本标准适用于微生物发酵产单宁酶制剂酶活力检测
3.术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1酶活性单位定义
在30℃、pH值为5.0的条件下，每分钟降解没食子酸丙酯（PG）溶液解释放1μmol没食子酸所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。
4.原理
酶活力的测定采用保玉心的绕丹宁法，该法以没食子酸丙酯（PG）作为反应的底物，单宁酶分解PG产生的没食子酸可与绕丹宁在碱性条件下形成红色复合物，该复合物在520nm处有最大吸收，据此可通过测定A520的变化量来计算生成的没食子酸的量，从而计算酶活力。
5.试剂和材料
本标准中所有试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的二级水。
5.10.1mol/L的磷酸氢二钠：
准确称取十二水合磷酸氢二钠35.814g，加入800ml水溶解，溶解后定容至1000ml。
5.20.05mol/L的柠檬酸：
准确称取一水合柠檬酸10.507g，加入800ml水溶解，溶解后定容至1000ml。
5.1和5.2两者混匀，互调pH为5.0.
5.30.5mol/l的KOH溶液：
准确称取KOH28.055g，加入800ml水溶解，溶解后定容至1000ml。
5.40.667%（W/V）罗丹宁溶液（甲醇绕丹宁）：
准确称取罗丹宁0.667g，加入80ml甲醇溶解，溶解后用甲醇定容至100ml。
5.5没食子酸标准溶液，浓度为10mmol/l
称取没食子酸0.18813g，加磷酸-柠檬酸缓冲溶液溶解，定容至100ml。
5.6没食子酸丙酯（PG）溶液，浓度为10.0mmol/L
称取没食子酸丙酯0.2122g，再加入80ml缓冲液，磁力搅拌加热，直至完全溶解，冷却，调节pH至5.0，并用缓冲液定容至100ml。使用前适当摇匀，4℃冷藏保存。
6.仪器和设备
6.1实验室用样品粉碎机或碾钵。
6.2分析天平：感量0.001g。
6.3pH计：精确至0.01。
6.4离心机：最大离心加速度不小于2000g
6.5磁力搅拌器：附加热功能。
6.6涡旋混匀器
6.7恒温水浴锅：温度控制范围在30—60℃之间，精度为0.1℃。
6.8秒表：每小时误差不超过5s。
6.9分光光度计：能检测350—800nm的吸光度范围。
6.10移液器：精度为1μl。
6.11冰箱
7.测定步骤
7.1没食子酸标准曲线绘制
用pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸（0.1-0.05M）缓冲液配制不同浓度的没食子酸标准溶液，从40-240μmol/L配制9个不同浓度梯度。分别取0.5ml的没食子酸标准溶液与0.3ml甲醇绕丹宁（5.4）溶液（0.667%W/V）混合，加入到所有试管中，30℃水浴5min，然后将4.2ml（0.5M）的KOH溶液加入至所有试管中，30℃保温10min。以缓冲液代替标准溶液作空白对照，于520nm处测定吸光值（A520）。
以浓度（mmol/L）为横坐标，A520为纵坐标绘制标准曲线。
没食子酸浓度（mmol/L）0.040.060.080.10.120.140.160.20.24吸光值（OD）0.1160.1580.2210.2580.3290.3850.4370.5450.649标准曲线例如，Y=2.7162X+0.0027R2=0.9995
7.2试样溶液的制备
7.2.1固体产品
称取1g样品于三角瓶中，加入50mL缓冲液，磁力搅拌30min，4000rpm离心30min，取上清用缓冲液稀释至待测酶液中单宁酶活力0.029-0.05U/ml之间，吸光值范围为0.2-0.35。
7.2.2液体产品
液体样品可以直接用缓冲液稀释至待测酶液中单宁酶活力0.029-0.05U/ml之间，吸光值范围为0.2-0.35。
7.3测定步骤
（1）反应开始前，将10mMPG溶液和待测酶液于30℃水浴中保温5-10min；
蔚蓝生物集团研发中心文件编号:VLAND/YF-JC-YB-055（2）取4支洁净的试管，1支为空白管、3支测试管。向各管中加入0.25mlPG溶液，然后向测定管中分别加入0.25ml待测酶液，30℃水浴下反应5min；
（3）向所有试管中加入0.3ml甲醇绕丹宁（5.4）溶液（0.667%，W/V），保温5min；
（4）向所有试管中加入4.2mlKOH溶液（0.5M），向空白管中加入0.25ml酶液，在30℃条件下放置10min后，以空白管归零，于520nm处测定各管溶液吸光值。
9.试样酶活的计算
(△A520-C0)
XD=（*0.5*n）/0.25/t
K
式中：
XD—试样稀释液中单宁酶的活力，U/ml；
△A520—酶反应液的吸光度-酶空白样的吸光度；
K—标准曲线的斜率；
CO—标准曲线的截距；
1/0.25—换算成1ml酶液；
0.5—0.5ml酶液
n—试样的稀释倍数。
10.重复性
每个试样应取二份平行样进行分析测定，相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值。