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2、5-20%见本节“二、检验方法”ph4.5-6.8检测2%水溶液在20下的ph颗粒度要求40目筛分通过率85%标准筛检测50目筛分通过率50%溶解度完全溶解，无肉眼溶物取0.2克乳粉，置于50、200ml水中，充分搅拌2分钟以上，静止后观察。（三）微生物、污染物及真菌毒素指标项目标准检测方法菌落总数（cfu/g）1000gb4789.2-2010大肠菌群（cfu/g）10gb4789.3-2010平板计数法金黄色葡萄球菌（cfu/g）10gb4789.10-2010平板计数法酵母和霉菌（cfu/g）50gb4789.15-2010阪崎肠杆菌（cfu/g）0/100ggb4789.
3、40-2010沙门氏菌（cfu/g）0/25ggb4789.4-2010铅（mg/kg）0.15gb5009.12-2010砷（mg/kg）0.2gb/t5009.11-2003黄曲霉毒素m1（g/kg）0.5gb5009.24-2010二、检验方法（一）用反相高效液相层析法测定乳铁蛋白的纯度1.样品准备对粉状乳铁蛋白，称出20mg乳铁蛋白样品，用milliq水配成20ml，1mg/ml的乳铁蛋白溶液，再通过0.2m的乙酸纤维素膜进行过滤。2.材料和试剂（1）milliq水（超纯水18megohmresistivity）（2）95%的乙腈(氰化甲烷)（hplc级）（3
4、）1%的三氟乙酸（tfa）2.1缓冲液准备（1）缓冲液a：100%milliq水把1lmilliq水装在1l的schott瓶中。（2）缓冲液b：95%的乙腈分别量取50mlmilliq水和950ml乙腈。把二者混合，通过0.45m的滤膜进行过滤。储存在1l的schott瓶中。（3）缓冲液c：1%的三氟乙酸用移液管量取25ml三氟乙酸放入200mlmilliq水中，用milliq水补至250ml。转移到250ml的schott瓶中储存。3.仪器设备（1）水基线体系控制和获得数据的设备（empower）（2）水2695分离组件和2487双吸收检测器（3）反相高效液相
7、下进行检测，当吸光值不再变化的时候说明乳铁蛋白已经完全饱和。2.试剂2.1fecl3.6h2o2.2nta(氨三乙酸)2.3nah2po4.h2o2.4na2hpo4.12h2o2.5nahco32.6naoh2.7nacl3.溶液的配置3.1配置含有10mm氯化铁和0.1mhcl的溶液：（1）在100ml容量瓶中分别加入：-0.83ml37%的hcl-0.270g的fecl3.6h2o(准确称量)（2）加蒸馏水至100ml刻度处3.2配置40mmna-nta溶液：在100ml容量瓶中分别加入:-0.764g的nta-加入大约20
8、ml去离子水-缓慢加入1m的naoh溶液来溶解nta粉末(以形成可溶的nta钠盐)-将1m的naoh逐滴加入，每加入一滴并充分混合直至nta完全溶解3.3配置含有5mmfecl3.6h2o和20mmnanta的溶液-将等量（各20ml）的3.1和3.2溶液混合-用10m的naoh溶液将溶液的ph值调至4-6之间（例如：4.5），但要注意尽可能少的将溶液稀释）3.40.1mnahco3的配置将8.401g的nahco3加入1升蒸馏水中。3.52%乳铁蛋白水溶液的配置-将0.8g乳铁蛋白粉末溶解于40ml蒸馏水中-搅动直至完全溶解4.铁饱和度的测量可以用所
9、配置溶液来测定ph值和在600nm时的透光率，溶液必须经过0.45mmillipore过滤器过滤-将1ml乳铁蛋白溶液注入比色皿-加入1.5ml0.15mnacl和200l的0.1m的nahco3溶液-在465nm下测量溶液的吸光值-加入10l等量的溶液3.3。每加一次，充分混合并在465nm下测量吸光值，直到吸光值变为恒定，也就是说乳铁蛋白趋于饱和。5.结果的表达以纵坐标为吸光值，横坐标为等量三价铁离子浓度作图。直线(1)为当乳铁蛋白趋于饱和时的吸光值。直线(2)为以初始乳铁蛋白吸光值为原点到铁饱和时吸光值的连线。将直线(2)反向延长使其与横坐标交汇。乳铁蛋白
10、初始铁饱和度可以通过以下两种方法计算得出：（1）通过465nm下最初的吸光值(b1)与饱和时溶液的吸光值(b2)的比值计算得出：（2）通过初始乳铁蛋白中三价铁离子的微摩尔数(a1)和饱和乳铁蛋白中三价铁离子的微摩尔数(a)的比值得出：备注：一等份也就是每10l的三价铁离子溶液=0.05molfe3+6.乳铁蛋白浓度测定考虑到1mol的乳铁蛋白可以结合2摩尔的三价铁离子，因此溶液中乳铁蛋白的摩尔数应该是铁离子摩尔数的二分之一。mol乳铁蛋白=0.5molfe3+乳铁蛋白分子量=77,000因此，77,000mol乳铁蛋白10-6=检测溶液中乳铁蛋白的质量（g）。（三）乳制品中
11、乳铁蛋白含量的检测第一部分高效毛细管电泳测定乳制品中乳铁蛋白含量a.1适用范围本方法适用于乳粉和乳铁蛋白原料中乳铁蛋白的定性和定量分析。a.2原理试样经处理后进入毛细管中，在毛细管中充入缓冲溶液，两端加高电压，毛细管中形成电场。样品中带电粒子在电场中以不同速度运动，流经检测器被检测，得到分离谱图，根据峰面积和浓度成正比的关系，计算不同成分的含量。a.3试剂a.3.1实验配制所用水均为超纯水。a.3.2乳铁蛋白标准品（fluka）。a.3.3氢氧化钠：1mol/l溶液。a.3.4硼酸（sigma）。a.3.5csoh（50%水溶液，北京百灵威化学技术有限公司）。a.3.6
12、冰乙酸（优级纯）。a.3.7十二烷基硫酸钠(sds，sigma-aldrieh，货号:l3771)。a.3.8羟乙基纤维素(hec，sigma-aldrieh，货号:54290)。a.3.9hec储备液的配制：hec是一种淡黄色粉末状固体，首先准确量取100ml超纯水置于试剂瓶中，将其放置在60水浴中加热，将准确称量的4ghec逐步加入，涡旋混匀，待其完全溶解即配制成40g/l的hec储备液，放入4冰箱备用。a.3.10运行缓冲液：0.3mol/l硼酸，其中含20mmol/lsds和8g/lhec。首先分别准确称取1.855g硼酸和0.577gsds放入1
13、00ml容量瓶中，加入70ml的超纯水，超声使其溶解，然后再加入20ml质量浓度为40g/lhec储备液，涡旋混匀后用1mol/l的csoh调节ph值到8.80，最后用超纯水定容到刻度线，室温放置备用。a.3.11样品缓冲液：0.05mol/lhac。准确移取1.437ml冰醋酸置于500ml容量瓶中，用超纯水定容到刻度，放入4冰箱备用。a.4仪器a.4.1毛细管电泳仪（带有紫外检测器）。a.4.2电子天平。a.4.3ph计。a.4.4超声振荡器。a.4.5高速离心机a.5操作步骤a.5.1样品的前处理分别称取一定质量的的样品于10ml容量瓶中，加
14、入适量样品缓冲液，涡旋混匀后，再用样品介质稀释定容到刻度，于9000r/min离心10min，取上清液分析。a.5.2测定a.5.2.1标准曲线的绘制准确称取10mg乳铁蛋白标准品于lml样品管中，加入1.5ml样品介质涡旋混匀后，制得10000mg/l的乳铁蛋白标准储备液，放入4冰箱备用。工作液由储备液经0.05mol/lhac稀释后制得。准确移取10、20、40、80、160mg/l质量浓度为5000mg/l的lf标准储备液于lml样品管中，再分别加入990、980、960、920、840mg/l样品缓冲液，混匀后即得50、100、200、400、800
18、g/ml，临用前15min内配制。如配制15ng/ml标准品：取0.5ml100ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推.a.8.3样品稀释液:120ml/瓶。a.8.4检测稀释液a：110ml/瓶。a.8.5检测稀释液b：110ml/瓶。a.8.6检测溶液a：1120l/瓶（1:100）临用前以检测稀释液a1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100l），实际配制时应多配制0.10.2ml。如1l检测溶液a加99l检测稀释液a的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配
19、制。a.8.7检测溶液b：1120l/瓶（1:100）临用前以检测稀释液a1:100稀释，稀释方法同检测溶液a。a.8.8底物溶液:110ml/瓶.a.8.9浓洗涤液:130ml/瓶。使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。a.8.10终止液：110ml/瓶（1mol/lh2so4）。a.9仪器和设备a.9.137恒温箱。a.9.2酶标仪。a.9.3精密移液器及一次性吸头。a.9.4蒸馏水。a.9.5一次性试管。a.9.6吸水纸。a.9.7ph计。a.9.8离心机。a.9.9冰箱。a.10分析步骤a.10.1试样处理称取10g乳粉与三角瓶中，先用40左
20、右温水30ml溶剂样品后调ph4.6后转入50ml容量瓶中定容。将容量瓶放入4冰箱中1h，取出于4000r/min离心10min，取上清液备用。a.10.2试剂盒操作步骤a.10.2.1准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30min。a.10.2.2配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。a.10.2.3加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50l；待测样本孔中先加入待测样本10l，再加样本稀释液40l（即样本稀释5倍）；空白对照孔不加。a.10.2.4
21、温育：37水浴锅或恒温箱温育30min。a.10.2.5洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。a.10.2.6加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50l，空白对照孔不加。a.10.2.7温育：37水浴锅或恒温箱温育30min。a.10.2.8洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。a.10.2.9显色：每孔先加入显色剂a液50l，再加入显色剂b液50l，平板混匀器混匀30s（或用手轻轻震荡混匀30s），37避光显色15min。a.10.2.10测定：以空白孔调零，在终止后15min内，用450nm波长测量各孔的吸光值（o