在宏基因组学支持的统一OneHealth战略中协调病原体监测工作流程将带来额外的好处，即其他公共卫生优先病原体在危机时期不会被降级。
编译：微科盟小木，编辑：微科盟居居、江舜尧。
论文ID
原名：Metagenomics-enabledmicrobialsurveillance
译名：宏基因组学支持的微生物监测
期刊：NatureMicrobiology
IF：30.964
通讯作者：NiranjanNagarajan
通讯作者单位：新加坡基因组研究所
DOI号：10.1038/s41564-022-01089-w
综述目录
1前言
2公共卫生的传统病原体监测
2.1预防和管理暴发
2.2食品和水安全
2.3人-动物-生态系统界面
2.4社区卫生
2.6AMR监测
2.7整合病原体监测
3用于病原体监测的宏基因组学
3.1样品采集
3.2核酸提取
3.3文库制备和测序
3.4生物信息学分析
4案例学习
4.1城市环境和交通系统
4.2从污水中追踪AMR
4.3医疗环境
4.4人畜共患病病毒库
5宏基因组学监测的广泛应用面临的挑战
6突破性技术
7展望
主要内容
传统的食品微生物安全监测依赖于风险评估以及随后有针对性地检测食品中的病原体和卫生或安全指示生物。从复杂的食物基质中富集和选择特定物种需要多种培养方法(表1)。对食源性AMR的监测基于对选定的食源性致病菌的敏感性测试。对于饮用水，微生物污染的监测也同样基于风险评估。虽然广泛采用了对指示性细菌生物(例如大肠杆菌)的监测，但对水传播病毒和原生动物病原体的监测并未得到一致解决。自2010年代初以来，WGS也已在高收入国家有效部署，以追踪食源性病原体来调查疫情。值得注意的是，尽管低收入国家的食源性疾病负担最高，但这些国家往往缺乏采用WGS来缓解疫情的资源。
表1微生物监测策略。
监测废水(污水)处理系统经常被认为是评估社区健康的一种有前景的方法，并已在埃及、印度、以色列、巴基斯坦、阿富汗和尼日利亚等多个国家的脊髓灰质炎根除计划中得到采用(表1)。COVID-19大流行加速了改善样本处理和检测灵敏度的研究，并有助于进一步强调废水监测在发现和阻断暴发集群方面的有效性(图1)。然而，从废水中分离病毒需要专门的实验室设置和专业人员。对于高风险病原体，例如严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)，对超出常规临床诊断范围的样本进行操作需要生物安全3级控制，只有资源充足且拥有高技能人员的研究中心才能做到这一点。
全球抗菌素耐药性监测系统(GLASS)网络促进了AMR监测，并使世界各地参与国能够收集、综合分析和共享标准化的人类细菌病原体AMR数据。当前状态下的AMR监测依赖于目标病原体的成功培养和分离(表1)。然后对培养分离物进行标准化的抗菌药敏试验，以检测预先确定的抗生素组。存在于食物链、农作物、动物和环境中的AMR可以通过水平基因转移转移到人和动物的细菌病原体中，从而影响人和动物的健康。然而，这些非医疗保健领域的AMR监测还不够完善和标准化。
病原体监测的宏基因组工作流程通过使用测序作为读数来统一。长读长和短读长测序技术都已用于宏基因组学，其中可以使用计算方法筛选序列数据，以重建不受培养物或参考基因组可用性限制的精细输出。
表2宏基因组工作流程中取得成功的步骤。
对于每个目标，讨论了宏基因组工作流程的各个阶段可能需要的潜在解决方案。a样品处理步骤中生物量的损失或减少可能导致用于文库制备的DNA不足，最终导致测序分析失败。b如前所述，全基因组扩增产生嵌合体。
核酸提取方案的选择主要取决于使用苛刻的物理破坏(如珠击)有效裂解细胞的能力与通过酶混合物(如MetaPolyzme)处理保持DNA完整性的重要性之间的权衡，MetaPolyzme是无色肽酶、几丁质酶、裂解酶、溶葡萄球菌素、溶菌酶和变溶菌素的混合物。由于PCR抑制剂的存在，并且需要将核酸从具有不同大小和稠度的碎片的复杂基质中分离出来，某些样本类型的处理本身就更具挑战性，例如粪便、食物和土壤样本。相应地，一些测序方案可能不那么宽容，需要合适的核酸数量和质量才能实现最佳通量。影响这一步骤的另一个方面是样品中微生物核酸的相对比例，这是影响分析成本、灵敏度和可行性的一个因素。微生物富集可以在核酸提取之前进行(例如，通过离心、过滤、培养富集或流式细胞术)，也可以作为方案的一部分，例如，使用选择性裂解步骤来消耗真核细胞或使用靶向探针来富集和扩增微生物DNA(表2)。
宏基因组数据的分析可以在不同的分辨率下进行，从使用分类器识别和量化特定分类群到基因和通路分析，最后到全基因组重建、注释和系统发育分析。这是由一系列专业工具推动的，如分类分类器、读取映射器、通路重建工具和基因组组装程序。在表3中，我们重点介绍了一些更流行的管道和Web工具，它们将这些功能集成到非专业人士可以访问的用户友好工作流程中。此外，还有用于病原体检测和识别的云部署临床宏基因组计算工作流程，如SURPI和IDseq。对于宏基因组监测，提高生成宏基因组组装基因组(MAGs)的能力是一个变革因素，因为它们能够实现更细粒度的传播分析和更全面的抗生素耐药性预测。其中包括改进的分箱策略，用于检索属于同一基因组的短读长contigs，以及规避更高错误率以产生更多连续组装的长读长和混合组装程序。现在可以从宏基因组数据集中重建近乎完整的基因组，但灵敏度和准确性仍有待提高，特别是在一个物种的多个相似菌株存在于一个群落中的情况下。
在MAGs生成后，可以使用两种主要方法进行系统发育分析，以辅助流行病学追踪和传播分析：(1)多位点(多基因)比对和(2)全基因组比较。虽然全基因组分析原则上提供了更高的分辨率，但水平基因转移、重组事件和重复区域的较高错误率会影响结果。通常使用平均核苷酸同源性(ANI)阈值来推断传播，但这些阈值需要根据特定病原体的进化速率进行调整。AMR基因分析通常通过映射和比对到CARD、ARG-ANNOT和MEGARes2.0等参考数据库来完成。由于这些方法可能存在假阴性、任意覆盖率和身份分界值，因此已提出深度学习方法作为替代方案。此外，通过使用Hi-C技术将移动和染色体外AMR基因与宿主联系起来，促进了对这些基因的分析。
表3用于端到端宏基因组分析的生物信息学管道。
在下文中，我们将讨论揭示如何使用宏基因组监测的案例研究，包括作出的具体选择和经验教训，以及这将如何指导未来实施宏基因组监测的努力。
5宏基因组学
监测的广泛应用面临的挑战尽管在监测中实施宏基因组工作流程有着坚实的理论基础，但广泛采用该技术仍存在挑战。在本节中，我们将重点介绍其中的一些问题，并讨论将为常规应用铺平道路的正在进行的开发。
5.1灵敏度、特异性和标准化
6突破性技术最近的几项进展将对加速监测工作产生影响。
6.1机器人技术和实验室自动化简化的宏基因组分析工作流程使其能够适应各种形式的自动化，从而提高了传统监测策略的可扩展性、安全性和可重复性。特别是，开源自动化平台(例如Opentron和VoITRAX)通过共享可直接部署到参与实验室自动化系统的数字协议实现无缝湿式清洗台标准化。
图2使用宏基因组学协调病原体监测。示意图说明跨学科OneHealth监测的机会，利用宏基因组测序作为统一工作流程和协调数据的方式。强调了这种整合的关键驱动因素，包括气候变化及其对人畜共患病库、全球化和国际旅行、医疗旅游和全球食品贸易的影响。
世卫组织对全球COVID-19应对措施的审查清楚地表明了更好的国际监测和信息共享的重要性，其中专家组建议进行关键的转型变革，以在各方完全透明的基础上建立一个新的全球监测系统，使用最先进的数字工具连接世界各地的信息中心，包括动物和环境健康监测。这将超越目前各国更新治疗指南和抗菌药物管理计划的努力，并可能推动一个由类似于世界贸易组织的多边协议支持的国际合作的新时代。在宏基因组学支持的统一OneHealth战略中协调病原体监测工作流程将带来额外的好处，即其他公共卫生优先病原体在危机时期不会被降级。
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