液(ph6.8)中的45μl底物溶液中添加5μl的稀释的酶样品或水(空白对照)，接着在37℃下孵育10min来引发反应。使用k-岩藻糖试剂盒检测所释放的l-岩藻糖。用吸光度变化作为y值并且用酶剂量作为x值产生剂量响应曲线，并且将这些曲线的线性部分用于计算纯化的酶样品的比活性。一个单位的α-1,2-岩藻糖苷酶活性被定义为在所述测定的条件下每分钟可以催化释放一微摩尔l-岩藻糖的酶的量。表2中给出了所有岩藻糖苷酶的特定的α-1,2-岩藻糖苷酶活性。据观察，在这些条件下，来自gh95家族的细菌性α-1,2-岩藻糖苷酶显示出比其他酶更高的比活性。
实例3
各种岩藻糖苷酶的ph和温度特征
测定岩藻糖苷酶以确定它们的ph和温度特征。为了确定最佳ph，在ph范围为从3.0至10.0的50mm乙酸钠/hepes/甘氨酸缓冲液中测量了37℃下α-1,2-岩藻糖苷酶候选者水解2'-岩藻糖基乳糖的能力。为了确定最佳温度，在30℃至90℃以10°间隔测量岩藻糖苷酶候选者在50mm磷酸钠缓冲液中水解2'-岩藻糖基乳糖的能力。所有反应一式两份进行并进行10min。结果显示于图4、图5以及表3中。
实例4
在低ph和在胃蛋白酶存在下评估岩藻糖苷酶活性
为了评估α-1,2-岩藻糖苷酶候选者在低ph和胃蛋白酶抗性时的岩藻糖苷酶活性，将酶样品分别与在50mm甘氨酸-hcl缓冲液(ph3.5)和50mm乙酸钠缓冲液(ph5.0)中的胃蛋白酶(西格玛公司，目录号p7000)一起孵育。将100ppm岩藻糖苷酶与胃蛋白酶以1:0、1:2.5、1:25、和1:250的比率混合，并将酶混合物在37℃下孵育。同时，在37℃和4℃下，将100ppm岩藻糖苷酶单独在50mm磷酸钠缓冲液(ph6.8)中孵育(作为对照)。孵育30min后，将酶样品稀释至适当剂量，并且随后在37℃下，在50mm磷酸钠缓冲液(ph6.8)中用2'-岩藻糖基乳糖进行测定。在与空白对照相同的条件下测定纯化水。计算残留的α-1,2-岩藻糖苷酶活性为100x净od340(经孵育的酶)/净od340(在4℃下储存的酶)。所有反应均如重复那样进行。图6a和6b中所示的结果显示，细菌性α-1,2-岩藻糖苷酶对该测定的酸性条件(ph3.5)不耐受，但在较弱酸性条件(ph5.0)下是稳定的。
实例5
评估各种天然底物上的岩藻糖苷酶活性
评估α-1,2-岩藻糖苷酶候选者对猪胃黏蛋白(ii型)和h抗原三糖(i型)的水解活性。使用2ppm和20ppm的酶样品测定40mg/ml猪胃黏蛋白(ii型)的水解而使用0.25ppm和1ppm的酶样品测定3mmh抗原三糖(i型)的水解。使用实例4的部分2中描述的测定条件进行这两个反应，持续10分钟。所有反应均在37℃下在50mm磷酸钠缓冲液(ph6.8)中进行。在与空白对照相同的条件下测定纯化水。如图7和图8中所示，除crc08400外，来自gh95家族的细菌性α-1,2-岩藻糖苷酶对黏蛋白和h抗原三糖(i型)都显示出更高的水解活性。具体而言，crc08392在黏蛋白降解上显示出最高活性(表4)，而crc08394和crc08401在水解h抗原三糖(i型)方面最具活性(图8)。
实例6
岩藻糖苷酶对f18+etec菌株粘附至肠细胞培养物的体外影响
将新生猪空肠衍生的ipec-1(acc-705；dsmz，布伦瑞克，德国)细胞接种在96孔板(nunc)中并允许使其附接16小时。对照孔只接受没有细胞的培养基并用作对照。将岩藻糖苷酶在缓冲液1(12.5mmhepes，141mmnacl，0.5mmmgcl2，0.15mmcacl2，0.1％明胶，ph6)中稀释并添加到含有单独的ipec-1细胞或培养基的96孔板中，终浓度为2ppm、20ppm或200ppm，总体积为100μl。将板在37℃下孵育30分钟。孵育后，将板用100μl缓冲液2(12.5mmhepes，141mmnacl，0.5mmmgcl2，0.15mmcacl2，0.1％明胶，ph7.4)洗涤。基本上如以下文献中所述测量f18etec对ipec-1细胞的粘附：hedegaardcj、strubeml、hansenmb、lindvedbk、lihmea、boyem等人(2016)，naturalpigplasmaimmunoglobulinshaveanti-bacterialeffects:potentialforuseasfeedsupplementfortreatmentofintestinalinfectionsinpigs[天然猪血浆免疫球蛋白具有抗菌作用：可用作饲料补充物用于治疗猪肠道感染]，plosone[公共科学图书馆]11(1):e0147373，不同之处在于在本实验中使用f18+etec菌株，而不与免疫球蛋白一起孵育。
实例7
岩藻糖苷酶对降低的f18etec定植的体内影响
a.制备控释岩藻糖苷酶颗粒
使用下表5中的配方制备控释岩藻糖苷酶颗粒。向vectorfl-1流化床包衣机中添加670克筛分至150至355微米的硫酸钠晶体(minerasantamarta公司，西班牙)作为颗粒芯。将这些芯在入口温度为70摄氏度和流化气流为50cfm下进行流化。
制备酶溶液，该溶液由400克的25％w/w岩藻糖苷酶超滤浓缩物(其充分与250克的erkol5-88(erkol公司，瓜尔多，西班牙)部分水解的聚乙烯醇的16％w/w水溶液混合)组成。将指定为“sp1”的酶-pva溶液以20psi的雾化压力和7克/分钟的喷雾速率喷雾到流化的芯上，30分钟后将喷雾速率增加到每分钟12克，维持70℃的入口温度。通过将250克的15％w/wpva溶液与200克30％滑石悬浮液合并来制备pva/滑石溶液(sp2)。将pva/滑石混合物以10g/min的速率喷雾到酶包衣的芯上，保持上述入口温度和雾化压力。将两千克的25％w/w硫酸钠溶液(sp3)以15g/min的喷雾速率喷雾到pva/滑石包衣的芯上，保持上述入口温度和雾化压力。最后，通过将1200克的30％w/weudragitl30d-55胶乳悬浮液(赢创公司(evonikcorporation)，肯尼索，佐治亚州)与800克的30％w/w滑石悬浮液合并来制备控释包衣(sp4)，保持上述入口温度和雾化压力。从vectorfl-1包衣机中，收获2000克的控释岩藻糖苷酶颗粒。
b.岩藻糖苷酶饮食对降低的f18etec定植的影响
实例8
对岩藻糖苷酶诱导的从来自小肠(十二指肠)的组织样品释放岩藻糖的评价