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2021.04.13
编译：Jione、song，编辑：十九、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
论文ID
原名：DecipheringtheinterplaybetweenthegenotoxicandprobioticactivitiesofEscherichiacoliNissle1917
译名：解读大肠杆菌Nissle1917的遗传毒性和益生菌活性之间的相互作用
期刊：PLoSPATHOGENS
IF：6.463
通讯作者：EricOswald
通讯作者单位：图卢兹大学
实验设计
本研究利用λRed重组酶的方法顺序构建了双突变体，并使用缺失基因的上下游引物验证了FRT盒的突变。随后对在Mcc基因簇、iroA基因座和clbP-S95R中构建的EcN突变株进行大肠菌素遗传毒性作用的检测，用高效液相色谱/串联质谱分析定性测量了C14-天冬酰胺细菌沉淀物的悬浮量。用含有利福平、链霉素、卡那霉素、羧苄青霉素或氯霉素的M63基本培养基共培养EcN和EcN突变株，并系统的检测此两种共培养竞争菌株的生长情况。20mg链霉素口服饲喂动物，随后进行鼠伤寒沙门氏菌IR715、109以及EcN、EcNclbP、EcNclbPS95R等细菌感染，感染四天后终止，严重程度通过每天的体重减轻、腹痛、发烧和腹泻的迹象进行评估，并进行最后的随机临床评分。最后，使用BLASTn和CA58Mcc基因簇作为参考，搜索了一系列基因（mchB、mchA、mchK、mchL、mchS1、mchL、mchE、mchF）的序列，构建了系统发育树，进行完整的生物信息学分析。
结果
1EcN抗菌活性需要ClbP，但不需要大肠菌素合成途径的其他组件
在突变体中，EcN对LF82的抗菌活性均未改变（图1）。结果证实，成熟的大肠菌素或裂解产物N-酰基-D-天冬酰胺对EcN抵抗LF82的抗菌活性不是必需的。因此，EcN的拮抗活性显然与pks/clb岛和ClbP的存在有关，而大肠菌素不参与EcN的抑制活性。
图1pks/clb岛在LF82细胞EcN抗菌活性中的作用
2EcNClbP依赖性抗菌活性需要MccH47和MccM
EcN对LF82的抗菌活性不受单独的MccM前体基因mcmA或单独的MccH47前体基因mchB缺失的影响（图2）。相反，mcmA和mchB的缺失完全消除了EcN对LF82的抑制作用。同样，缺失编码基因mchE和mchF的MccM和MccH47外排泵导致抗菌活性降低（图2）。与野生型EcN菌株相比，mchE和mchF的反式互补增加了EcN抑制活性（图2），这可能是由于在过表达MchE-MchF外排泵后Mcc增加的输出量。Mcc生产系统中的这些突变均未影响EcN产生活性大肠杆菌的能力。
在转化LF82中编码MccH47或MccM免疫基因的质粒，菌株对EcN具有抗性。EcNΔmchB突变体的抗菌活性在带有MccM免疫基因mcmI的LF82上几乎完全消失（图4A）。使用携带MccH47免疫基因mchI的ΔmcmA突变体和LF82也获得了相似的结果（图4B）。结果证实，针对LF82的EcN抑制活性是由于MccH47和MccM引起的，并且该活性是ClbP依赖性的。
图2微霉素基因簇在LF82细胞EcN抗菌活性中的作用
图4ClbP催化和跨膜结构域在LF82细胞EcN抗菌活性中的作用
3EcNClbP依赖的抗菌活性是由于产生了铁载体Mcc
mchC和mchD的EcN突变体失去了对LF82的抗菌作用，而互补作用则恢复了初始表型（图2）。这些结果表明，EcN抗菌活性需要用肠杆菌素衍生的部分对MccH47和MccM进行翻译后修饰。简而言之，EcNClbP依赖性抗菌活性归因于铁载体Mcc。
图3铁素体在EcN抗菌活性中的作用
4EcN的抗菌活性需要ClbP跨膜结构域，而不是周质肽酶结构域
用带有该融合物的质粒转化的EcNΔclbP突变体表现出与EcNWT菌株相似的对LF82的抑制活性（图4），但没有引起巨噬细胞增多。因此，与仅对遗传毒性活性至关重要的ClbP周质肽酶结构域相反，包含三个跨膜螺旋的ClbPC末端结构域对EcN抗菌活性至关重要。每个直系同源物在EcNΔclbP背景中的表达完全恢复了EcN的抗菌活性（图5）。Mcc外排泵的过表达恢复了EcNΔclbP突变体的拮抗活性，而ClbP的过表达对EcNΔmchEF突变体的活性没有影响（S6图）。总之，ClbP可以充当辅助因子，促进EcN铁载体Mcc的输出。
图5一个失活ClbP催化域的基因组点突变可以消除EcN的基因毒性，但不影响LF82的抗菌活性
5在clbP基因中具有点突变的EcN菌株具有非遗传毒性，但仍具有拮抗活性，并减少了鼠伤寒沙门氏菌的肠道定殖和致病力
EcN突变体不会产生大量的前辅酶原切割产物N-酰基-D-天冬酰胺，并且对于感染的HeLa细胞没有遗传毒性，如组蛋白H2AX表型的阴性巨细胞增多和磷酸化所示（图5A和5B）。clbP-S95R突变体仍对LF82表现出抗菌活性，类似于野生型遗传毒性EcN菌株（图5C）。
当单独给药时，鼠伤寒沙门氏菌很容易在肠道内定植，这与较高的临床评分和强肠沙门氏菌病有关（图6）。在与野生型EcN并用的动物中，鼠伤寒沙门氏菌的粪便定殖和临床评分明显降低（图6A和6B）。感染后第2天，EcN明显胜过鼠伤寒沙门氏菌（图6C）。相反，与EcNΔclbP突变体共同施用的动物表现出更高的临床评分，并减少了鼠伤寒沙门氏菌定植的拮抗作用，证明了ClbP在急性沙门氏菌结肠炎中对EcN有益的作用。与野生型EcN相似，EcNclbP-S95R菌株可大大减少粪便脱落并胜过鼠伤寒沙门氏菌，并降低临床评分（图6）。
总之，这些结果表明，EcN的遗传毒性活性可能与它的抗菌活性脱钩，而且大肠菌素和铁载体-Mcc的生物合成途径相当复杂。
图6一个clbP缺失，但不是一个基因组点突变失活clbP催化域，损害EcN针对肠道病原体鼠伤寒沙门氏菌的保护
6在带有截短的Mcc基因簇和pks岛的一部分大肠杆菌菌株中观察到了ClbP依赖性抗菌活性
在EcN中，同时带有截短的Mcc基因簇和pks岛的三种野生型菌株均表现出显着的抑制作用。所有三个相应的ΔclbP突变株的抑制作用均显着降低，而ClbP互补则恢复了初始表型。相比之下，在仅携带pks岛的菌株中，无论是用野生型菌株还是ΔclbP突变体培养，LF82的生长都没有显着差异。结果表明，肽酶ClbP参与了既带有pks岛又呈截短形式的Mcc基因簇的大肠杆菌菌株中的MccH47和MccM抗菌活性。结果还表明，这种关联在致病菌和益生菌菌株中均存在。
7pks，沙门氏菌素以及MccH47和MccM基因簇在大肠杆菌种群中的分布
带有截短的Mcc基因簇的大肠杆菌菌株表现出铁载体-Mcc依赖性抗菌活性（图7A）。这种抗菌活性需要产生基因毒素的细菌合成途径中的ClbP和产生铁载体沙门麦角菌素的生物合成途径中的IroB。缺少负责翻译后修饰的mcmL和mcmK基因的菌株都属于B2系统群，并携带pks岛和iroA（图7B），除了被剥夺pks岛的1105菌株。相反，携带mcmL/mchA和mcmK/mchS1的菌株属于B1，C或D系群，而没有pks岛。这些特定的遗传决定因素关联导致了这样一个假设，即截短的岛几乎仅存在于携带pks和iroA基因座的菌株中。这表明大肠菌素、沙门麦角菌素和铁载体Mcc生物合成途径之间的这种相互作用是由于在致病性或益生菌菌株中的共同选择。
图7小菌素、pks和iro岛在大肠杆菌中的组织与分布
结论
EcN作为益生菌已使用了一个多世纪，具有许多治疗益处。但现在人们开始担忧EcN管理的安全性。据报道，EcN导致婴儿严重败血症，其基因组显示出致病岛pks，其编码大肠埃希菌（coalbactin），大肠埃希菌菌株的真正毒力因子负责肠道外感染。另外，运输产生大肠菌素的大肠杆菌也可能不利于肠内稳态。在成年大鼠中，它增加了肠上皮的通透性，并导致肠细胞遗传毒性损伤的迹象，例如隐窝裂变和细胞增殖增加。在易患大肠癌的小鼠中，pks阳性的大肠杆菌增加了肿瘤的大小和数量。在几项人类研究报告中，与对照组相比，大肠癌活检中pks阳性的大肠杆菌过高。总体而言，这些研究表明，产生大肠菌素的细菌可以促进肿瘤发生。因此，本研究的目标是了解基因毒素大肠菌素的产生与pks岛在EcN益生菌活性中的有益作用之间的相互作用。
在先前研究中，构建了一个非基因毒性的EcNPPTaseClbA突变体，该突变体也失去了其益生菌活性。随后，发现PPTaseClbA有助于肠抑素（因此也包括沙门氏菌素）和耶尔西菌素的合成。在本研究中，证明了salmochelin（iroB）与Mcc基因簇之间存在协作关系，两者均位于EcN基因组岛I和pks岛（clbP）上（图8）。这些决定因素之间的交织是如此紧密，以至于大肠杆菌杆菌素和Mcc的生产都涉及单一蛋白ClbP。到目前为止，ClbP仅被描述为一种肽酶，可从前辅乳素中去除C14-天冬酰胺前药支架。尽管具有三个跨膜螺旋的完整C末端结构域对于ClbP的生物活性是必需的，但催化活性是由N末端周质结构域完成的。在这项研究中，证明了由于MccH47和MccM，缺乏已知酶功能的ClbP的C末端域对于EcN拮抗活性是必需的。
尽管IroB似乎替代了EcN中不存在的肠杆菌素葡萄糖基转移酶McmL，但McmK同源IroD对于EcN拮抗活性不是必需的。在没有另一个肠杆菌素酯酶同系物的情况下，可以推测EcNMcc的肠杆菌素部分不是线性的，而是保持环状。此外，蛋白复合物MceIJ是肺炎克雷伯菌菌株E492中EcNMchCD的同系物，可识别并连接肠杆菌素的环状和线性化糖基化衍生物。罗曼诺等最近证明ATP结合盒出口商McjD是MccJ25的高度特异性。ATP结合和书出MchEF在MccH47和MccM生产菌株之间是保守的，无论微素基因簇是否“完整”（例如，MchE的差异仅为1.2％（n=5），而MchE的差异仅为1.3％（n=9））。在EcN和大肠杆菌H47之间的氨基酸水平上的MchF，带有“完整的”铁载体-Mcc基因簇。在EcN中，结果显示该泵的过表达消除了EcN拮抗作用的ClbP依赖性，并且与“ClbP样”蛋白的异源互补恢复了EcN的抗菌作用。因此，ClbPC末端跨膜结构域可以促进铁载体Mcc的输出（图9）。
最近的一项研究表明，在小鼠中共同给药后，MCC是EcN胜过鼠伤寒沙门氏菌的关键因素。在本研究中，使用类似的小鼠感染模型，clbP的缺失导致部分对鼠伤寒沙门氏菌的保护作用丧失。相反，单核苷酸突变clbP-S95R与野生型益生菌一样能有效地胜过鼠伤寒沙门氏菌并减少沙门氏菌病的临床症状。结合体外数据，表明EcN需要Mcc和ClbP，不需要成熟的大肠菌素或C14-天冬酰胺来保护鼠伤寒沙门氏菌。EcNclbP-S95R在感染的培养细胞中没有诱导任何基因毒性迹象。这为工程设计可以安全使用的源自EcN的益生菌开辟了道路。
总之，pks岛与EcN益生菌活性的联系甚至比预期的更为紧密。这种紧密联系可能反映了益生菌，适应性和致病因素的共同进化，以适应各种环境。通过专门针对ClbP的酶促结构域使拮抗剂与基因毒性活性脱钩，为安全使用EcN开辟了道路。
大肠杆菌Nissle1917（EcN）被用作益生菌已有一个多世纪的历史。但是，它会产生基因毒素大肠菌素，这种毒素与某些大肠杆菌菌株的毒力有关，并可能引发结直肠癌，并且具有致癌性的菌株作为益生菌易引起公众健康问题。因此，本研究的目标是将EcN的遗传毒性活性与其拮抗作用分开，EcN的益生菌特性是其最独特的特征之一。结果证明，EcN的微素活性需要ClbP（一种产生大肠杆菌素的酶）和另一种参与铁载体salmochelin合成的酶。这种相互作用是在其他大肠杆菌菌株中发现，从尿液中分离。因此，大肠杆菌菌株利用来自三种不同代谢途径的决定簇来合成铁载体微霉素。对大肠杆菌素生产必不可少的ClbP肽酶活性在铁载体微霉素活性中无影响，这提供了一种构建保留其抗菌活性的非遗传毒性菌株的方法，为安全使用EcN鉴定了基础。