本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种弓形虫核酸快速检测引物组、试剂盒和检测方法。
背景技术：
弓形虫(toxoplasmagondii)呈全球性分布、几乎感染所有恒温脊椎动物的细胞内寄生原虫，导致严重的人兽共患病。全世界约有1/4的人口感染弓形虫，我国人群平均感染率为7.9％，犬、猫等宠物感染弓形虫也非常普遍，可造成动物流产或感染后不发病而成病原携带者，成为人类感染弓形虫病的重要传染源。对于免疫抑制患者、免疫功能受损及缺陷患者，弓形虫感染最常见的表征是先天感染中发生的脉络膜视网膜炎以及像晚期aids等免疫缺陷患者发生的脑炎。孕妇感染后，则会造成畸胎、死胎或引发婴儿先天性弓形虫病，危害较大。
据统计，1985-2006年期间，我国犬弓形虫感染率在0.66％-62.3％之间不等，猫弓形虫感染率在14.06％-78％，常形成局部暴发流行。严重影响畜牧业发展且威胁人类健康。
传统弓形虫检测方法主要有：直接涂片或组织切片法、组织培养法、动物实验法、酶联免疫吸附等。直接涂片或组织切片法虽然简单快速，但漏诊率高；组织培养和动物实验最真实可靠，但操作烦琐，耗时长，成本高；酶联免疫吸附法简便，快速，敏感性尚可，但由于个体免役系统的差异，有时指标不能真实反映虫体感染的情况，可能造成漏诊或误疹。
目前，已有少数针对弓形虫核酸的检测方法，主要包括pcr技术和实时荧光定量pcr技术，对弓形虫的检测灵敏度和特异性有了很大提升。但pcr技术和实时荧光定量pcr技术均涉及变温步骤，或较高温度，这需要提取dna的步骤，且需要配备价格高昂的pcr仪或实时荧光定量pcr仪，耗时较长、操作技术要求较高。目前分子诊断行业的发展趋势是实现简单、快速、准确、高灵敏度的检测。
中国专利cn201610867186.x，公开了一种弓形虫核酸的快速检测方法及其快速检测试剂盒，其所述检测方法需要另外进行核酸提取步骤，且检测步骤较为复杂，容易造成气溶胶污染，引入假阳性风险。
技术实现要素：
为达到上述目的，本发明的技术方案是：弓形虫核酸快速检测引物组，包括检测弓形虫基因组b1基因序列的上、下游引物和探针；
所述上游引物是：5’-ttgctgttctgtcctatcgc-3’；
所述下游引物是：5’-atgttgcattcttcagccgtct-3；
所述探针是：tcccatgaagtcgaccacctgtttcctc/i6-famdt//idsp//ibhq1dt/tcactgtca-c3spacer。其中：“i6-famdt”是6-fam(6-羧基荧光素)荧光标记的dt核苷酸，“idsp”指碱基缺失，“ibhq1dt”是带有bhq1淬灭基团标记的dt核苷酸，“c3spacer”指3’羟基封闭。
所述上、下游引物和探针可以是与权利要求1所述序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探针是与权利要求1所述序列碱基互补的序列。
本发明还提供弓形虫核酸快速检测试剂盒，所述试剂盒包括以下内容：
(1)裂解液；
(2)稀释液；
(3)含引物的冻干酶管；所述引物为检测弓形虫基因组b1基因序列的上、下游引物和探针；
所述探针是：tcccatgaagtcgaccacctgtttcctc/i6-famdt//idsp//ibhq1dt/tcactgtca-c3spacer；
(4)阳性对照品；
(5)阴性对照品。
其中，所述裂解液的成分如下：每500μl裂解液中含0.1-2m的kac100ul、0.1-2m的koh120ul、0.1-2mph8.0的tris-ac250ul、水30ul。
优选的，所述裂解液的成分如下：每500μl裂解液中含1.5-2m的kac100ul、0.5-1m的koh120ul、1-2mph8.0的tris-ac250ul、水30ul。
其中，所述稀释液的成分如下：每80ml稀释液中含0.1-2m的mgac21.12ml、0.1-2m的kac1.20ml、0.1-2mph8.0的tris-ac4.00ml、1％-50％的peg8k12.00ml、水61.68ml。
优选的，所述稀释液的成分如下：每80ml稀释液中含1-2m的mgac21.12ml、1-2m的kac1.20ml、1-2mph8.0的tris-ac4.00ml、40-50％的peg8k12.00ml、水61.68ml。
其中，所述含引物的冻干酶管的成分如下：每4ml冻干酶管中含有20-200ng/uldna解旋酶259μl、100～1000ng/ul单链dna结合蛋白178μl、10-100ng/uldna聚合酶75μl、1-10ng/ulatp再生蛋白75μl、1-30ng/uldna限制性内切酶200μl、1-30ng/ul辅助蛋白30μl、1-100μm上游引物2.5μl、1-100μm下游引物2.5μl、1-20μm探针15.5μl、0.1-2m磷酸肌酸钠115μl、10-100mmatp115μl、1-50mmdntp20μl、0.1-10mph8.0的tris-ac40ul、1-5％海藻糖8μl、kac0.02g。
优选的，所述含引物的冻干酶管的成分如下：每4ml冻干酶管中含有120-150ng/uldna解旋酶259μl、400-450ng/ul单链dna结合蛋白178μl、90-100ng/uldna聚合酶75μl、5-10ng/ulatp再生蛋白75μl、15-20ng/uldna限制性内切酶200μl、15-20ng/ul辅助蛋白30μl、100μm上游引物2.5μl、100μm下游引物2.5μl、10μm探针15.5μl、1m磷酸肌酸钠115μl、80-100mmatp115μl、25mmdntp20μl、1-2mph8.0的tris-ac40ul、2-5％海藻糖8μl、kac0.02g。
其中，所述阴性对照品为无rnase水空白对照。
其中，所述阳性对照品为含目的基因序列的质粒，浓度是1pg/μl。所述目的基因序列是指弓形虫基因组b1基因序列。
本发明还提供弓形虫核酸快速检测方法，所述弓形虫核酸快速检测方法采用权利要求3所述的弓形虫核酸快速检测试剂盒，所述弓形虫核酸快速检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的；所述弓形虫核酸快速检测方法包括以下步骤：
(1)取样本适量，加入到500μl裂解液中，充分搅拌混匀，室温放置2-3分钟；
(2)取上步得到的样品裂解液20μl，加入到稀释液中，颠倒混匀8-10次；
(3)取20μl上步得到的混合液加入含上、下游引物和探针的冻干酶管中，充分复融；
(5)结果分析：如果样本扫描荧光曲线为典型“s”型，则判断为阳性结果；反之，则为阴性结果。
本发明使用常温核酸扩增技术，通过dna解旋酶、单链dna结合蛋白、dna聚合酶等多个酶促反应，可在37-45℃恒温条件下，10-30分钟内使目的dna扩增数百万倍，配合荧光检测技术，可以实现对待检dna的快速检定。
本发明的引物组序列是这样得到的：从ncbi中下载弓形虫基因组(序列号af179871.1)的b1基因序列，通过oligo7软件设计引物，通过凝胶电泳筛选得到最适引物。筛选标准：引物灵敏度至少到质粒6(10-4ng/μl)、副反应尽量少。筛选好引物后，以上下游引物中间的序列设计一条探针，要求是二级结构少。
从而得到本发明所含引物对及探针：
上游引物是：5’-ttgctgttctgtcctatcgc-3’。
下游引物是：5’-atgttgcattcttcagccgtct-3。
所述探针是：tcccatgaagtcgaccacctgtttcctc/i6-famdt//idsp//ibhq1dt/tcactgtca-c3spacer。“i6-famdt”是6-fam(6-羧基荧光素)荧光标记的dt核苷酸，“idsp”指碱基缺失，“ibhq1dt”是带有bhq1淬灭基团标记的dt核苷酸，“c3spacer”指3’羟基封闭。
本发明不需要核酸提取步骤，而是利用裂解液一步释放弓形虫核酸，同时将粪便中抑制扩增反应的蛋白类物质变性。
本发明中的稀释液即为ema(enzymesmediatedamplification，多酶介导的核酸扩增技术，即常温扩增技术)扩增缓冲液，既可以缓冲裂解液的高ph值，又可直接用于ema扩增。
本发明的有益效果包括：
2、本试剂盒中反应体系经过冻干处理，可常温保存和运输，免去了低温保存、冷链运输的设备要求；
3、本发明中核酸扩增条件为37℃到45℃，对温度要求低，对设备要求低；
5、本发明中核酸扩增产物不进行开盖操作，降低了污染的风险。
本发明以弓形虫基因组的b1基因序列为目的基因，筛选最佳引物，并配合以最适浓度及配比的酶和各种试剂，形成最优的实验反应体系，使本发明试剂盒具有检测能力上的优势与特点，不仅检测简单易行，而且具有较高的准确度、精密度、特异性以及可重复性。
本发明在试剂盒中包括了核酸提取试剂，可以完成弓形虫dna快速提取；本发明试剂盒通过配方优化，将引物、探针、反应体系等预冻干为单管，减少了检验前的配液和保存的难度；在闭管反应中完成检验和结果判断，降低了检测过程的污染风险。
附图说明
图1是阴、阳性样本测试结果示意图。其中，①具有典型“s”型，为阳性结果，②为水平线，不具有典型“s”型特征，为阴性结果。
图2是交叉反应检测结果。其中，只有弓形虫阳性样本为典型“s”型曲线，为阳性结果，其他样本均为水平线，为阴性结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明，所选配方为试剂盒的优选配方，但并不用来限制本发明的范围。
弓形虫核酸快速检测引物组，包括检测弓形虫基因组b1基因序列的上、下游引物和探针；
所述探针是：tcccatgaagtcgaccacctgtttcctc/i6-famdt//idsp//ibhq1dt/tcactgtca-c3spacer。
优选的，裂解液、稀释液、冻干酶管具有如下的组分和浓度配比时具有更好的检测效果。
所述阴性对照品为无rnase水空白对照。
所述阳性对照品为含目的基因序列的质粒，浓度是1pg/μl。所述目的基因序列是指弓形虫基因组b1基因序列。
实施例1，弓形虫核酸的快速检测
采用弓形虫核酸快速检测试剂盒进行弓形虫的快速检测。所述弓形虫核酸快速检测试剂盒包括：
1、裂解液lysisbuffer500μl；
2、稀释液rehydratebuffer1.8ml；
稀释液每80ml含有：
3、含引物的冻干酶管4ml；
其中，引物对及探针的序列如下：
探针是：tcccatgaagtcgaccacctgtttcctc/i6-famdt//idsp//ibhq1dt/tcactgtca-c3spacer。
4、阴性对照品为无rnase水空白对照。
5、阳性对照品为含目的基因序列的质粒，浓度是1pg/μl，所述目的基因序列是指弓形虫基因组b1基因序列。
弓形虫核酸快速检测步骤如下：
(1)用棉签沾取犬猫的血、粪便、胸腹腔渗出液、脑脊液或房水适量，加到500μl裂解液中，充分搅拌混匀，室温放置2-3分钟；
(3)取20μl上步得到的混合液加入含引物的冻干酶管中，充分复融；
(5)结果分析：如果样本扫描荧光曲线为典型“s”型，则判断为阳性结果；反之，则为阴性结果
检测结果如图1，①具有典型“s”型，为阳性结果，②为水平线，不具有典型“s”型特征，为阴性结果。
实施例2，临床样本的检测：
采用弓形虫核酸快速检测试剂盒进行弓形虫的临床样本的快速检测。所述弓形虫核酸快速检测试剂盒包括：
1、裂解液lysisbuffer500ul；
(1)用棉签沾取疑似病例犬、猫粪便适量，加入到500μl裂解液中，充分搅拌混匀，室温放置2-3分钟；
结果检出弓形虫的阳性样本5例、阴性样本9例。
同时用两个市售品牌的pcr法检测试剂盒做为对比例，本发明与两个市售品牌的pcr法检测试剂盒检验一致率均为100％。证明本发明灵敏度与特异度与市售产品一致，但是本发明不必进行dna的提取，也不必进行pcr扩增，因此在耗时及成本上，本发明更具有优势，且本发明更适合于现场处置。
实施例3，交叉反应检测
用犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒1型、犬腺病毒2型、犬副流感病毒、犬钩端螺旋体、犬冠状病毒核酸，以弓形虫阳性样本为对照，进行特异性的检测，结果如图2所示，其中，只有弓形虫阳性样本为典型“s”型曲线，为阳性结果，其他样本均为水平线，为阴性结果。结果显示除弓形虫阳性样本外，其它样本结果均为阴性，证明本发明与其它宠物传染性疾病病原体核酸无交叉反应。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。