导语：如何才能写好一篇基因检测，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
社会热词
那么，基因检测到底是怎么回事儿？真的可以准确预测未来疾病，甚至可以预知孩子的天赋以及未来的发展吗？基因检测与商业盈利混同在一起会不会有什么问题？
来龙去脉
那还是2006年，科学家绘制出人体所有23对染色体的完整基因序列图谱以后，一些颇具市场眼光的企业开始进入这个潜力巨大的市场，向顾客提供有偿基因检测。
如今，基因检测似乎成为一种“高大上”的新鲜事物。在某些发达国家，检测基因、指导疾病预防比较火；而国内也在悄然升温，有人把它称作“科学算命”。据了解，目前国内“三甲医院”和有的民办体检中心争相开展基因检测项目，基因检测也成为各体检中心招揽客源的一大噱头。据说目前有一千多种疾病可以通过基因技术做出预测和诊断。
除了实体健康机构有这个检测项目以外，互联网上有诸多基因检测中心也做起了“基因检测”的生意，要求在网上检测基因的人也是络绎不绝。许多人之所以选择通过网上进行基因检测，是这样更便捷、更具私密性。操作的流程是：上网选定基因检测单位的网站，打开网页，根据自己需要选择检测项目；选定项目以后，基因检测中心将通过快递方式将采样包交转购买人。购买人采样后，将采样包寄回，基因检测中心组织检测并出具检测报告，并给予个体化健康干预建议。
商业动作大
没有人否认基因检测的价值，它可以运用到新生儿检测、遗传病携带者的检测、孕期基因检测、法医基因检测。但是，上面提到的这些，都属于预测性检测。预测性检测多半仍停留在学术研究阶段。在基因检测的发展过程中，很多商家比科学家先行了一步，他们盯住了社会上的特殊群体：老人、儿童、慢性病患者以及潜在的癌症患者。
预测患癌几率是目前基因检测的最大市场，也是国人最认可的项目。但是，癌症的发病是多种因素引起的，大多数医生都认为癌症是一种生活方式疾病，与遗传因素关系不大。以乳腺癌为例，大概只有10%的乳腺癌可以确切证明由遗传因素导致。在已知的癌症中，也只有5%至10%的癌症是由遗传基因引起的；这5%至10%的癌症，预防性的基因检测能告诉我们的也不多。况且，有了某种基因变异，也并不意味着一定会罹患癌症。
有专家指出，各种所谓针对儿童的“天赋基因”检测有两个最大的漏洞，其一是故意混淆了统计学上的“关联关系”与“因果关系”，有关联不等于就是因果，检测者把关联说成了因果；其二是避而不谈后天环境对人的重大影响。专家告诫，目前所有给孩子做的天赋基因检测都是骗人的。
隐忧不少
目前，国内的基因测序仪都是从国外引进的，由于基因测序仪产地不同，在使用方法和检测标准上也各不相同。就是说，两家基因检测公司的仪器不同，得出的结论也会有差异，一般人无从辨别查证。
基因检测行业在使用试剂、应用范围等方面也混乱无章。不少基因检测公司使用诱惑性语言进行的宣传也明显言过其实。
在收费方面，基因检测项目没有收费标准，也没有纳入临床检测范畴，价格随意性很大。
基因检测是新兴的高精尖技术，对从业人员素质要求应该相当高。但现实状况是很多刚从医学院校毕业的、不能进入医疗机构从事临床医疗的人在操作检测。由于检测过程不规范，往往导致检测结果也不那么准确。
为了预测孩子的天赋，中国很早就开始在新生儿周岁时举行“抓周”，以孩子选择抓起书、笔、纸还是钱，预测他们未来会成为文人或商贾。这种带着娱乐性质的活动寄托了家长的美好期待，如今几乎不会有人当真。然而，有基因检测机构严肃地告诉你，其天赋基因检测能立刻获知孩子具备何种潜质，未来你只管好好培养，一切皆有可能……
“一口唾液就能预测天赋”
英国《每日电讯》近日的报道开头提到，一位中国家长忽然让孩子放弃围棋课程，转而学习击剑，原因是根据“天赋基因报告”，她的小孩运动天赋突出，而静态思考分析并非强项。另一位范姓母亲接受《每日电讯》采访时表示，她的两个孩子均被检出具有极高的绘画天赋，她准备为他们报名艺术课程。
记者发现，其中绝大部分公司的检测方法十分简单：只要在网上注册交费，然后用指定试剂收集孩子的唾液，邮寄到指定地址，过几天便能以App收到孩子的“天赋检测报告”。
一家提供天赋基因检测产品的公司创始人告诉《每日电讯》，这种检测项目已经过市场多年的历练，不算新兴产品，它以检测者的血液或口腔粘膜细胞提取、扩增其基因信息后，“通过基因芯片技术或超高通量单核苷酸多态性分型技术，对用户DNA信息进行检测，分析其中包括的疾病风险、用药安全、营养代谢、天赋潜能等信息”。
这位公司创始人分析说，中国家长普遍存在这种焦虑感，他们害怕为孩子作出的选择不够好，导致其他机会溜走，不仅浪费了钱，还会毁掉孩子的自信。基因检测恰到好处地给这些家长打了一针“强心剂”。
不过，他强调检测结果只是参考，“小孩子被检测出具有某方面的优势基因，不代表他一定能成为这方面的顶尖分子，对于一个人的发展，天赋起很大作用，后天培养同样重要”。
专家：不要草率决定孩子的未来
“通过基因去分析人体潜能和性格特征，理论上是有可能的，但缺乏足够的科学论证。”浙江大学遗传与基因组医学研究中心主任祁鸣曾向国内媒体表达过对天赋基因检测的专业认识。
借助于纷繁多样的新方法，下一代基因测序技术将肩负起在平行序列测定大量DNA的快速数据生成能力。部分下一代基因测序技术适用于筛检出人群是否存在某些特定遗传性癌症高危险，实际例子是Myriad遗传性癌症风险测试。不止于此，它还可被用于明确癌症患者的基因变异特征，进而尽早从癌症靶向治疗的非适应证用药的新希望中受益。
尽管下一代基因测序技术有助于实现个体化医学的目标，尤其对推动肿瘤学发展大有裨益，但不得不承认，标准化仍旧是当前亟需破解的瓶颈桎梏。伴随而至的是医疗保险覆盖欠均衡，最终命运尚未可知。
为尽早填平这一沟壑，8月17日，美国医疗技术政策中心（CMTP）针对以下一代基因测序为基础的临床肿瘤基因检测，正式出台初步医疗政策和医保覆盖指南。
“面对不断涌现的基因检测新工具，与之相适应的可供预测的医保覆盖和支付政策缺位，必然阻遏肿瘤医疗服务行业快速发展。”在新闻会上，CMTP首席执行官、美国医疗保险和医疗补助服务中心（CMS）前首席医疗官SeanTunis如是说。“就建立在下一代基因测序基础上靶基因板的医保覆盖事宜达成一致，无异于向出台与临床基因组学相匹配的更具全面性和前瞻性的医疗政策迈出具有里程碑式意义的第一步。”
对于单次测序，下一代基因测序不仅可实现大基因组区域、高基因通量和（或）可观样本数检测，而且较传统技术更显有效性、成本效益比和敏感性优势。不无遗憾的是，迄今基因测序板所提供基因变异信息的确切临床价值并未尽知，暂无力改变现有临床干预决策成为不争的事实。
人们有关下一代基因测序临床应用标准化的探讨顺而转向全力填补特定临床疾病的个体变异或基因突变的证据空白，而非直接解决大量涉及如何评估以下一代基因测序为基础，能同时分析多种不同基因变异技术的临床获益和风险。
[关键词]金黄色葡萄球菌;中毒休克综合征毒素-1基因;杀白细胞毒素基因
DevelopmentofmultiplexPCRforthedetectionofantibiotic-resistantgeneandpathogenicgenesinstaphylococcusaureus
WANGFengling,LIUGuohua,HOUYingrong
(LaboratoryDepartmentofCangzhouTraditionalChineseMedicineandWesternHospital,HebeiProvince,Cangzhou061001,China)
[Abstract]Objective:Tostudythefeaturesofstaphylococcaltoxicshocksyndrometoxin(TSST-1),PVLandantibioticresistantgenecarriedbystaphylococcusaureus.Methods:ThedetectionofPVLgene,mecAgeneandTSST-1genewerecarriedoutbymultiplexPCR.Results:84strainsofstaphylococcusaureusweredetectedmecAgenewithmultiplexPCR,andthedetectionratewas58.3%(49/84).TheisolationrateofPVL-positivestrainwas23.8%(20/84)inS.aureusisolates.MRSAofPVL-positivehad13strains(13/49,26.5%),MSSAofPVL-positivehad7strains(7/35,20.0%),theyshowednostatisticaldifference(P>0.05).TheprevalenceofTSST-1genewasnotdetected.Conclusion:Theantibioticresistanceofstaphylococcusaureusisincreasing.Staphylococcusaureusmaysecretevarioustoxins.Weshouldpayattentiontodetectingthesetoxinswhenseparatingstaphylococcusaureus.
[Keywords]Staphylococcusaureus;Toxicshocksyndrometoxin-1gene;Panton-valentineleukocidingene
感染性疾病是全球最常见的疾病,金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)是引起化脓性感染的主要病原菌。随着抗菌药物的广泛应用,金葡菌的耐药性逐渐增加,其中耐甲氧西林金葡萄菌(MRSA)的检出尤为明显。MRSA的耐药机制主要是它获得了含有mecA耐药基因的可移动遗传元件,即SCCmec盒。金葡菌能产生和分泌多种毒素[如杀白细胞毒素(PVL)、中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)、葡萄球菌肠毒素及表皮剥脱性毒素等],这些毒素已被证明与食物中毒、中毒性休克、皮肤烫伤样综合征及作为超抗原功能有关[1]。因此,非常有必要对金葡菌进行耐药基因及致病毒素基因的检测,防止此类细菌的播散。我科对我院临床分离的金黄色葡萄球菌耐药基因及致病毒素基因PVL基因和TSST-1基因进行检测,并对其所引起的感染进行分析。
1材料与方法
1.2细菌鉴定质控菌株
金葡菌ATCC25923,购于卫生部临床检验中心。
1.3仪器与试剂
WalkAway-40全自动微生物分析仪(美国DADE-BERING公司产品),PCR仪(美国Eppendorf公司产品),测序仪(美国ABI公司),凝胶成像仪(美国FOTODYNE),电泳仪(瑞典Phermacia公司)。PCR试剂购于上海生工生物工程有限公司。
1.4引物设计
根据GenBank中已的基因序列,利用PrimerPremier5.0软件及参考文献[2]设计mecA基因、TSST-1基因、PVL基因引物,扩增产物预期长度分别为892bp、578bp和578bp,由上海生工生物工程有限公司合成。
mecA:P15'-GCCGTAGTTGTCGGGTTTGG-3',P25'-GGCGGATGTGCGATTGTATTGC-3'。
PVL:P15'-GTGATGGCGCTGAGGTAGTC-3',P25',-GCTGGGGGTAATTCATTGTCTG-3'。
TSST-1:P15'-GCTATCGTAAGCCCTTTGTTGC-3',P25'-GCTGGATCCGTCATTCATTGTT-3'。
1.5细菌DNA的提取
将冰冻保存的84株实验菌株用胰酶大豆肉汤复苏、转种哥伦比亚羊血琼脂培养基。用接种环挑取24h培养的单个菌落,置于100μl裂解液(1mol/LNaOH+20g/LSDS)中,100℃水浴30min,冷却后用等量的1mol/L盐酸中和,离心10min(13000r/min)去沉淀,再用乙醇沉淀DNA(加入400μl无水乙醇),混匀后-20℃冰冻30min,13000r/min离心15min,弃上清。加入70%乙醇200μl,静置5min,13000r/min离心5min,吸干上清液,完全晾干沉淀后,用30μl双蒸水溶解DNA,作为PCR扩增模板。
1.6多重PCR扩增体系及反应条件
把3对引物放入同一反应体系建立多重PCR。PCR体系:采用20μl反应体系,模板1μl,起始引物和终末引物各1μl,dNTP1.5μl,Taq酶0.2μl,10×Buffer2μl,Mg2+2μl,双蒸水11.3μl。PCR反应条件:94℃预变性4min,然后进入循环,94℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸150s,共进行35个循环,最后72℃延伸15min,PCR产物在20g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳,然后在溴化乙锭溶液中染色20min,清水冲洗后用凝胶成像系统观察结果。
1.7序列测定
将PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序,结果与GenBank中的核苷酸序列进行同源性比较。
2结果
2.1多重PCR扩增产物的电泳分析
84株金葡菌中检出mecA基因阳性49株,检出率为58.3%;检出PVL基因20株,占临床分离株的23.8%,其中,MRSA为13株(13/49,26.5%),MSSA为7株(7/35,20.0%),差异无统计学意义(P>0.05);未检出TSST-1基因阳性菌株。部分菌株的PVL基因PCR扩增结果见图1。
图1PVL阳性菌株电泳结果
(1～6、9～11泳道为PVL基因阴性菌株;7、8泳道为PVL基因阳性菌株;M:PCRmarker)
2.2PVL基因阳性金葡菌的分布特点
PVL基因阳性的分离株中,有7株分离自脓液和创伤分泌物,5株分离自血液,5株分离自痰液,2株分离自腹腔引流物,1株分离自尿液。
2.3测序结果的分析
将测序结果与GenBank中的已有序列进行比较,同源性为100%。
3讨论
最近,国内学者报道葡萄球菌已是医院感染分离率最高的细菌,其中MRSA占较高的比例[3]。近年来,其临床分离率呈明显上升趋势,因具有多重耐药特征和携带多种毒力因子(如PVL、TSST-1、SEC等)已成为临床治疗的难点。笔者对我院金葡菌感染情况分析发现,我院MRSA感染占58.3%,MSSA占41.7%,明显高于马筱玲等[4]报道的MRSA检出率(42%),说明我院MRSA感染率较高,并且多为院内感染,应引起临床重视。MRSA的甲氧西林耐药决定簇(mecA)位于SCCmec盒上,该结构类似于转座子,可以介导mecA基因游离传播,使敏感的金葡菌获得甲氧西林耐药;同时SCCmec盒还可以整合许多其他耐药基因。因此,MRSA菌株常表现为多重耐药。MRSA的产生还与临床上抗生素的不合理应用有密切关系。
PVL是金葡菌产生的一种外毒素,该毒素特异性地吸附并作用于白细胞,改变白细胞的通透性,造成大量白细胞损伤,丧失吞噬能力。同时,由于白细胞的破坏,处理抗原和呈递抗原信息的能力下降,损害了机体的防御屏障和免疫应答,从而不能建立有效的特异性免疫。近年来由产PVL金葡菌所致感染而导致死亡病例逐渐增多,尤其是携带PVL基因的MRSA[5]。本研究结果显示,84株金葡菌中PVL基因阳性的检出率为23.8%,明显高于闫中强等[6]报道的PVL基因检出率(15.7%)。20株PVL阳性菌株中,7株分离自脓液和创伤分泌物,5株分离直血液,5株分离自痰液,2株分离自腹腔引流物,1株分离自尿液,说明不同临床标本中都可能检出PVL阳性的金葡菌,PVL阳性的金葡菌主要造成化脓性感染、肺部感染、血液感染及尿路感染。PVL基因阳性菌株在MRSA中的分离率高于MSSA,PVL基因阳性的MRSA具有多重耐药性且携带PVL,其毒性强,有一定的致死性,将会给患者带来严重的后果。
TSST-1是金葡菌产生的一种产热毒素,作为超抗原,TSST-1与MHC-Ⅱ类分子结合,作用于T细胞受体,使其大量增殖,并产生白细胞介素-1、白细胞介素-2及干扰素等多种细胞因子,是引起中毒性休克的主要原因[7]。本研究对84株金葡菌进行检测,未检出TSST-1基因,可能与感染类型不同、其金葡菌携带的毒素基因不同有关。
[参考文献]
[1]BeckerK,FriedrichAW,LubritzG,etal.Prevalenceofgenesencodingpyrogenictoxinsuperantignesandexfoliativetoxinsamongstrainsofstaphylococcosaureusisolatedfrombloodandnasalsoecinens[J].JClinMicrobiol,2003,41(4):1434-1439.
[2]YamasakiO,KanekoJ,MorizaneS,etal.Theassociationbetweenstaphylococcosaureusstrainscarryingpanton-valentineleukocidingenesandthedevelopmentofdeepseatedfollicularinfection[J].ClinInfectDis,2005,40(3):381-385.
[3]姚春艳,府伟灵.葡萄球菌医院感染的耐药性分析[J].中华医院感染学杂志,2004,14(1):104-106.
[4]马筱玲,孙光明,戴媛媛,等.金黄色葡萄球菌耐药性监测[J].临床输血与检验杂志,2007,9(1):18-20.
[5]Lopez-AguilarC,Perez-RothE,MorenoA,etal.Associationbetweenthepresenceofthepanton-valentineleukocidin-encodinggeneandalowerrateofsurvivalamonghospitalpulmonarypatientswithstaphylococcaldisease[J].JClinMicrobiol,2007,45(1):274-276.
[6]闫中强,沈定霞,罗燕萍,等.多重PCR检测临床分离金黄色葡萄球菌Luks/PV基因和mecA基因[J].中国感染与化疗杂志,2008,8(4):255-259.
目前应用最广泛的基因检测是新生儿遗传性疾病的检测、遗传疾病的诊断和某些常见病的辅助诊断。疾病诊断是用基因检测技术检测引起遗传性疾病的突变基因。近年来令人非常兴奋的是预测性基因检测的开展。利用基因检测技术在疾病发生前就发现疾病发生的风险，提早预防或采取有效的干预措施。目前已经有多种疾病可以用基因检测的方法进行预测。基因检测是通过血液、其他体液或细胞对DNA进行检测的技术。可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。在进行基因检测的过程，保证基因结果的准确性的诸多因素中，采样的正确是一个重要的环节。今年在我院进行基因检测预测疾病风险的人有60例，过程顺利，并取得良好效果，现报道如下：
1资料与方法：
在我院通过基因检测预测疾病风险的人有60例，其中男26例，女34例，年龄27-65岁。而这部分人群中，普遍对自己的身体状况比较重视，且有肿瘤或心脑疾病家族病史。检测时，工作人员用特制的采样棒在被检者的口腔内两颊部轻轻刮取口腔黏膜的脱落细胞（或留取被检者的唾液），放入固定液中送检。实验室对被测者细胞中的DNA分子的基因信息进行检测。
2结果：
在我院检测的60例检测者中，59例取样一次成功，只有一例因取样因细胞不够而需重新取样。
3讨论：
3.1工作人员地操作正确与否，直接影响检查地结果：抱着对被检者认真负责的态度，检查者必须强调让被检者在取样前半个小时内不吃东西，如半小时内进食过的人必须用白开水轻轻漱口后再进行取样检测；取样时工作人员带上口包，手套；刮取口腔黏膜的脱落细胞时，动作不能过猛，但又不能太轻，过猛会刮破口轻粘膜，太轻又没取到足够的脱落细胞。刮取的标本应存放在阴凉干燥的地方，固定液的瓶盖盖严实，并及时送检。
3.2基因检测可预测身体患病的风险，从而有针对性地预防和改善自己的生活环境和生活习惯，避免重大疾病的发生。
3.4基因检测为健康管理带来新思路
3.4.1基因检测为我们确定疾病风险提供了新的思路；随着基因医学研究的不断深入，基因检测在疾病风险预测与评估方面发挥了越来越重要的作用。在疾病发生前，通过对疾病易感基因进行检测，从而对可能引起疾病的遗传因素进行识别、评估，找到疾病发生的风险因素，应用于个体化的预防医学，包括饮食、运动、生活方式和药物影响，从而使人最大程度地保持健康。
【关键词】转基因大豆成分PCRSDS-PAGE基因芯片酶联免疫吸附分析技术
我国为大豆的原产国也是大豆的主产国之一，但是近年来，国外的转基因大豆大量涌入中国，中国国产大豆失去了价格优势，很多企业选择低成本的转基因大豆作为原料。中国是个饮食文化上很依赖大豆的国家，各种大豆制品充斥着我们的餐桌，但是由于转基因大豆可能存在安全性问题，很多消费者选择不食用转基因食品，但是有调查显示我国存在很多大豆制品中是使用转基因大豆制作的，但是都没有进行标示，所以在食品安全监测方面，亟待一种有效的检测产品中是否含有转基因成分的手段。本文列出几种大豆制品的转基因成分的检测方法，并对其优缺点进行了综述。
1PCR法
1.1PCR（polymeraseChainReaction）
1.2巢式（nestedPCR）和半巢式PCR
在食品检验领域，很多时候我们要面对的是大豆制品，其中的DNA被破坏，可供我们利用的有效的模板少，所以利用普通PCR无法检测出是否含有转基因大豆成分。巢式PCR是设计2对引物，其中1对引物在另1对引物扩增产物的片段上，通过2次PCR反应对某个基因进行检测。通常第1次采用能扩增较大片段的引物，经过20～30次循环扩增后，将第1次扩增的产物作为模板进行第2次扩增。半巢式PCR的原理与巢式PCR基本相同，只是半巢式PCR只有1对半引物，有1个引物被用于2次PCR反应中。这2种方法不但可以减少假阳性的出现，而且可以使检测的下限下降几个数量级。从理论上来说，用巢式和半巢式PCR可以检测到低于10-11g/μL的DNA模板量。
2基因芯片
基因芯片是采用光导原位合成或显微印刷等方法，将大量DNA探针片段有序地固化于支持物的表面，然后与已标记的生物样品中DNA分子杂交，再对杂交信号进行检测分析，就可得出该样品的遗传信息。一次可以检验大量样品，但是造价较高，还有待开发。
3酶联免疫吸附技术
酶联免疫吸附分析是指：应用一个酶标记的免疫反应物和一个免疫吸附剂的酶免疫分析，通过不同的方法，可用于测定未知样品的浓度。Lipp等人在2000年建立测试和验证了基于ELISA的抗草甘膦转基因大豆的特异性检测方法，这个方法利用CP4-EPSPS（5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶）蛋白特异性抗体，初步研究表明，此方法可以检测大豆原料中的转基因成分含量范围在0.3%-5%之间。
4蛋白质SDS-PAGE电泳
研究表明：利用SDS-PAGE蛋白电泳，发现转基因大豆中有一条分子量约为45ku的蛋白带的表达量明显比非转基因大豆强，这样可以在蛋白检测中，从表达量的大小来区分转基因大豆与非转基因大豆，但是，这个实验中，由于无法引进转基因大豆对应的原始非转基因大豆品种，只能与中国的大豆进行比对，所以结果仅作参考，但是这为转基因大豆的检测提供了一个新思路。
5结语
转基因大豆的检测方法多种多种，各有其优点和缺点，在实际的检测工作中，要根据具体情况，选择一种行之有效的方法。
参考文献：
【关键词】人性化护理；ICU；应用
[Keywords]MCV；MCH；HemoglobinElectrophoresis；Mediterraneananemiagene
地中海贫血，又称海洋性贫血，亦称珠蛋白生成障碍性贫血。它是一组常染色体遗传性疾病，其发病机理是珠蛋白基因缺陷而导致一种或几种珠蛋白合成障碍，造成血红蛋白中的α类和β类珠蛋白比例失衡，以致引起慢性溶血性贫血。临床症状轻重不一，轻型地中海贫血一航无明显症状。对地贫的筛查诊断方法有多种，常用的有血液分析、血红蛋白电泳、红细胞脆性检测等，随着分子生物学技术的发展，地贫的基因诊断已被应用于临床。现对1354例在读小学生进行血液分析、血红蛋白电泳和地贫基因检测，分析地贫基因检测的重要性，报道如下：
1资料与方法
1.1受检对象：随机选取德宏州乡镇小学在读学生1354人。
1.2仪器与试剂
1.2.1仪器：杭州博日荧光定量PCR仪、日本东亚SysmexXT-1800i全自动血液学分析仪、美国CVP凝胶成像仪、韩国COMBI分子杂交箱、北京六一厂31B琼脂糖水平电泳仪
1.2.2试剂：亚能生物技术（深圳）有限公司提供α-地贫和β-地贫基因检测试剂盒
【关键词】分支杆菌;结核;药物耐受性;基因
链霉素(Sm)作为最主要的一线抗结核药物之一,但由于单纯化疗和不规律化疗,其耐药情况日益严重,对其耐药性的研究受到重视。[1]有报道认为结核分支杆菌耐链霉素的产生是由于其核糖体蛋白S12编码基因rpsL和16SrRNA的编码基因rrs的缺失和突变所导致[2]。本院采用采用PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术检测了55株肺结核患者痰标本临床分离株,并对25例结核患者痰标本直接进行rpsL基因、rrs基因突变检测,现将结果报告如下。
1.1材料23例敏感株和32例耐SM或含耐SM的临床分离株来自本所。25例耐SM或含耐SM的肺结核患者痰标本来自本院住院结核患者。按结核病诊断细菌学规程进行菌种鉴定及药敏实验证实为结核分支杆菌并对链霉素耐药。
1.2方法
1.2.1细菌DNA的制备[3]临床分离株DNA用常规酚/氯仿抽提法提取标本中DNA。
1.2.2PCR扩增采用25μl反应体系,4XdNTPs终浓度为0.2mmol/L,Bio-标记引物终浓度为0.2μmol/L,扩增程序为:94℃变性Imin,58℃退火1min,72℃延伸Imin,循环30次,最后72℃延伸10min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳。紫外检测出现267bp条带。
1.2.3杂交检测将点有探针的硝酸纤维素膜装入杂交袋中,加入杂交液放置水浴锅中进行预杂交:45℃×30min。将Bio-标记引物的PCR扩增阳性产物变性:95℃×l0min,取出迅速放入冰盒中,每毫升杂交液一般加l0μl变性的扩增产物,放置水浴锅中进行杂交:45℃×30min。洗膜:洗液1、45℃×3min,洗液2、45℃×3min。SA-AP:用1∶1000的稀释液(洗液Ⅰ)与膜在37℃作用30min。洗膜:洗液Ⅰ、45℃×3min,洗液Ⅱ、45℃×3min。显色:每毫升洗液I加入NBT6.6μl、BICP3.3μl混匀,将配好的显色液加入杂交袋中,闭光37℃显色5min,观察结果。
2.1PCR扩增,以结核分支杆菌H37RV为对照,23株药物敏感株、32株耐SM分离株rpsL、rrs基因扩增均为阳性;25例耐SM肺结核患者痰标本中rpsL基因18例扩增阳性、rrs基因14例扩增阳性(见表1)。
2.2应用寡核苷酸探针反相斑点杂交技术检测rpsL、rrs基因突变结果(见表1、2)。
表1
基因例数扩增阳性数基因突变数突变率(%)
rpsL基因2518950
rrs基因251417.2
表2
对55例临床分离株的检测结果(%)
分离株例数rpsL基因突变数rr基因突变数
敏感株231(4.3)0(0)
耐药株3221(65.6)4(12.5)
23株药物敏感株的rpsL、rrs基因突变率分别为4.3%、0。32株耐SM分离株中,21株rpsL基因发生突变,突变率为65.6%;4株rrs基因发生突变,突变率为12.5%。耐SM肺结核患者痰标本中,基因突变检测率分别为50.0%、7.2%。
PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交检测rpsL、rrs基因突变,23株药物敏感株的rpsL、rrs基因突变率分别为4.3%、0。32株耐SM分离株中,21株rpsL基因发生突变,突变率为65.6%;4株rrs基因发生突变,突变率为12.5%。由于有4.3%的敏感株也突变,说明某些耐药菌株的形成可能与rpsL、rrs突变无关。
笔者用PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术直接检测了25例耐SM肺结核患者痰标本,rpsL基因18例扩增阳性、rrs基因18例扩增阳性,其基因突变检测率分别为50.0%、7.2%。低于耐SM临床分离株。这可能是由于痰标本杂质多,同时痰标本的处理和靶DNA浓度对PCR扩增有直接影响。PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术以其简便、快速、灵敏并可以直接检测未经培养的痰标本中结核分支杆菌rpsL、rrs基因突变,为临床检测结核分支杆菌对链霉素耐药性提供了初步依据。
参考文献
[1]MarttukeGJ,SoiniH,VyhneueskiyB.Rapiddetectionofrifampin-resistant.mycobacteriumtrberoulosisbySequencingandlineprobeassay.ScandJInfectDis,1998,30(2):129-132.
[2]MorrisS,BaiGH,SuffysP,etal.Molecularmechanismofmultipledrugresistanceinclinicalisolatesofmycobacteriumtrberoulosis.JID,1995,171(4):954-957.
关键词：沙门氏菌；ICAN；invA基因
1.1菌株本次试验的菌株全部来自浙江省疾病预防控制中心微生物检验所，名称见表1。
1.2主要试剂和仪器PCR仪（eppendorfMastercyclerGradient）、离心机（eppendorfcentrifuge5417R）、DU800紫外/可见分光光度计、MiniRunGE-100型凝胶电泳仪、凝胶成像仪（BIO-RAD）、BcaBESTDNA聚合酶（TaKaRa）、TliRNaseHⅡ（TaKaRa）、Hepes（sigma-aldrich）、dNTPMixture（TaKaRa）。
1.3ICAN引物由上海生工生物技术委托IDT公司合成（引物序列见下表）
1.4菌培养、DNA模板的制备和DNA浓度纯度的测定
1.4.1细菌的培养从半固体培养基中挑取菌落接种于普通琼脂平板上37℃培养18h，再从平板上挑取典型单菌落，用LB肉汤培养液37℃培养过夜。
1.4.2DNA模板的制备用细菌基因组DNA小量纯化试剂盒（TaKaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKitVer.2.0）制备，其步骤为：
1.取1～4ml的过夜培养菌液，10000rpm离心2min，弃上清；
2.用150μl的SPBuffer（含RNaseA1）充分悬浮细菌沉淀；注：注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮
3.加入20μl的Lysozyme溶液，均匀混合后室温静置5min；
4.加入30μl的EDTABuffer，均匀混合后室温静置5min；
5.加入200μl的SolutionA，剧烈振荡后65℃保温10min；注：①若SolutionA出现沉淀，请于65℃加热溶解，待恢复至室温后使用；②65℃保温10min后，溶液将由乳浊液变成透明液。如果此时溶液没有变成透明，说明细菌没有裂解基因组DNA将不能释放；
6.加入400μl的SolutionB，剧烈振荡15s；注：若SolutionB出现沉淀，请于65℃加热溶解，待恢复至室温后使用；
7.加入650μl的SolutionC，上下颠倒均匀混合；
8.12000rpm离心1min；
9.先弃去上层有机相，然后将水相溶液（无色下层）移入预先置于1.5ml离心管上的FilterCup中，12000rpm离心1min；注：有机相（上层）请务必除尽，否则会阻碍DNA结合到DNA制备膜上；
10.弃FilterCup，在滤液中加入450μl的DBBuffer，混合均匀；
11.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上；
12.将上述操作11的混合液转移至SpinColumn中，12000rpm离心1min，弃滤液；
13.将500μl的RinseA加入至SpinColumn中，12000rpm离心1min，弃滤液；
14.将700μl的RinseB加入至SpinColumn中，12000rpm离心1min，弃滤液；注：请沿SpinColumn管壁四周加入RinseB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份；
15.重复操作步骤14；
16.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入60μl的灭菌蒸水或ElutionBuffer，室温静置1min；注：把水或ElutionBuffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率
17.12000rpm离心1min洗脱DNA。
1.4.3DNA浓度和纯度的测定其步骤为：
1.打开仪器DU800紫外/可见分光光度计后部（电源处）的开关，指示灯亮；
2.打开仪器辅助电脑，双击进入DU-800软件的主界面，此时仪器自检；
3.待检测完成后，点击"Continue"进入操作界面；
4.点击"UV"打开紫外灯，此过程中会显示"UVLAMPISWARMING"，从黄色的UV灯不闪动开始需预热20min左右，才能开始下一步操作；
5.向石英杯内加入对照样本（DNA提取中用到的无菌去离子水），放入池架中，点击软件中的"BLANK"按钮，设置一个空白对照（加样过程中枪头不能碰到样品槽透明面）；
6.取出石英杯，吸去对照样本，将样品（9月22日提取DNA样品）以1：3（50ul样品：150ul去离子水）比例充分混匀，加入石英杯并点击软件界面的"GO"按钮，读出OD值（A260，A280），记录结果；
7.打开杯盖，取出样品槽，吸除液体，并用无菌去离子水洗涤三遍（每测一个样品后都需进行此操作），放回杯盒中；
1.5ICAN扩增的方法和步骤ICAN反应体系参考HiroyukiMukai[8]，反应体积25μL，反应体系成分为：2mMIF3、2mMIB3、0.5UTLiRNaseHII、2.75UBcaBESTDNA聚合酶、32mMHepes-KOHbuffer（PH7.8）、0.5mMdNTPs、100mMKAc、4mMMg（Ac）2、0.11%BSA、1%DMSO、100ngDNA模板，不足25μL部分用无菌去离子水补足。离心（5000rpm，1min）混匀，63℃等温扩增1h。将阳性和阴性对照于1.5%琼脂糖凝胶电泳后在生物凝胶成像分析仪（BIO-RAD）下观察结果。
1.6使用PCR缓冲液进行invA基因的恒温扩增只用TakaraExTaqbuffer代替Hepes-KOHbuffer（PH7.8），其他的反应液组成及操作步骤都与ICAN扩增相同
2.1不同温度下鼠伤寒沙门菌的ICAN反应对ICAN反应温度的初步试验，得到反应温度为62.8℃时扩增效率较好（见图1）。
图1不同温度下84年鼠伤寒沙门菌的ICAN实验电泳结果图
注：1.59.6℃，2.61.1℃，3.62.8℃，4.64.7℃，5.68.5℃，6.70.1℃，7.72.2℃，8.阴性对照
2.2鼠伤寒沙门菌的ICAN反应
图2不同年份鼠伤寒沙门菌的ICAN实验电泳结果图
注：1.06年鼠伤寒沙门菌（N-06），2.84年鼠伤寒沙门菌（N-84），3.95年鼠伤寒沙门菌（N-95），4.阴性
2.3用TakaraExTaqbuffer代替的恒温扩增情况使用TakaraExTaqbuffer代替Hepes-KOHbuffer（PH7.8）时，对反应温度、Mg2+浓度、TLiRNaseHII浓度进行优化，得到反应条件为：扩增温度55℃、Mg2+浓度为100mM、TLiRNaseHII为0.5u时条带最亮。
图3沙门氏菌和其它肠杆菌科细菌恒温扩增实验电泳结果图（缓冲液用TakaraExTaqbuffer代替）
注：1.鼠伤寒沙门菌（N-84），2.鼠伤寒沙门菌（N-95），3.鼠伤寒沙门菌（N-06）4.鸭沙门菌（W-1），5.肠炎沙门菌（W-2），M.marker，6.阴性对照，7.耶尔森菌（W-3）8.阴沟肠杆菌（W-4）9.福氏志贺菌（W-5），10.奇异变形杆菌（W-6），11.大肠杆菌（W-7）
反应温度对扩增特异性的影响--使用PCR扩增时，可以通过调节退火温度得到最佳反应条件。因此，可以设想：扩增温度也是影响ICAN反应的一个重要因素。如图1所示：鼠伤寒沙门菌DNA在7个不同的温度下扩增，扩增产物通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳显像可见，当扩增温度为61.1℃或62.8℃时，在目的片段大小处有条带，扩增效果较好。因此，我们可以通过调节扩增温度对ICAN进行优化。
ICAN反应体系组成对扩增结果的影响--观察图2，不同的鼠伤寒沙门菌ICAN扩增后都在目的条带附近有连续的条带，但并不是三条清晰的条带。这个问题应该可以通过改变反应条件加以解决。但是我们在尝试了很多次之后，结果并不理想，当使用与2.2完全相同的实验条件做重复试验时，也没有重复出图2所示的结果。因此，我们猜想：首先，自己配制的缓冲液稳定性不够好，所以实验的重复性一直不好。另外，研究中用到的KAc、Mg（Ac）2也是自己配制的。最后，因为我们无法购得TLiRNaseH酶，所以就用TLiRNaseHII代替了。这两类酶在特性方面的差异可能也会影响实验结果。
用PCR缓冲液代替Hepes-KOHbuffer（PH7.8）做ICAN--由于前期实验结果一直不稳定，猜测是缓冲液不好的缘故。保持原实验条件不变，换用TakaraExTaqbuffer做ICAN，结果沙门菌都在稍大于8023bp处扩增出了单条片段，而阴性和其他肠杆菌科细菌都没有该片段，如图3。AbouHaidar[13]对Mg2+的催化特性进行研究，发现当温度高于55℃或PH值大于7.5时，Mg2+催化RNA水解的活性增强。我们对此反应的Mg2+浓度优化，得出当Mg2+浓度为100mM时效果较好。对反应的扩增温度和TLiRNaseHII优化，得到扩增温度55℃、TLiRNaseHII为0.5u时扩增效果较好。对沙门菌，如副伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸭沙门菌及肠炎沙门菌等，使用blast对IF3、IB3两条引物比对后，发现各菌都没有扩增出大于8000bp片段的可能性。因此我们猜想，实验得到的大于8023bp的片段是多条小片段叠加的结果，为了验证这种可能性，最好对这条片段测序。
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关键词：转基因食品检测技术应用发展
一、对转基因食品的认识
二、转基因食品的利与弊
1、转基因食品的好处
2、转基因食品的危害
有一些研究人员认为外来的基因会用一种人们现在还不是很了解的方式去破坏原食物中的一些营养成分。例如美国伦理与毒性中心的实验报告上面说，和一般的大豆相比，在耐除草剂的大豆中，异黄酮的成分减少了；同时大量的转基因生物步入大自然界后可能会和原野生物种进行杂交，从而造成基因污染，甚至影响到生物多样性的持续利用和保护，而且这种污染对生态系统和环境造成的危害是比其他任何一种因素造成的污染都难以消除；根据有关报道，有些科学家还研究发现，某些转基因生物产品有可能含有一些特定的有毒物质与过敏源，这会对人体的健康产生一些不利的影响，严重的话甚至有可能会致癌或者导致遗传疾病。尽管现在为止还没有一些有说服力的实验报告表明这些优良品种是有毒的，但是有一些研究人员认为，对于基因的添加和人工提炼，有可能在达到某些效果的同时，也集聚和增加了食物中的微量毒素。这种毒素的累积是个相当漫长的过程，但是它确实有可能正在进行中，所以现在谁也不能担保这些改良品种是没有毒的。
三、转基因食品的检测技术
因为转基因物质会在耕种、收割、加工与储存的过程中混入食品当中去，并且对食品造成一些偶然的污染。所以，不管是对转基因食品贴上标签，还是对非转基因原料与转基因原料分开运输，旧食品与新的转基因原料的检测是不可缺少的；除此之外，还要区分非转基因与转基因食品，要对转基因食品进行选择性的标记，并且对食物中转基因的含量的多少要加以限制，同时也需要有效准确的转基因检测技术。
1、蛋白质印迹法
蛋白质印迹法是将电泳的显色酶反应的灵敏性、抗体的特异性与较高的分离能力全部结合起来，这是检测比较复杂混合物中的特异蛋白质最有用的工具之一，且普遍是用于检测、分离某些特异的蛋白质，其灵敏度为1～5ng。而且它还可以确定一个样品中是否有超过或者低于限值水平的目的蛋白，比较适用于目的蛋白的定性检测，特别是用于那些不可溶蛋白质的检测。
2、外源蛋白质的检测
外源蛋白质的检测就是从蛋白质的水平上对那些转基因食品进行测定，在实际应用中大多数采用的是免疫学检测法。这种方法可以检测出有抗原性蛋白质类的存在，它的基本原理是通过抗体与抗原之间的一些特异反应来完成的。外源蛋白质检测法比较快速，且具有一定的灵敏度，并且也能进行半定量，不需要一些特殊的仪器，适用于现场删选与检验，但是外源蛋白质检测法还是有其局限性。
3、核酸水平检验法
这种方法主要包括两种：核酸印迹法和PCR检测法。核酸印迹法的具体操作就是将要被检测的样品的DNA固定于尼龙膜上面，然后再用被标记的核酸探针与之杂交，最后对标记探针进行检测来检验样品中到底是否含有某些转基因的DN段，但是这种方法的灵敏性比较低。PCR检测法主要是对一些目标进行扩增，然后采用某些方法对已扩增的产物进行检测。
4、Western杂交法
Western杂交是基因工程中检验外源基因有没有表达出蛋白质的一种权威方法，其将蛋白质的印迹、电泳和免疫测定融为了一体，所以具有很高的灵敏性。使用这种方法可从植物细胞总蛋白中检测出50ng左右的特异蛋白质。不过其操作较麻烦，且费用较高，不适合用于检疫机构大量样品的快速检测。这种杂交检测的关键在于抗体的制备。假如外源基因正常表达的时候，该植株细胞中就含有些许的目的蛋白。在植物细胞当中提取总蛋白质，然后将蛋白质样品溶于含有还原剂和去污剂的溶液中，经过电泳让蛋白质按分子的质量大小分离，最后把分离出的各个蛋白质条转移到固相膜上面，膜在较高浓度的蛋白溶液中温浴，达到封闭非特异性位点的效果。通过抗体和固相支持物上面的靶蛋白的抗体抗原特异性反应进行检测。
5、电化学发光技术
电化学发光指的是通过电化学方法生产一些特殊的东西，然后这些物质之间或者其它物质与电生物质之间更进一步反应所产生的一种发光现象。这是电化学方法和化学发光相互结合的产物。
6、凝胶电泳
凝胶电泳是一种最简单的检测方法。但是因为和靶序列的大小相近的其余DN段也有可能会被扩增出来，因此用凝胶电泳检验后的PCR产物最少还应该接受限制酶的切割检验。
7、其他检测方法
四、转基因食品的发展
那些关于转基因作物的争讨应该是一种非常正常的现象。首先是现在新开发的一些品种本身还不是很完善，人们表示担心还是有正当理由的。其次，不管怎样总会有一些意识比较保守的人对一些新科技产物不太习惯，甚至拒绝接受。再就是受贸易利益的影响，有些国家的利益集团和政府利用转基因食品不是很够完善而强打贸易战，让事情变得更加复杂了。不过科学的脚步是不会因此而停顿的，科学家们必会向人类奉献出更完满的转基因食物。