本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种以胶体金侧向层析技术为基础的双抗原夹心法制备的一种快速检测犬冠状病毒抗体的胶体金试纸卡。
背景技术：
技术实现要素：
本实用新型的目的是提供一种快速检测犬冠状病毒抗体的胶体金试纸卡，具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
为解决上述技术问题，本实用新型一种快速检测犬冠状病毒抗体的胶体金试纸卡，其特征在于所述试纸卡结构为：在塑料底板(1)一端粘贴样品垫(2)，样品垫的一端紧密压接含有标记抗犬冠状病毒（CCV）抗原的金标垫(3)，金标垫（3）的一端紧密压接含有标记鼠IgG抗体的金标垫(4)，金标垫（4）一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(5)，NC膜上包被有相互分离的检测线T(6)和质控线C(7)，NC膜的另一端连接吸水垫(8)形成试纸，试纸装入塑料卡壳内形成试纸卡。
所述试纸卡的胶体金标记抗原为犬冠状病毒抗原，与犬冠状病毒抗体特异性结合，检测线T包被抗原和金标抗原为相同结构的抗原，质控线C包被羊抗鼠IgG抗体。
所述试纸卡的样品垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸水垫由吸水滤纸构成。
所述试纸卡金标垫为两层玻璃纤维素膜构成，金标垫(3)平铺的为标记有鼠IgG抗体的胶体金，金标垫(4)平铺的为标记有犬冠状病毒抗原的胶体金。
所述试纸卡，金标抗原垫的制备过程为：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为20nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.1MK2CO3调至pH8.0左右，按100ml胶体金溶液加入0.4－1.5mg犬冠状病毒抗原，室温搅拌2小时，加入终浓度为10%牛血清白蛋白，封闭20min，12000r/m离心20分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至50ml，按1ml溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置干燥间，温度21-25℃，湿度小于30%，干燥2-5h，制成金标抗原垫。
所述试纸卡，金标鼠IgG垫的制备过程为：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为20nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.1MK2CO3调至pH8.0左右，按100ml胶体金溶液加入0.2－1mg鼠IgG抗体，室温搅拌2小时，加入终浓度为10%牛血清白蛋白，封闭20min，12000r/m离心20分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至50ml，按1ml溶液铺60cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置干燥间，温度21-25℃，湿度小于30%，干燥2-5h，制成金标鼠IgG垫。
所述试纸卡的装配过程为：在干燥室内，温度21-25℃，湿度小于40%，取塑料底板，将已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘贴，将胶体金垫裁切成合适的宽度，在NC膜T线一侧搭接金标抗原垫,搭金标抗原垫的1/5粘贴，在金标抗原垫另一侧搭接金标鼠IgG抗体垫，在金标鼠IgG抗体垫粘贴样品垫，搭金标垫的1/5粘贴；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10粘贴；最后用裁剪机将贴好的塑料板切成3－5mm宽的试纸条，再装入塑料卡壳内，形成试剂试纸卡。
所述试纸卡，检测方法为：1）将检测试剂及样本放置室温下，取出试纸卡，平放；2）用棉签取适量新鲜病犬粪便样本；3）在洁净的离心管中加入1ml样本稀释液（0.9%NaCl溶液），将棉签浸入样品稀释管，充分搅拌混匀后，静置；4）用移液枪吸取80μl上清液作为检测液样本加入到样本孔中，5-15分钟内判定结果。
附图说明
以上所述是对本实用新型技术方案的概述，为进一步解释本实用新型，以下结合附图与实施方式对本实用新型做进一步的详细说明。
图1本实用新型一种快速检测犬冠状病毒抗体的胶体金试纸卡的布置结构示意图。
附图符号说明：1：塑料底板；2：样品垫；3：金标抗原垫；4：金标鼠IgG垫；5：硝酸纤维素NC膜；6：检测线T；7：质控线C；8：吸水垫。
图2本实用新型一种快速检测犬冠状病毒抗体的胶体金试纸卡合体结构示意图。
具体实施方式
实施例：一种快速检测犬冠状病毒抗体的胶体金试纸卡制备及检测
1主要材料
1.2CCV标记抗原：美国Fitzgerald公司产品；CCV标准品：农科院；鼠IgG抗体、羊抗鼠IgG抗体：美国ICL公司产品；氯金酸：Sigma公司产品；硝酸纤维素（NC）膜：SARTORIUS（德国），CN140；德国赛多利斯公司产品；牛血清白蛋白（BSA），水解酪蛋白：Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。
2.1CCV抗原胶体金标记：氯金酸－柠檬酸三钠还原法制备直径为20nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0.1MK2CO3将溶液调到pH7.5、pH8.0和pH8.5。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液加入0.25mg、0.5mg、0.75mg将标记用CCV抗原缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再加入到终浓度为10%的BSA进行封闭20min，标记结束后以12000r/m离心，弃上清，沉淀按60%原体积复溶至不同配比的免疫金工作液中（pH8.0,含BSA，Tris，蔗糖和海藻糖）。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺20cm2的比例加样于已处理的玻璃纤维膜上，在温度21-25℃，相对湿度在＜30%的干燥间干燥2-5小时，制成金标抗原垫。
2.2鼠IgG抗体胶体金标记：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为20nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.1MK2CO3调至pH8.0左右，按100ml胶体金溶液加入0.2－1mg鼠IgG抗体，室温搅拌2小时，加入终浓度为10%牛血清白蛋白，封闭20min，12000r/m离心20分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至50ml，按1ml溶液铺60cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置干燥间，温度21-25℃，湿度小于30%，干燥2-5h，制成金标鼠IgG垫。
2.3NC膜划线处理：用0.01MpH7.4PBS将包被CCV抗原稀释成1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml，羊抗鼠IgG分别稀释成1mg/ml、2mg/ml，然后用喷金划膜仪在NC膜上按1.1μl/cm进行分别划线包被，包被完成后将NC膜在温度21-25℃，相对湿度在＜30%的干燥间干燥2-5小时。
2.4试纸卡组装：在干燥室内，温度21-25℃，湿度小于40%，取塑料底板，将已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘贴，将胶体金垫裁切成合适的宽度，在NC膜T线一侧搭接金标抗原垫,搭金标抗原垫的1/5粘贴，在金标抗原垫另一侧搭接金标鼠IgG垫，在金标鼠IgG垫粘贴样品垫，搭金标垫的1/5粘贴；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10粘贴；最后用裁剪机将贴好的塑料板切成3－5mm宽的试纸条，再装入塑料卡壳内，形成试剂试纸卡。
2.5试纸工艺参数调试：将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备小样，利用CTNI标准品对试剂进行测试，寻找最佳组合。
2.6检测方法：1）将检测试剂及样本放置室温下，取出试纸卡，平放；2）用棉签取适量新鲜病犬粪便样本；3）在洁净的离心管中加入1ml样本稀释液（0.9%NaCl溶液），将棉签浸入样品稀释管，充分搅拌混匀后，静置；4）用移液枪吸取80μl上清液作为检测液样本加入到样本孔中，5-15分钟内判定结果。
2.7样本检测分析：试剂制备完成后，按检测方法对所有临床样本进行检测，并分析检测结果。
3结果
3.2样本检测：对20份临床定值样本检测，区间判定结果和样本值的符合率为97.4%，一致性系数>0.93。检测结果表明制备的检测试剂盒性能良好，适合用于临床检测，从而提高病犬的诊断效率，给养犬业、毛皮动物养殖业带来更大的效益。