1、冷冻干燥中冻干制剂的一些问题综述综述2013.6陈亚飞摘要:冷冻干燥技术是生物制剂的主要生产工艺,采用冷冻干燥工艺可保持产品原有的理化性质和生物活性,且有效成分损失极少。干燥后的产品形状、体积、晶型等理化指标均一性好。产品因含水量低而易于长期保存,因疏松多孔而使得加水后可迅速完全溶解。但在冻干制剂的生产或实验中我们总会有一些冻干上的问题,下文就是我们在冻干制剂上的主要问题的分析。关键词:制剂预冻共晶温度玻璃态转化崩解温度干燥稳定性水分保护剂一冷冻干燥技术1冷冻干燥技术的发展随着真空泵和制冷机的出现,冷冻和干燥理念的结合,近些年来冷冻干燥技
3、重要应用。药品方面上包括生物制品(活菌菌苗、活毒疫苗、一些生物制品和生化药品等、化药生产(多位注射剂:抗生素药、循环器官用药、中枢神经用药、维生素类和肿瘤用药等、中药生产(中草药、中成药;医疗事业上对保存血液、动脉、骨骼、皮肤、角膜和神经组织等各种器官上效果良好。2冷冻干燥的定义及优缺点简述冷冻干燥是指将被干燥含水物料冷冻成固体,在低温减压条件下利用水的升华性能,使物料低温脱水而达到干燥目的的一种干燥方法。是将热能通过与物料接触的壁面以传导方式传给物料,使物料中的湿分气化并由周围空气气流带走而干燥的操作。冷冻干燥过程物质本身剩留在冻结时的冰架中,因此它干燥后
6、被除去。升华过程可用水的三相图图1来说明,水在不同的温度和压力下,以气态、液态或固态存在。在相图上,三相点O点以上,可能以固、液、汽三态之一的状态存在,而在三相点以下,只有固汽两相。水的三相点参数为温度0.01,压力610Pa。在610Pa以下给冰加热,就可直接升华为水蒸汽。纯水可在0固化结晶,各种物料中的液体却是含有不同溶质的水溶液,其冻结温度各不相同,物料中水溶液完全冻结的温度为其共晶温度。不同物质或同一物质含水量不同时其共晶温度也各有不同,需经实验得出。图1水的三相图及产品冻干后结构图二预冻条件的优化预冻过程在很大程度上决定了干
8、纯水没有带电离子是不导电的,含有物料的溶液中有带电离子,当物料中水分被冻结,带电离子也会被固定住,导电能力急剧下降,物料的电阻也急剧增加。根据此原理,利用Te的测定设备测定物料降温冻结过程中与冻结后的物料升温融化过程中电阻值的变化最剧烈时对应的温度就是物料的Te。此设备包括万用表、铜电极、物料池、热电阻、温度显示仪五个部件,如今市场上已有代测共晶温度或出售测量设备的卖家。一般预冻结温度比Te低810就可以,保险起见可以比Te低15就应该没问题。多数产品的Te在-15-25之间,若没有条件知道产品Te,一般预冻最低温度定在-40-3
9、5比较合适。对于瓶装产品,小瓶在温度剧变时可能会发生掉底现象,我们曾做过一组预冻试验,在其它条件完全相同的前提下,倒锅底形“”凹底小瓶几乎无掉底现象,圆弧“”凹底小瓶掉底现象明显增多,而平底“-”小瓶则掉底严重。所以选瓶时应试验瓶底对冷冻温度的耐受程度,选择最适宜的温度,以免造成损失。2选择适宜的预冻速率冷冻时形成的冰晶大小会影响干燥速率和干燥后产品的溶解速度,我们必须要根据产品的不同经试验得出一个最佳的冷冻速率。通常介绍冻干理论的书籍都会提到,降温速率越大,溶液的过冷度和过饱和度愈大,临界结晶的粒度则愈小,成核速度越快,容易形成颗
10、粒较多尺寸较小的细冰晶。因而冰晶升华后,物料内形成的孔隙尺寸较小,干燥速率低,但干后复水性好,这就是快冻;相反,慢速冻结容易形成大颗粒的冰晶,冰晶升华后形成的水气逸出通道尺寸较大,有利于提高干燥速率,但冻干后复水性差。有人曾经质疑过这条理论是在受热均匀的前提下得出来的,比较理想,而生产中和实验中的冻干机所提到的冻干条件没有那么理想,在丁香园论坛上看到一位叫tinybayonet的说法,他把快冻慢冻分为以下几类:1、板温降得较快,且板温比产品温度低很多,则制品底部先冻结产生结晶,但上部液体仍较热,所以不至于瞬间全部结晶,结晶会缓慢生长,就得到了慢冻的效果。2、
11、板温降得较慢,板温与品温相差不大,则制品整体均匀降温,并形成过冷,当能量积累足够时,瞬间全部结晶,得到了快冻的效果。3、板温降得很慢,并在低于共熔点的适宜温度保持(或缓慢降温,则制品形成较小的过冷度,液体中先出现少量结晶,继续降温结晶生长,得到大结晶,这即是真正的慢冻。4、制品浸入超低温环境(如液氮,整体瞬间结晶,形成极细小的晶体(或处于无定形态,这即是真正的快冻。我比较赞同他的观点,企业在大多数情况下采用瓶冻的冻干方法的,瓶冻的受热不均匀现象很明显。样品进入冻干箱前的温度越高,样料液上下部分的温度梯度越大,冰晶生长速度越慢。溶液若慢速降温,则形成冰晶比较粗
17、试验探讨之后,我们基本可以认定,正常情况下,产品在到达0时已进入了解吸干燥阶段;而在0以上时即使温度迅速上升,对玻瓶的影响也相对较小。为了确保冻干产品质量,在冻干全过程运行即将结束前进行压力升高试验是很有必要的。具体方法是:关闭冻干箱和冷凝器之间的阀门,注意观察冻干箱压力升高的情况,如果冻干箱内的压力无明显升高,说明干燥已基本完成,冻干可以结束;如果压力明显上升,则说明还有水份逸出,还需继续进行干燥,直至再次试验时,压力无明显上升为止。一般在关阀后3060秒内,压力上升不超过38Pa,此时产品含水率通常约在0.4%2%之间。在产品出箱前,箱
18、内温度最好回复到室温,这样可避免产品出箱后冷却吸湿,另一方面也不会对房间温度造成大的波动。2干燥阶段的水分控制干燥过程对水分的控制是保证冻干制剂质量的关键,说到水分控制我们必须先引入玻璃态转化温度(Tg的概念,有些液体非晶态物料在被冷却固化过程中不经过相变,而是连续地固化成玻璃体,这个过程称为玻璃化转变,所对应的温度称为Tg。当物料到达这一温度时,很小的温度就可能引起冷冻浓缩液黏度的显著增加,同时冰的结晶停止。无论是第一、第二干燥阶段还是贮存中的制剂温度都必须控制在Tg以下,否则冷冻浓缩液将会发生流动,破坏了冷冻建立起来的微细结构,就会
19、发生塌陷。对于冻干制剂药品水分含量的控制,水分含量越低,其Tg越高,药品越能长期稳定地储存,通常冻干制剂的水分含量要求控制在1%3%之间,以保持稳定。用动力学方程计算可以选择冻干终产品更合适的水分含量,既能满足药品在保存期稳定的要求.又避免在生产中因过度干燥而引起能源浪费。另外,有研究表明瓶子的胶塞氯丁基橡胶塞要比溴丁基橡胶塞对水分的透过率高,故除了要选择适宜的湿度环境保存,也要选择合适的包装材料。冻干制剂在一次干燥后往往都要进行二次干燥,二次干燥又叫解析干燥,主要干燥一次干燥残留的一些未被冻结的吸附水和结合水,这些靠升华无法去除的水分要靠蒸发来去除,这部分水
21、态,以便冻结层升华出来的水蒸气顺利通过,是全部产品都能干燥良好。但某些已干燥的产品当温度升高到某一数值时,会失去刚性,变成粘性,发生类似塌方的崩解现象,使干燥产品失去疏松多孔的状态,堵塞了冻结层产品水蒸气升华逸出的通路,妨碍了升华的继续进行。于是升华速率变慢,由搁板供给冻结层的热量将有剩余,引起冻结层产品温度上升,当温度上升到共晶点温度以上时,产品就会发生熔化或产生发泡现象,致使冻干失败,这时的温度叫崩解温度。有些产品的崩解温度高于共晶点温度,升华时只需要控制产品温度稍低于共晶点温度即可;有些产品的崩解温度低于共晶点温度,这样的产品应以控制崩解温
26、成共溶剂体系进行冻干。单独使用时溶解水不溶性药物或水中稳定性不好的药物。另外有研究以叔丁醇作为溶剂溶解磷脂,经冻干后得到结构酥松的磷脂固体,加入水可以迅速水化制成脂质体。这种方法类似薄膜分散法,可以制得粒径较大的微米级多室脂质体,这种脂质体制备工艺已经应用于试验和规模生产。目前更多是叔丁醇与水形成共溶剂体系进行冷冻干燥的研究,其在药剂领域中应用总结起来主要在固体制剂(难溶于水的药物溶于叔丁醇中,水溶性物质溶解于水中,两者以适当的比例混合,得到可以共同溶解水溶性与脂溶性物质的澄明共溶剂,此溶液经进一步冻干可以得到固体分散体。可加快药物升华速度,缩短冻干周期,提高
27、药物稳定性,增溶难溶性药物,简化制备固体分散体工艺,促进药物的结晶。、分散体系(脂质体制备、非离子表面活性剂囊泡的制备、高聚物胶团的制备等、工艺路线改进(蛋白质-多肽的磷脂分散体的制备、难溶性药物在水中的溶解度等三个方面。理想的冻干溶剂需要如下条件:凝固点高、挥发性强、最好能与水混溶。众多有机溶剂中,叔丁醇被认为是最适合的冻干溶剂,主要原因如下:凝固点高,纯的叔丁醇在室温下(25就可以冻结,与水混合后也可以在零下几度冻结,在现有的冻干机中都可以完全冻结。其他的一些有机溶剂如乙醇等凝固点低,一般都在零下几十度才能冻结,一般的冻干机无法将其冻结捕获,最终都进入
29、华,在制剂中残留量很低,可以安全的用于制剂生产中。采用叔丁醇-水共溶剂为溶剂进行冷冻干燥的工艺可以用于多种制剂的制备,在很多方面具有优势。对这项技术进行深入研究,对药剂学基础理论和实际应用具有重要的意义。2冻干保护剂加入冻干保护剂的目的是为了提高冻干产品的质量:赋形剂,可使固体物质的质量分数在4%-25%之间,冻干后形成疏松团块结构;胶状物质可防止冻结前溶质沉淀和冻干后发生破碎;一些物质可做pH的调节剂,提高崩解温度使产品易于干燥;抗氧剂可改善产品的贮藏稳定性和提高其贮藏温度;一些抗冻剂或保护剂可防止一些具有生物活性或病毒等因细胞膜破裂、细胞脱水、
30、细胞质浓缩的等而死亡;一些保护剂可减小或抑制储存过程中活性成分变化,蛋白质的变性和聚集。冻干制剂对保护剂要求很高:纯度高,无抗原性,无毒性;可形成均匀混悬液或溶液,冻干后形成团块,不破碎;在冻干和储存期中对产品有保护作用,但不与活性成分产生化学反应,不破坏药物的活性;其崩解温度和共晶点温度应尽量高,以保证不形成玻璃化冻结外壳;易除热源,引湿性好;冻干升华时不起泡;干燥后复水性好;不影响对冻干制品的检测。几种常用的赋形剂:2.5%-20%的葡萄糖可减轻注射给药的疼痛感;葡聚糖具有较高的玻璃转化温度,能在酶蛋白分子周围形成玻璃态,从而保护酶分子免受高温所引起的损伤;甘
31、露醇(20%-90%,w/w作为载体可形成疏松结实的均匀骨架,改善了制剂产品的外观;氯化钠早期常作为赋形剂,但单独使用盐类冻干后饼状物体积多明显缩小,并出现硬壳和脆散,现在已少用;山梨醇与甘露醇相似,一般作为赋形剂;乳糖加入冻干溶液中可增加体积,并有助于冻干块状物的形成;聚氧乙烯吡咯烷酮(PVP可明显提高蔗糖的玻璃转化温度Tg值(P<0.05,高分子量的PVP能更好的抑制蔗糖结晶,并通过稳定糖的玻璃态结构,共同提高冷冻干燥过程中蛋白和氨基酸的稳定性;海藻糖为葡萄糖的二聚体,为稳定的非还原性双糖,广泛用于血细胞等冻干保存,作为保护剂冻干的样
33、定,起保护蛋白作用。酸碱度调节剂有柠檬酸,乳酸,柠檬酸钠,氢氧化钠,碳酸氢钠。增溶剂和其他附加剂有聚山梨酯、卵磷脂等。3一些保护剂在蛋白和多肽的冻干制剂中的应用甘露醇是一种多羟基化合物,不仅可作为优良的骨架剂使用,也能兼作渗透性调节剂及蛋白质的冻干保护剂。氨基酸也是一种常见的蛋白质保护剂,研究发现,两种低浓度的氨基酸(谷氨酸和精氨酸对PEGrhlFNot2b的冻干保护作用非常显著,可能是因为:二者一个是酸陛氨基酸,一个是碱性氨基酸,加人后使制剂具有了更好的缓冲能力,提高了蛋白质在冻干过程中的稳定性;氨基酸的玻璃化转变温度相对高于非氨基酸缓冲剂,因此
34、可能对冻干制剂的稳定性起到了一定作用;氨基酸的另一种可能的保护机制是在冷冻过程中与蛋白共浓缩,从而起到了稀释和保护蛋白的作用;在冷冻和冻干过程中,两性的氨基酸分子与蛋白分子之间发生特异的相互作用,保护蛋白不变性。糖是最常见、使用最广泛的一类冻干保护剂,是蛋白质的非特异性稳定剂,在冻干的各个阶段均能对蛋白质起到一定的保护作用。蔗糖和海藻糖都是二糖,其中蔗糖化学性质稳定,多呈无定型结构,对阻止蛋白质二级结构改变以及冻干过程中及储存期内蛋白质的伸展和聚集起显著作用。蔗糖也有一个相对较高的玻璃化转变温度,使其在冷冻状态下与蛋白质共浓缩,起到了稀释蛋白质的作用,从而防止了聚合
35、,并且维持蛋白分子的结构。另外蔗糖、海藻糖以及甘露醇上的羟基能替代部分结构水,与蛋白中的羰基和氨基结合形成的氢键使其在缺水的条件下仍能保持原有结构,而不丧失活性。蔗糖具有比其他多元醇更优越的水置换特性。海藻糖的作用与蔗糖相似,但比蔗糖具有更高的玻璃化转变温度和更低的引湿性,且更不具有还原性。4常用细胞冻干保护剂的应用海藻糖在对生物膜保存的研究中发现,海藻糖无疑优于其它糖。这并非说其它糖类不能保护细胞膜,实际上蔗糖也能起到很好的保护作用,但它需要更高的浓度。在一般的冻干保存中,糖类一般与大分子聚合物共同使用,原因是大分子聚合物对细胞冻存过程中
36、的相变没有影响,但可抑制细胞间的聚集和蛋白的融合,而糖类则可降低熔点值(Tm。在细胞冻干过程中,对细胞磷脂囊泡的保护有2个必要条件:抑制囊泡间的融合,在干燥情况下降低Tm值。在溶液状态下,此种物质的Tm值为-1,若在不加海藻糖的条件下干燥,Tm上升到70,若在干燥过程中有海藻糖的参与,Tm被抑制到-20,冻干物质可维持在液晶状态并在复水过程中不发生相变。大分子聚合物和糖类这2种物质的联合应用满足了细胞有效冻干的要求。当然,越来越多的研究证明,只有进入到细胞内部,海藻糖在冻干时才能对胞内蛋白和细胞膜起到有效的保护
37、作用。聚乙烯吡咯酮(polyvinylpyrrolidone,PVP是一种多聚体,它对生物体或生物大分子具有非特异性保护作用;同时它也是一种非渗透性保护剂,在细胞冻干保存中常与糖类一起,主要通过与糖类间的氢键作用和改变糖类的玻璃化温度发挥作用,不同浓度和不同分子量的PVP的作用不一样。大分子量的PVP能够更有效地抑制蔗糖的结晶作用,通过稳定糖类的玻璃化结构,这些多聚物还可以提高共同冻干的蛋白和肽类的稳定性。增加PVP的浓度和分子量也可以增加非结晶型糖类的物理稳定性。盐类在冻干中的作用溶液在结冰时,其中的溶质浓度必然会慢慢增大,盐类
38、产生的电解质离子可明显降低其Tg值,比如在10%的葡聚糖、PVP、乳糖和蔗糖的溶液中加入2%的NaCl可使Tg值下降1418。磷酸钠对Tg值的影响较小,但是当将10%的PVP溶液中加入1%的磷酸钠可以引起在低温热能曲线中的第2个玻璃化,暗示了在冻干液中的相分离。电解质诱导Tg值变化的最可能的机制是它可以增加冻干液中非冰冻水的含量,而这非冰冻水起到了增塑剂的作用,并且降低了Tg值。有些盐类会分离蛋白和PVP联合,在冰晶中把它们分成蛋白富集区和PVP富集相,这一结果强调了在冻干保护液中减少盐加入量的重要性。
39、为了获得在冻干前后形态一致和功能稳定的细胞,很多糖类或多聚物经常被用做溶液冻融和冻干过程中非特定蛋白质和膜的稳定剂,它们既是有效的低温保护剂,又是很好的冻干保护剂,它们对冻结的影响取决于种类和浓度。但是细胞种类很多,所含蛋白也不尽相同,而且物理化学性质各异,因此不同的细胞需要不同的保护剂。在选择冻干保护剂的配方时,必须进行大量严格的试验,这对任何一种细胞冻干工艺的探索都是一项极为重要的工作。五冻干制剂稳定性研究我们这里只对多肽类和蛋白质的制剂的稳定性探究,多肽类药物冻干制剂在生产和贮存过程中,经常会出现药物失活现象,有时在其制剂
41、大。一般认为其含水量越低,则Tg就越高,该制剂越能长期稳定地储存,但并不是剩余含水量越低越好。研究表明不同结构的多肽及蛋白质类药物的冻干制剂对于剩余含水量的需求是不一样的。就某一种多肽或蛋白质类而言,剩余含水量过高过低都不利于其稳定。追究其原因,可能是每种多肽类或蛋白质类药物都含有适合于一定剩余水分来稳定的基团,剩余含水量较低或过度的干燥可使多肽分子的这些基团(如极性基团或分子表面的氢键变化而导致变性;过多的水分可使多肽及蛋白质类药物发生氧化变质的几率增多而导致变性。因此,控制适宜于多肽及蛋白质类药物的剩余含水量,这既能满足冻干制剂在
42、保存期稳定的要求,又避免在生产中因过度干燥而引起能源浪费。为了提高药品的稳定性,必须对药品在冻干过程中的损伤和保护机制进行进一步的研究,优化冻干工艺。预冻过程中一般认为主要是由机械效应和溶质效应引起。邬霞等研究了冷冻保护剂能避免超低温冷冻过程中的溶质效应。干燥阶段,应该在保证药物活性的条件下,选择能允许的最高温度进行第2阶段再干燥。在该过程中,为了将干燥应力的破坏作用降至最低需要加入干燥保护剂,包括保持玻璃化的干燥剂,以保证多肽分子表面的单层水分子不受到破坏。干燥好的制剂出箱后要及时密封,否则与空气接触后容易吸潮、产生萎缩等现象。因此
43、,干燥好的制剂在出箱前必须注意干燥箱温度要高于环境温度;需充入高纯氮气进行保护;并尽快进行密封处理。随着冷冻干燥机的不断改进,目前多采用箱内真空密封或充氮气密封。冻干保护剂及其保护机制:从上述生产工艺过程中笔者得知,冷冻干燥是一个复杂的过程,其过程中产生冻结应力(包括枝状冰晶的形成,离子浓度的增加,pH值的改变和相分离等和干燥应力(主要是指移去多肽分子表面单层水分子等都会使多肽及蛋白质类药物变性。为了防止药物变性,通常都在其制剂配方中都添加了不同的保护剂,加入的这些保护剂一般应具有吸水性差、玻璃转变温度高、结晶率低和不含还原性基团
44、等特性。常用的保护剂见表2。通常认为,无定型甘露醇具有使多肽及蛋白质类药物稳定的作用,而结晶态的甘露醇则没有稳定功能,如有文献报道,1%或更低浓度的甘露醇通过无定型结构的形成而阻止蛋白质药物的聚集,但是高浓度的甘露醇则易于形成结晶态而促进蛋白质药物的聚集。而与甘露醇或其它糖类相比,海藻糖的玻璃转化温度更高、引湿性和还原性更低,具有更广阔的应用前景。氨基酸也是常见的蛋白质保护剂之一,在冷冻过程中,低浓度的甘氨酸可通过抑制磷酸缓冲盐结晶所致pH值的改变而阻止蛋白质药物变性。贮存温度可能是影响冻干药品稳定性的最重要因素之一。冻干药品贮存过
45、程中,温度必须低于其Tg,如环境温度超过冻干制剂的Tg,药品的玻璃化状态被破坏,分子运动加快,无定形成分结晶增加,会出现塌陷、表面萎缩、结块、变硬、变色等,同时制剂的多孔网状结构被破坏,复水能力减弱。但有时贮存温度不稳定比单纯高温对药物活性影响更大。残留水分是又一重要因素。总的来说,冻于品越干燥,含水量越低,其Tg就越高,越容易长期稳定地保存,但过度的干燥会使某些药品表面的氢键或极性基团因暴露而变性。干燥后的药品必须封口保存,以防止污染及回潮。不同药品对封口的要求也不一致,一般对活的微生物、毒株、菌种要求真空封口
49、差,在冻干曲线上体现的是缩小隔板温度曲线和样品温度曲线之间的温度线差异。要控制样品温度和隔板温度的温差小于20,既缩短了冻干周期,也解决了破瓶和脱底现象。当然破瓶也和瓶子质量还有冻干机性能有关。5产品上升与真空度有关,升华过程中,泵组真空度很大时,突然大开大蝶阀,箱内真空度会大幅上升,从而导致产品上升,在操作过程中先慢慢打开大蝶阀,再开罗茨泵。6分层在升华过程中,停机10min以上或干燥箱漏气会导致分层,产品进箱时减检查密封条有没有老化，在四周涂上真空脂。停电或断电后应立即关闭真空阀碟，让产品处于真空状态。7产品外观产品外观良好表现在颜色均匀、孔隙
54、为宜，最佳浓度在10%15%。若浓度低于4%，可适当添加赋形剂(如甘露醇、右旋糖酐、乳糖等。若浓度较高时，则必须控制冻干制品厚度，或降低浓度，改用大的容器灌装药液。冻干过程中降温速度应控制在每小时降低56。在一期升华干燥阶段，制品温度应低于共熔点，升温不宜快，控制在每小时5左右。如果加热过快，在制品有大量水分时，温度超过其共熔点，就会导致制品溶化，外观出现缺陷。在二期升华阶段，虽然此时制品中含水量已较低，升温速度可以适当提高，但要将温度控制在安全温度以下，否则会有结块。另外，制品包装的气密性不好，在有效期内也会出现外观不合格甚至内在质量不合格。8水分（含水率）含水率在上面水分控制中提到，这里就不再说明。9其他问题有时我们的产品在冻后还会发生回溶、澄明度不好、生物物质失活、含量不均匀或偏低、复溶不溶性微粒不合格等。复溶不溶性微粒不合格有丁基胶塞有静电吸附作用，清洗未能清洗表面颗粒；或压塞产生微粒等，要选择光滑的胶塞，减轻静电吸附作用。七冻干制剂的冻干周期缩短有调查中提到目前国内冻干制剂的冻干周期较长,影响产品的产量和经济效益。国产冻干机的运行,一